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European alder (Alnus glutinosa [L.] Gaertn) nodules were maintained under conditions that allow their exudation (water stress). The effect of this nodular extracts colected on free nitrogen fixation (acetylene reduction assay [ARA]) and denitrification, was evaluated in three soils of significativelydifferent physico-chemicalcharacteristics. The comparisons with controls having different concentrations of glucose as carbon source suggest that, in the assayed conditions, the nodular european alder extracts activate ARA (up to 9.97% respect water control) and produces a partial inhibition of denitrification. The effects do not seem to be due neither to organic carbon nor to nitrate, but rather to specific activator(s) and inhibitor(s) of the processes considered. Nódulos radicales de aliso europeo [Alnusglutinosa (L.)Gaertn.] fueron mantenidos en condiciones que optimizan el proceso de exudación (estrés hídrico). Se evaluó el efecto de dichos extractos sobre la fijación libre de nitrógeno (ARA) y desnitrificación en tres suelos con diferencias significativas en sus características físico-químicas. Las comparaciones con diferentes controles, muestran que los extractos activan (en un 9.97%) el ARA y promueven una inhibición parcial de la desnitrificación. Los efectos no parecen causados por el aporte de carbono orgánico o de nitrato por parte de los exudados, sino por algún activador o inhibidor especifico de los procesos considerados.

Esta memoria se basa en la hipótesis del papel fundamental que el sistema microbiano asociado al sistema radical de las plantas tiene sobre el metabolismo vegetal y las consiguientes aplicaciones de los productos derivados del mismo. El sistema rizosférico microbiano, el microbioma rizosférico cumple un papel fundamental para que la planta consiga mejorar sus capacidades de adaptación a un ambiente cambiante. En el capítulo 2 se exponen de manera enlazadas hipótesis sucesivas que pretenden evidenciar el potencial de aplicación de las bacterias asociadas a la planta y los distintos enfoques de aplicación biotecnológicos. En primer lugar, se plantea el uso de la rizosfera como fuente de microorganismos especialmente adaptados a la interacción del sistema planta/microorganismos. Un sistema en el que la presión selectiva definida por la planta condiciona el tipo de microorganismos, su diversidad y en definitiva la estructura de las comunidades microbianas que se desarrollan en este ecosistema. Sobre la hipótesis de la capacidad de selección de microorganismos por la planta, primero se busca una planta que aporte una serie de factores de presiónselección. La planta se elige en base a criterios filogenéticos y metabólicos (metabolismo secundario muy activo). Nicotiana glauca, es una Solanacea, de la misma familia que especies con gran interés alimentario, como el tomate, Solanum lycopersicum, la patata, Solanum tuberosum o el pimiento, Capsicum annum. Se selecciona esta planta como sujeto de muestreo rizosférico, en busca de un microbioma cultivable y con aplicaciones por sus aportaciones beneficiosas en la interacción. A continuación, sobre las casi mil cepas aisladas de la rizosfera, a lo largo de dos años, en tres suelos de características muy diferentes, se realiza un ensayo previo de actividades con potencial para incidir favorablemente sobre la salud de la planta. Las cepas se seleccionan sobre la base de un screening a gran escala en el que se intenta absorber la máxima variabilidad genética de los microorganismos que se desarrollan en el sistema rizosférico de Nicotiana glauca y pasan a estudiarse por su capacidad para inducir resistencia sistémica y efectos sobre el crecimiento en plantas de tomate, especie elegida como modelo de trabajo...

Trabajo presentado en el VIII Simposium Nacional – IV Ibérico sobre Nutrición Mineral de las Plantas, celebrado en Murcia (España), en septiembre de 2000

En: Phytochemical analysis. ISSN. 0958-0344. n. 10 (1999), p. 55-59 The separation and identification of a mixture of organic acids by capillary electrophoresis, with direct detection by UV absorption at a wavelength of 200 nm is reported. A solution containing the following organic acids was studied: oxalic, formic, fumaric, malic, succinic, citric, acetic and lactic acid. Separation was achieved using a fused-silica capillary filled with phosphate buffer (200 mM; pH 6) containing N-acetylN,N,N-trimethylammonium bromide (0.5 mM) as cationic surfactant, necessary to modify the electrosmotic flow. The composition of organic acids in exudates of Lupinus luteus was determined by this method.

