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La brucelosis es la enfermedad zoonótica más extendida en el mundo que afecta diversos animales, incluyendo especies domésticas y de vida silvestre. Es causada por una bacteria perteneciente al género Brucella, el cual incluye nueve especies distintas e infectantes de mamíferos terrestres y marinos. Cada especie de Brucella presenta variaciones en la secuencia de ADN que afectan a los nucleótidos en una posición específica del genoma. A estas variaciones se les llama polimorfismo. El polimorfismo de las especies de Brucella localizado en los genes que codifican para las proteínas glk, omp25ytrpE, se utilizó para desarrollar un ensayo múltiple basado en la extensión de cebadores, el cual permite identificar un aislamiento como miembro de una de las nueve especies reconocidas. Los métodos tradicionales para la identificación de Brucella a nivel de especie consumen mucho tiempo y ponen en riesgo al personal laboratorial. Es por ello que la finalidad de este trabajo es evitar la ambigüedad, agilizar el procedimiento, disminuir el tiempo de respuesta y generar una herramienta laboratorial más efectiva para mejorar la vigilancia epidemiológica, el diagnóstico y el abordaje de la brucelosis en Costa Rica. El siguiente trabajo presenta la estandarización del protocolo para la extracción de ADN de Brucella, así como de una serie de amplificaciones de fragmentos de genes de interés por medio de la reacción en cadena de la polimerasa (PCR) y la estandarización de la reacción de extensión de cebadores. Brucellosis is the most widespread zoonotic disease worldwide that affects various animals, including domestic species and wildlife. It is caused by bacteria belonging to the genus Brucella, which includes nine different species and infective terrestrial and marine mammals. Each species of Brucella has variations in DNA sequence involving nucleotides in a specific position in the genome. These variations are called polymorphisms The polymorphism of Brucella species located in the genes coding for proteins glk, omp25, and trpE was used to develop a multiplex assay based on primer extension, with which it can identify an isolate as a member of nine recognized species. Traditional methods for identification of Brucella at the species level, time consuming and endanger laboratory staff. That is why the aim of this work is to avoid ambiguity, to streamline the procedure, reduce the response time and generate a more effective laboratory tool for improving epidemiological surveillance, diagnosis and approach of brucellosis in Costa Rica. This paper presents the standardization of the protocol for DNA extraction of Brucella, the standardization of a series of amplifications of fragments of genes of interest through the chain reaction (PCR) and standardization of the extension reaction primers. Brucelose é a doença zoonótica mais distribuída por todo o mundo e que afeta várias espécies animais incluindo espécies domésticas e selvagens. É causada por uma bactéria pertencente ao género Brucella que inclui nove espécies diferentes e é infectante para mamíferos terrestres e marinhos. Cada espécie de Brucella tem variações na sequência de DNA envolvendo os nucleótidos de uma posição especifica do genoma. Estas variações são chamadas polimorfismos. O polimorfismo das espécies de Brucella localizado no código genético para proteínas glk, omp25 e trpE foi utilizado para desenvolver um ensaio múltiplo baseado na primeira extensão, com a qual se pode identificar e isolar como membro de uma das 9 espécies. Os métodos tradicionais para identificação de Brucella ao nível da espécie, consomem muito tempo e põe em risco o pessoal de laboratório. É por isso que o objectivo deste trabalho é evitar a ambiguidade, agilizar o procedimento, reduzir o tempo de resposta e gerar uma ferramenta laboratorial mais efectiva para melhorar a vigilância epidemiológica, diagnostico e aproximação à brucelose na Costa Rica. Este artigo, apresenta a estandardização do protocolo para extracção de DNA de Brucella, estandardização de uma série de amplificações de fragementos genéticos de interesse através da reacção de polimerase em cadeia (PCR) e estandardização da reacção dos primers de extensão. Universidad Nacional, Costa Rica Escuela de Medicina Veterinaria