Search

Most clear cell renal cell carcinomas (ccRCCs) have inactivation of the von Hippel-Lindau tumor suppressor protein (pVHL), resulting in the accumulation of hypoxia-inducible factor -subunits (HIF-) and their downstream targets. HIF-2 expression is particularly high in ccRCC and is associated with increased ccRCC growth and aggressiveness. In the canonical HIF signaling pathway, HIF-prolyl hydroxylase 3 (PHD3) suppresses HIF-2 protein by post-translational hydroxylation under sufficient oxygen availability. Here, using immunoblotting and immunofluorescence staining, qRT-PCR, and siRNA-mediated gene silencing, we show that unlike in the canonical pathway, PHD3 silencing in ccRCC cells leads to down-regulation of HIF-2 protein and mRNA. Depletion of other PHD family members had no effect on HIF-2 expression, and PHD3 knockdown in non-RCC cells resulted in the expected increase in HIF-2 protein expression. Accordingly, PHD3 knockdown decreased HIF-2 target gene expression in ccRCC cells and expression was restored upon forced HIF-2 expression. The effect of PHD3 depletion was pinpointed to HIF2A mRNA stability. In line with these in vitro results, a strong positive correlation of PHD3 and HIF2A mRNA expression in ccRCC tumors was detected. Our results suggest that in contrast to the known negative regulation of HIF-2 in most cell types, high PHD3 expression in ccRCC cells maintains elevated HIF-2 expression and that of its target genes, which may enhance kidney cancer aggressiveness.

Tilaseurannassa selvitettiin valkuaislähteiden soveltuvuutta välikasvatusporsaiden liemiruokintaan, niiden vaikutuksia porsaiden tuotanto-ominaisuuksiin (päiväkasvu, rehun syönti ja rehuhyötysuhde) ja hyvinvointiin (hännänpurenta ja kuolleisuus). Tutkitut kotimaiset valkuaisrehukomponentit olivat ohravalkuaisrehu (OVR) ja härkäpapu. Seurannassa oli yhteensä 560 Duroc-kolmiroturisteytysporsasta, joiden alkupaino oli keskimäärin 9.1 kg. Porsaat jaettiin kontrolli- ja koeryhmään. Havaintoyksikkönä kokeessa oli venttiili. Jokaisella venttiilillä oli 40 porsasta. Kontrollirehu sisälsi ohraa, vehnää, kauraa, kasviöljyä, soijapohjaista täydennysrehua ja ohravalkuaisrehua. Koerehussa soijan sijaan käytettiin härkäpapua sekä härkäpapuruokinnan koostumusta täydentävää rehua. Porsailla oli kolmivaiheinen vapaa liemiruokinta ja rehunkulutusta seurattiin tilan ruokintalaitteella. Porsaat punnittiin kokeen alussa, ruokintajaksojen vaihtuessa ja kokeen lopussa. Porsaat kasvoivat keskimäärin 480 g päivässä eikä päiväkasvussa ollut tilastollisesti merkitseviä eroja ryhmien välillä. Rehunkulutus koko kokeen aikana eläintä kohti oli 342 MJ NEk ja 30.4 kg ka, eikä ryhmien välillä ollut merkitseviä eroja. Myöskään rehuhyötysuhteissa ei ryhmien välillä tullut merkitseviä eroja. Välikasvattamossa olennaista on, että porsaat kasvavat nopeasti, tasaisesti ja rehutehokkaasti välityspainoonsa. Molemmissa ruokintaryhmissä yli 75% porsaista myytiin eteenpäin 49 vuorokauden sisällä vieroituksesta. Kontrolliryhmästä suurin osa porsaista myytiin 46‒47 päivän kuluttua (54%) ja koeryhmästä 39‒40 päivän kuluttua vieroituksesta (47%). Koeryhmän porsaita jäi kuitenkin koeseurannan puitteissa merkittävästi enemmän jäljelle (21 vs 12%) suhteessa myytyjen porsaiden määrään. Tilaseurannan tulokset viittaavat siihen, että härkäpavulla ja siihen sopivilla täydennyksillä voitaisiin korvata rehun soija vilja-OVR‒pohjaisella ruokinnalla. Kontrolli- ja koeryhmän porsaiden välillä ei ollut merkittävää eroa tuotantotuloksissa. Tutkimustietoon perustuvien johtopäätösten saamiseksi vaaditaan kuitenkin jatkotutkimuksia suuremmalla havaintomäärällä tai tarkentamalla koeasetelmaa esimerkiksi porsaskohtaisin lisäpunnituksin.