The rhizosphere of Elaeagnus angustifolia L. was sampled monthly during one year and the genera of the isolated bacteria were determined. Bacillus predominated in all seasons. Eight groups of Bacillus were identified according to biochemical tests described in the Bergey's Manual, from which, group VII, with B. mycoides and B. laterosporus as the most likely species to define it, predominated (total year average of 60.5%). In order to determine intrageneric variation, additional tests as resistance to antibiotics and use of different carbon sources were assayed. According to both tests, the Bacillus strains isolated from the rhizosphere of E. angustifolia differed significantly throughout the year. These results suggest the adaptation of rhizospheric microbial communities to environmental conditions, so variable in Mediterranean climates, and to the physiological status of the plant. Se muestreó la rizosfera de E. angustifolia L. durante un año y se determinaron los géneros a los que pertenecían las bacterias aisladas. Bacillus predominó durante todo el año. Se identificaron ocho grupos de Bacillus según las pruebas bioquímicas del Manual Bergey's entre los cuales predominaba el grupo VII (media anual 60.5%). Con objeto de determinar la variación intragenérica, se realizaron pruebas de resistencia a antibióticos y metabolización de fuentes de carbono. En ambos casos se encontraron diferencias significativas anua-les. Estos resultados sugieren la gran capacidad de adaptación de las comunidades microbianas rizosféricas tanto a las condiciones ambientales, tan variables en climas mediterráneos, como al estado fisiológico de la planta.

The effect of root nodule extracts from European alder (Alnus glutinosa [L.] Gaertn.) on the rates of amrnonification, nitrification and C02 production was evaluated in three soils of different physico-chemical characteristics. The extracts decreased net ammonification rate (up to a 43% respect to water control), probably because of an increase of immobilization rather than an effect of a speciffc inhibitor. The rate of nitrification was increased by the extracts (up to 40% from water control) because of the ammonium present in the extracts. An increase in C02 production showed that the nodule extracts stimulate microbial activity. This depended not only on the amount of organic matter introduced by the extracts but also to some activator of microflora. Se evalúa el efecto de extractos nodulares del aliso europeo (Alnus glutinosa [L.] Gaertn.) sobre las tasas de amonificación, nitrificación y producción de C02 en tres suelos de características físico-químicas diferentes. Los extractos reducen la tasa de amonificación (un 43% menor que en el control con agua), probablemente debida a un aumento de la inmovilización más que a un inhibidor especifico. La tasa de nitrificación crece por efecto de los extractos (un 40% respecto al control con agua) a consecuencia del amonio presente en éstos. El incremento de la producción de C02 muestra que los extractos estimulan la actividad microbiana. Esto no parece depender sólo del aporte extra de materia orgánica por los extractos, sino por algún activador especifico.

Tesis-CEINDO, Universidad San Pablo CEU, Programa en Ciencia y Tecnología de la Salud, leida 10 de febrero de 2021. La presente tesis doctoral se centra en el estudio del microbioma de la rizosfera y en las relaciones planta-microrganismos beneficiosos y su influencia sobre la fisiología de las plantas y sobre el metabolismo secundario defensivo y el sistema inmunitario vegetal en general. Este estudio parte de la consideración de la rizosfera como una fuente especialmente rica en microorganismos beneficiosos, que tienen un papel fundamental en mejorar la capacidad de adaptación de las plantas a ambientes cambiantes y que están adaptados al sistema planta-microorganismo gracias a la presión selectiva que han ejercido las plantas sobre el microbioma durante el largo proceso de coevolución. Además, el trabajo surge ante la actual necesidad de desarrollar nuevas prácticas agrícolas de base biotecnológica, efectivas y a la vez sostenibles que minimicen las pérdidas económicas y materiales debidas a las infecciones patogénicas que atacan a los cultivos y también causadas por condiciones de estrés abiótico. De esta manera se persigue aumentar el rendimiento de los cultivos, tanto en cantidad como en calidad de alimentos, para poder proveer a una población en continuo crecimiento y a la vez cumplir con el concepto de seguridad alimentaria propuesto por la FAO. Por todo lo anterior, el presente trabajo se centra en el uso de rizobacterias beneficiosas (PGPR) y de moléculas derivadas del metabolismo de las mismas (elicitores metabólicos) como inoculantes de plantas capaces de inducir el metabolismo secundario defensivo, dando lugar a plantas con un sistema inmunitario más fuerte y, por tanto, plantas mejor preparadas para combatir el estrés biótico y abiótico. Así, el objetivo último del trabajo es desarrollar inoculantes de plantas de origen biológico, con una capacidad bioestimulante efectiva y por ello, capaces de sustituir a los fitosanitarios químicos. La gran novedad que aporta este trabajo es el uso de moléculas elicitoras derivadas del metabolismo de determinadas rizobacterias. Es por esto, que la especie de rizobacteria beneficiosa seleccionada para estudiar su efecto y el de sus elicitores metabólicos sobre el metabolismo secundario de las plantas fue la cepa Pseudomonas fluorescens N 21.4, una cepa cuya capacidad de elicitación y de inducción de resistencia sistémica en distintas especies vegetales ya ha sido ampliamente demostrada por el grupo de investigación. Se comenzó probando la cepa viva como control positivo y distintas fracciones elicitoras de la misma en plántulas de Arabidopsis thaliana en condiciones controladas de laboratorio, estudiando su capacidad de inducción de resistencia sistémica, el nivel de estrés oxidativo de las plantas tratadas y las rutas de transducción de señal implicadas en la respuesta. Después se probó la cepa viva y sus elicitores metabólicos en condiciones reales de campo en cultivos comerciales de zarzamora (Rubus cv. Loch Ness), estudiándose el fitness general de las plantas a través de marcadores específicos, así como la acumulación de compuestos de interés en las hojas y en los frutos y los genes específicos implicados en la maduración de los frutos. Los resultados mostraron que en las plantas inoculadas con los tratamientos existía una relación causal entre la inducción de resistencia sistémica y una reducción del estrés oxidativo en A. thaliana y un mejor fitness general, menor estrés oxidativo y mayor acumulación de compuestos fenólicos beneficiosos en las hojas y frutos de zarzamora. Al demostrarse la capacidad de los elicitores metabólicos de la cepa P. fluorescens N 21.4 de inducir el metabolismo secundario defensivo, se procedió a la identificación química de las moléculas responsables de dicha capacidad, encontrándose siete compuestos muy prometedores dado su potencial capacidad antibiótica y antifúngica. Este estudio termina con la búsqueda de nuevas cepas PGPR (bioefectores) y de sus elicitores metabólicos y con el estudio de las vías de transducción de señal involucradas en la respuesta de las plantas elicitadas con las mismas. De un grupo inicial de ciento setenta y cinco rizobacterias, se seleccionaron dos por sus prometedoras capacidades para utilizarse como inoculantes de plantas en experimentos futuros. This doctoral thesis focuses on the study of the rhizosphere microbiome and the plantbeneficial microorganism relationship and their influence on plant physiology, on the