SiFos-hankkeessa tavoiteltiin sikojen ja siipikarjan ruokinnan kehittämisellä mm. maatilojen typpi- ja fosforierityksen minimointia. Lisäksi tavoiteltiin tilatason laskentatyökaluja, joiden avulla viljelijä voi tarkentaa tilansa ravinnekiertoa rehusta lantaan ja pellon kautta takaisin rehuun. Tässä SiFos-hankkeen osassa keskityttiin emakoiden tiineydenaikaisen fosforinerityksen vähentämisen keinoihin. Tilaseuranta toteutettiin varsinaissuomalaisella porsastuotantotilalla yhteistyössä rehu- ja lihateollisuuden kanssa. Kontrollikäsittelyssä emakoiden rehustus oli tilan tavanomainen rehustus (alkutilanne), josta tehtiin alkutilanneanalyysi analysoimalla tiineiden ja imettävien emakoiden rehu-, sonta-, virtsa- ja luunäytteitä. Alkutilanneanalyysiä varten yhteensä 166 emakolta otettiin sonta- ja virtsanäytteitä satunnaisesti kolmessa eri tiineyden vaiheessa. Lisäksi noin 100 teuraaksi menneestä emakosta kerättiin luunäytteitä analysoitavaksi ennen ja jälkeen rehumuutoksen. Mahdollisimman monelta emakolta kerättiin molemmat eritenäytteet. Koekäsittelyssä tiineiden emakoiden rehun kokonaisfosforipitoisuutta alennettiin. Eläinten riittävästä fosforinsaannista huolehdittiin siten, että rehujen sulavan fosforin laskennallinen pitoisuus pidettiin riittävän korkeana ja fosforin hyväksikäyttö varmistettiin oikealla fytaasientsyymiannoksella. Entsyymin tarkoitus on irrottaa rehuaineiden fytaattifosforia sian elimistön käyttöön. Koekäsittelyyn valittujen 52 emakon tiineyden aikana niiltä kerättiin sonta- ja virtsanäytteet tiineyden päivinä n. 30, 90 ja 103-114 tilan tuotantorytmiin sovittaen. Eritenäytteet otettiin aina ensimmäisen aamupäiväruokinnan yhteydessä aamupäivän aikana. Rehunäytteet otettiin liemirehun sekoittajasta yleensä eritenäytteiden ottopäivänä, koska emakoiden rehunvaihdokset ajoittuivat muille kuin näytteenottopäiville. Tilaseurannassa verrattiin emakoiden sontaan ja virtsaan erittyneen fosforin määrää ennen ja jälkeen rehumuutoksen. Luuston kunnon säilyminen varmistettiin analysoimalla luunäytteistä kivennäispitoisuudet ja murtolujuudet. Rehujen kivennäispitoisuudet ja fytaasiaktiivisuudet todennettiin laboratorioanalyyseillä. Emakoiden paino- ja silavamittatiedot saatiin tutkimuksen käyttöön tiineysajan lisäksi seurantatiineyden jälkeiseltä imetysajalta. Hankkeen puitteissa oli myös mahdollisuus tarkastella tilan porsastuotannon tunnuslukuja ennen ja jälkeen rehumuutoksen. Tilaseurannan organisoiminen suurelle porsastuotantotilalle yhdessä rehu- ja lihateollisuuden kanssa vaati suunnitelmallisuutta ja organisointia kaikilta osapuolilta. Koska sikatilalla ei yleensä tarvita samaan tuotannon vaiheeseen useampaa eri rehua, erilaisia rehuseoksia voitiin testata vain peräkkäin toteutettavilla ruokintajaksoilla. Sen tekninen toteutus todettiin mahdolliseksi. Tulosten odotetaan palvelevan elinkeinon kehittämistä ympäristöystävällisempään suuntaan.