defensive secondary metabolism and on the plant immune system in general. This study starts from the consideration of the rhizosphere as an especially rich source of beneficial microorganisms, which have a fundamental role in improving the adaptability of plants to changing environments, and which are adapted to the plant-microorganism system thanks to the selective pressure that plants have exerted on the microbiome during the long process of coevolution. Furthermore, the work arises from the current need to develop new, effective and sustainable biotechnology-based agricultural practices that minimize economic and material losses caused by pathogenic infections and abiotic stress conditions. Hence, the aim is to increase the yield of crops, both in quantity and quality of food, in order to be able to provide to a population in continuous growth and at the same time fulfilling the concept of food security proposed by the FAO. For all the above, this work focuses on the use of beneficial rhizobacteria (PGPR) and molecules derived from their metabolism (metabolic elicitors) as plant inoculants capable of inducing the defensive secondary metabolism, getting plants with a stronger immune system and, therefore, plants better prepared to face to biotic and abiotic stress. Thus, the ultimate objective of the work is to develop biological plant inoculants, with an effective biostimulant capacity and therefore, capable of replacing phytosanitary products of chemical origin. The great novelty brought by this work is the use of elicitor molecules derived from the metabolism of certain rhizobacteria. This is why the species of beneficial rhizobacterium selected to study its effect and that of its metabolic elicitors on the secondary metabolism of plants was the strain Pseudomonas fluorescens N 21.4, a strain whose ability to elicit and to induce systemic resistance in different plant species has already been widely demonstrated by the research group. The study began by testing the live strain as a positive control and different eliciting fractions of it in Arabidopsis thaliana seedlings under controlled laboratory conditions, studying their capacity to induce systemic resistance, the level of oxidative stress of the treated plants and the signal transduction pathways involved in the response. The live strain and its metabolic elicitors were then tested under real field conditions in commercial crops of blackberry (Rubus cv. Loch Ness), studying the general fitness of the plants through specific markers, as well as the accumulation of compounds of interest in the leaves and in the fruits and the specific genes involved in the ripening of the fruit. The results showed that in the plants that had been inoculated with the treatments there was a causal relationship between the induction of systemic resistance and the reduction in oxidative stress in A. thaliana and a better general fitness, less oxidative stress and greater accumulation of beneficial phenolic compounds in the leaves and fruits of blackberry. Since the ability of the metabolic elicitors of the P. fluorescens N 21.4 strain to induce the defensive secondary metabolism was demonstrated, a chemical identification of the molecules responsible for that capacity was performed, identifying seven promising compounds for their potential antibiotic and antifungal capacity. This study ends with the search for new PGPR strains (bioeffectors) and their metabolic elicitors and with the study of the signal transduction pathways involved in the response of plants elicited with them. From an initial group of one hundred and seventyfive rhizobacteria, two were selected for their promising abilities to be used as plant inoculants in future experiments.

Tesis-Universidad San Pablo CEU, Facultad de Farmacia, Departamento de Biología, 2012 El desarrollo industrial supone la emisión de múltiples sustancias contaminantes a nuestro entorno (sólidas, líquidas y gaseosas), con el consiguiente deterioro del mismo. En cuanto a las emisiones líquidas, objeto del presente trabajo, la legislación actual (Ley 10/1993, de la Comunidad de Madrid, sobre vertidos líquidos industriales al sistema integral de saneamiento), es cada vez mas exigente con respecto a parámetros químicos y biológicos (DQO, pH, conductividad, DBO5). En los procesos de descontaminación se utilizan, en muchas ocasiones, métodos físico-químicos pero éstos suelen ser perjudiciales para el medio ambiente. Por eso se han desarrollado métodos