Luonnonvarakeskuksen sika- ja siipikarjatutkimusta alettiin siirtää kumppanuustiloille vuosien 2012 ja 2013 aikana. Ensimmäiset laajemmat tutkimus- ja kehityshankkeet ovat nyt v. 2019 raportointivaiheessa ja siten on mahdollisuus arvioida toimintamallin toimivuutta eri näkökulmista. Kumppanuustilatutkimuksessa tutkija koordinoi maatilalla tehtävän tutkimuksen. Silti tutkija on maatilalla vain kyläilemässä ja sopeuttaa tutkimuksensa maatilan toimintoihin, tuotantopanoksiin ja sitoumuksiin. Riskien ottaminen tieteen nimissä kumppanuustilatutkimuksessa ei ole mahdollista. Osa eläinkoetoiminnasta on luvanvaraista. Jos lupa tarvitaan koeasetelmalle, se tarvitaan myös kokeen toteutuspaikalle. Kotieläintila ei välttämättä halua tällaista lupaa hakea, koska tilan oma liiketoiminta ei sellaista tarvitse ja viranomaiset työllistävät tilaa muutenkin ihan riittävästi. Kotieläintilan tuotantosopimukset saattavat edellyttää sitoutumista esim. yhteen rehutoimittajaan ja/tai yhteen tuotannon ostajaan. Ruokintatutkimuksessa tutkijalla on mahdollisuus ehdottaa muutoksia kaupallisten rehujen koostumuksiin. Kumppanuustilatutkimuksen omissa sopimuksissa sovitaan luottamuksellisten tietojen käsittelystä ja tutkimustulosten julkaisuoikeuksista. Tässä tutkijan täytyy olla tarkkana, koska julkisrahoitteisen hankkeen tulosten kuuluu olla julkisia, vaikka ne tuotettaisiin kaupallisen toimijan liikesalaisuuksia hyödyntäen. Koetoimintaa kotieläintilalle suunnitellessa täytyy tarkistaa, että tilalla on mahdollisuus osoittaa ylimääräistä työvoimaa tutkimuksesta johtuviin tehtäviin. Kotieläintilalla tehtävät järjestelyt yksittäistä koetta varten ovat usein ainutkertaiset ja vastaavan järjestelyn toistaminen tyypillisen kolmevuotisen hankkeen aikana voi olla vaikeaa. Siksi kumppanuustilatutkimuksen etukäteissuunnittelu rahoituksen hakuvaiheesta lähtien korostuu. Suunnitteluun kuuluu esim. koeasetelman luominen, koska se määrittelee mm. koekäsittelyjen ajoituksen, tiedonkeruumallin ja siten koetoiminnan hinnan. Koeasetelmaan vaikuttavat kumppanuustilan tekniset rakenteet kuten osastojen, karsinoiden ja eläinten ruokintapisteiden (venttiilien) lukumäärä. Siksi koeasetelma on aina tila- ja tutkimusaihekohtainen. Lisäksi kriittistä on tieto, pystytäänkö eläin tunnistamaan yksilöllisesti koko kokeen läpi, koska tämä useimmiten lisää tutkimuksen tarkkuuttaa verrattuna esimerkiksi pahnuekohtaisiin mittauksiin. Tarkkuuden lisääminen voi nostaa kokeen kustannuksia, mutta yksilömittaukset voivat myös laskea tarvittavaa eläinmäärää niin, että kokonaiskustannukset laskevat. Tämän vuoksi budjetoinnin yhteydessä mittaustarkkuus arvotetaan euroina. Lisäksi on huomioitava, että tulosten hajonta on suurempi maatilaolosuhteissa kuin tutkimuslaitoksessa tehdyissä mittauksissa. Koetoiminta kotieläintiloilla lisää vuoropuhelua tutkimuksen ja elinkeinon eri osapuolten välillä. Tieteellisen tutkimuksen toteutusmalliksi se soveltuu kuitenkin harvoin.

Background: Cerebrospinal fluid (CSF) levels of two soluble biomarkers, glial fibrillary acidic protein (GFAP) and neurofilament light chain (NfL), have been shown to associate with multiple sclerosis (MS) disease progression. Now, both biomarkers can be detected reliably in serum, and importantly, their serum levels correlate well with their CSF levels. Objective: To evaluate the usability of serum GFAP measurement as a biomarker of progressive disease and disease severity in MS. Methods: Clinical course, Expanded Disability Status Scale (EDSS), disease duration, patient age and magnetic resonance imaging (MRI) parameters were reviewed in 79 MS patients in this cross-sectional hospital-based study. Serum samples were collected for measurement of GFAP and NfL concentrations using single molecule array (Simoa) assay. A cohort of healthy controls was evaluated for comparison. Results: Higher serum concentrations of both GFAP and NfL were associated with higher EDSS, older age, longer disease duration, progressive disease course and MRI pathology. Conclusion: Earlier studies have demonstrated that GFAP, unlike NfL, is not increased in association with acute focal inflammation-related nervous system damage. Our work suggests that GFAP serum level associates with disease progression in MS and could potentially serve as an easily measurable biomarker of central nervous system (CNS) pathology related to disease progression in MS.

Positron emission tomography (PET) gives an opportunity to quantitate the expression of specific molecular targets in vivo and longitudinally in brain and thus enhances our possibilities to understand and follow up multiple sclerosis (MS)-related pathology. For successful PET imaging, one needs a relevant target molecule within the brain, to which a blood–brain barrier–penetrating specific radioligand will bind. 18-kDa translocator protein (TSPO)-binding radioligands have been used to detect activated microglial cells at different stages of MS, and remyelination has been measured using amyloid PET. Several PET ligands for the detection of other inflammatory targets, besides TSPO, have been developed but not yet been used for imaging MS patients. Finally, synaptic density evaluation has been successfully tested in human subjects and gives opportunities for the evaluation of the development of cortical and deep gray matter pathology in MS. This review will discuss PET imaging modalities relevant for MS today.

PURPOSE: This study aims to investigate whether the uptake of 2-(2-nitro-1H-imidazol-1-yl)-N-(2,2,3,3,3-pentafluoropropyl)-acetamide ([18F]EF5) and 2-deoxy-2-[18F]fluoro-d-glucose ([18F]FDG) is associated with a hypoxia-driven adverse phenotype in head and neck squamous cell carcinoma cell lines and tumor xenografts. METHODS: Xenografts were imaged in vivo, and tumor sections were stained for hypoxia-inducible factor 1α (Hif-1α), carbonic anhydrase IX (CA IX), and glucose transporter 1 (Glut-1). Tracer uptakes and the expression of Hif-1α were determined in cell lines under 1% hypoxia. RESULTS: High [18F]EF5 uptake was seen in xenografts expressing high levels of CA IX, Glut-1, and Hif-1α, whereas low [18F]EF5 uptake was detected in xenografts expressing low amounts of CA IX and Hif-1α. The uptake of [18F]EF5 between cell lines varied extensively under normoxic conditions. A clear correlation was found between the expression of Hif-1α and the uptake of [18F]FDG during hypoxia. CONCLUSIONS: The UT-SCC cell lines studied differed with respect to their hypoxic phenotypes, and these variations were detectable with [18F]EF5. Acute hypoxia increases [18F]FDG uptake in vitro, whereas a high [18F]EF5 uptake reflects a more complex phenotype associated with hypoxia and an aggressive growth pattern.

Summary The hypoxia-inducible factor (HIF) prolyl hydroxylase PHD3 regulates cellular responses to hypoxia. In normoxia the expression of PHD3 is low and it occurs in cytosolic aggregates. SQSTM1/p62 (p62) recruits proteins into cytosolic aggregates, regulates metabolism and protein degradation and is downregulated by hypoxia. Here we show that p62 determines the localization, expression and activity of PHD3. In normoxia PHD3 interacted with p62 in cytosolic aggregates, and p62 was required for PHD3 aggregation that was lost upon transfer to hypoxia, allowing PHD3 to be expressed evenly throughout the cell. In line with this, p62 enhanced the normoxic degradation of PHD3. Depletion of p62 in normoxia led to elevated PHD3 levels, whereas forced p62 expression in hypoxia downregulated PHD3. The loss of p62 resulted in enhanced interaction of PHD3 with HIF-α and reduced HIF-α levels. The data demonstrate p62 is a critical regulator of the hypoxia response and PHD3 activity, by inducing PHD3 aggregation and degradation under normoxia.

Cellular oxygen tension is sensed by a family of prolyl hydroxylases (PHD1-3) that regulate the degradation of hypoxia-inducible factors (HIF-1alpha and -2alpha). The PHD2 isoform is considered as the main downregulator of HIF in normoxia. Our previous results have shown that nuclear translocation of PHD2 associates with poorly differentiated tumor phenotype implying that nuclear PHD2 expression is advantageous for tumor growth. Here we show that a pool of PHD2 is shuttled between the nucleus and the cytoplasm. In line with this, accumulation of wild type PHD2 in the nucleus was detected in human colon adenocarcinomas and in cultured carcinoma cells. The PHD2 isoforms showing high nuclear expression increased anchorage-independent carcinoma cell growth. However, retention of PHD2 in the cytoplasm inhibited the anchorage-independent cell growth. A region that inhibits the nuclear localization of PHD2 was identified and the deletion of the region promoted anchorage-independent growth of carcinoma cells. Finally, the cytoplasmic PHD2, as compared with the nuclear PHD2, less efficiently downregulated HIF expression. Forced HIF-1alpha or -2alpha expression decreased and attenuation of HIF expression increased the anchorage-independent cell growth. However, hydroxylase-inactivating mutations in PHD2 had no effect on cell growth. The data imply that nuclear PHD2 localization promotes malignant cancer phenotype.