biológicos, más respetuosos, que son conocidos como mecanismos de biorremediación (uso de plantas y/o microorganismos para eliminar la contaminación existente en un determinado medio). El medio para biorremediar utilizado en este trabajo se conoce como agua de taladrina. La taladrina es una emulsión de agua y aceite (2%) que se utiliza para lubricar y refrigerar la zona de contacto entre las herramientas de corte y los materiales a mecanizar. Pero con el uso, este líquido pierde sus cualidades y se convierte en un residuo (taladrina agotada). La empresa John Deere Ibérica S. A. (JDISA), que suministró el líquido a fitorremediar, realiza un tratamiento de la taladrina agotada mediante el sistema del vacudest, obteniendo una reducción importante de la DQO, desde más de 25.000 ppm hasta alrededor de 4.000 ppm. Después de este tratamiento se obtiene un residuo conocido como agua de taladrina. El objetivo del presente trabajo fue desarrollar un sistema biológico capaz de reducir la DQO de las muestras de agua de taladrina procedentes de los procesos de producción de JDISA. Las muestras están formadas, principalmente, por hidrocarburos lineales, ramificados, aromáticos y aromáticos policíclicos (fluoreno y pireno), aunque aparecen otros elementos químicos de diferente naturaleza. Presentan unos valores de DQO superiores a 1.750 ppm (límite legal establecido por la Ley 10/1993 de la Comunidad de Madrid). El desarrollo del sistema biorremediador se dividió en dos partes. En primer lugar se determinó la especie vegetal con mayor capacidad para reducir la DQO. Para ello, se utilizaron especies con hábitos acuáticos y terrestres y se realizaron diversos ensayos para determinar su resistencia al medio contaminado. La especie que tuvo una mayor resistencia y que era capaz de reducir la DQO por debajo de los límites establecidos por la ley, fue el maíz (Zea mays), con la que se realizaron los ensayos de biorremediación. Paralelamente se buscó un medio en el que las plantas pudiesen enraizar. Este medio tenía que ser biodegradable y no tóxico. El esparto resultó ser el soporte de crecimiento vegetal que más favoreció el enraizamiento de las plantas. En segundo lugar, se aislaron microorganismos de un medio contaminado con hidrocarburos, de las propias taladrinas, del esparto y de un reactor biológico de membrana (R. B. M.). Con estas cepas se desarrollaron sistemas maíz-esparto-microorganismo. Fruto de este trabajo, se solicitó y fue concedida la patente, titulada ¿Procedimiento para la reducción de la DQO de efluentes líquidos aceitosos mediante fitorremediación con maíz-esparto; su aplicación al tratamiento de taladrinas agotadas¿ (P201000684). El sistema maíz-esparto fue el más eficaz en el proceso de fitorremediación, consiguiendo reducciones del parámetro de la DQO en torno a un 60% partiendo de niveles próximos a los 2.000 ppm. Estas reducciones permiten obtener un residuo con estándares de contaminación por debajo de los límites establecidos por la ley 10/1993 de la Comunidad de Madrid. Sólo el sistema de bioaumento desarrollado con un consorcio bacteriano formado por cepas adaptadas a medios contaminados con taladrinas fue capaz de mejorar la fitorremediación. Paralelamente, se realizaron estudios ultraestructurales, observándose una reducción del número de cloroplastos y una fuerte alteración morfológica de los mismos en las plantas que crecieron en agua de taladrina. En la zona radical no se observó una modificación de los haces vasculares, lo que podría permitir la translocación de productos tóxicos a la zona aérea. El sistema de fitorremediación realizado en fases disminuyó el daño causado por el agua de taladrina en las plantas, lo que permitió realizar una segunda fase de fitorremediación mejorando el rendimiento del proceso. Se observó también que la reducción de la DQO ejercida por este sistema fue mayor que la obtenida por el sistema en continuo. Finalmente, se buscó determinar si el sistema de fitorremediación era capaz de reducir la toxicidad del agua de taladrina. Para ello, se realizó un análisis de perdida de bioluminiscencia con la cianobacteria sensor Anabaena CPB4337, que es muy sensible a la presencia de contaminantes. Se observó que la bioluminiscencia emitida por dicha cianobacteria crecida en las muestras fitorremediadas era 2 veces mayor a la emitida en las muestras iniciales, de manera que el sistema de fitorremediación no sólo es capaz de reducir la DQO sino que a su vez es capaz de disminuir la toxicidad del medio.