Background Hypoxia can halt cell cycle progression of several cell types at the G1/S interface. The arrest needs to be overcome by cancer cells. We have previously shown that the hypoxia-inducible cellular oxygen sensor PHD3/EGLN3 enhances hypoxic cell cycle entry at the G1/S boundary. Methods We used PHD3 knockdown by siRNA and shRNA in HeLa and 786–0 renal cancer cells. Flow cytometry with cell synchronization was used to study cell growth at different cell cycle phases. Total and phosphospecific antibodies together with cycloheximide chase were used to study p27/CDKN1B expression and fractionations for subcellular protein localization. Results Here we show that PHD3 enhances cell cycle by decreasing the expression of the CDK inhibitor p27/CDKN1B. PHD3 reduction led to increased p27 expression under hypoxia or VHL mutation. p27 was both required and sufficient for the PHD3 knockdown induced cell cycle block. PHD3 knockdown did not affect p27 transcription and the effect was HIF-independent. In contrast, PHD3 depletion increased the p27 half-life from G0 to S-phase. PHD3 depletion led to an increase in p27 phosphorylation at serine 10 without affecting threonine phosphorylation. Intact serine 10 was required for normal hypoxic and PHD3-mediated degradation of p27. Conclusions The data demonstrates that PHD3 can drive cell cycle entry at the G1/S transition through decreasing the half-life of p27 that occurs by attenuating p27S10 phosphorylation. Electronic supplementary material The online version of this article (doi:10.1186/s12943-015-0410-5) contains supplementary material, which is available to authorized users.

Hypoxia restricts cell proliferation and cell cycle progression at the G1/S interface but at least a subpopulation of carcinoma cells can escape the restriction. In carcinoma hypoxia may in fact select for cells with enhanced hypoxic survival and increased aggressiveness. The cellular oxygen sensors HIF proline hydroxylases (PHDs) adapt the cellular functions to lowered environmental oxygen tension. PHD3 isoform has shown the strongest hypoxic upregulation among the family members. We detected a strong PHD3 mRNA expression in tumors of head and neck squamous cell carcinoma (HNSCC). The PHD3 expression associated with expression of hypoxic marker gene. Using siRNA in cell lines derived from HNSCC we show that specific inhibition of PHD3 expression in carcinoma cells caused reduced cell survival in hypoxia. The loss of PHD3, but not that of PHD2, led to marked cell number reduction. Although caspase-3 was activated at early hypoxia no induction of apoptosis was detected. However, hypoxic PHD3 inhibition caused a block in cell cycle progression. Cell population in G1 phase was increased and the population in S phase reduced demonstrating a block in G1 to S transition under PHD3 inhibition. In line with this, the level of hyperphosphorylated retinoblastoma protein Rb was reduced by PHD3 knock-down in hypoxia. PHD3 loss led to increase in cyclin-dependent kinase inhibitor p27 expression but not that of p21 or p16. The data demonstrated that increased PHD3 expression under hypoxia enhances cell cycle progression and survival of carcinoma cells.

The HIF prolyl hydroxylases (PHDs/EGLNs) are central regulators of the molecular responses to oxygen availability. One isoform, PHD3, is expressed in response to hypoxia and causes apoptosis in oxygenated conditions in neural cells. Here we show that PHD3 forms subcellular aggregates in an oxygen-dependent manner. The aggregation of PHD3 was seen under normoxia and was strongly reduced under hypoxia or by the inactivation of the PHD3 hydroxylase activity. The PHD3 aggregates were dependent on microtubular integrity and contained components of the 26S proteasome, chaperones, and ubiquitin, thus demonstrating features that are characteristic for aggresome-like structures. Forced expression of the active PHD3 induced the aggregation of proteasomal components and activated apoptosis under normoxia in HeLa cells. The apoptosis was seen in cells prone to PHD3 aggregation and the PHD3 aggregation preceded apoptosis. The data demonstrates the cellular oxygen sensor PHD3 as a regulator of protein aggregation in response to varying oxygen availability.