Search

Bakgrunn: I kroppen dannes reaktive oksygenforbindelser (ROS) i så godt som alle typer celler og vev, hvor de utfører mange ulike og viktige funksjoner. I denne sammenheng ansees enzymer kalt NADPH oksidaser (NOX-enzymer) som de viktigste bidragsyterne. ROS som blir produsert av disse enzymene i tykktarm, kan ha viktige funksjoner både som forsvarsmekanisme og for å opprettholde en sunn tarm. Likevel er det uklart nøyaktig hvilke effekter eller roller disse forbindelsene har i ulike situasjoner, spesielt NOX1-generert ROS. Hensikt: Av den grunn ønsket vi å undersøke hvordan fravær av NOX1 påvirker ROS-produksjon, tykktarmsinflammasjon, intestinal barrierefunksjon og sykdomsgrad, i en situasjon hvor epitellaget i tykktarm har blitt utsatt for en mild irritasjon/inflammasjon. For å kunne gjøre dette, måtte det først etableres en modell som gjenskapte den ønskede situasjonen, hvor mus ble brukt som modellorganisme. Metoder: For å etablere en lavgrads inflammasjonsmodell i tykktarm, ble villtypemus eksponert for ulike doser av kjemikalie dextran sulfate sodium (DSS) i drikkevann. Etter to innledende forsøk, ble den etablerte modellen anvendt på NOX1 knockout- og villtypemus (1 % DSS, seks dager). For å evaluere eventuelle forskjeller mellom dyrene, ble det gjort ulike observasjoner og analyser. Disse inkluderte evaluering av synlig sykdomsgrad under forsøkene, måling av ROS-produksjon ved optisk avbildning, ekspresjonsanalyser av inflammasjons- og ROS-relaterte gener, og estimering av Lcn-2- og LBP-nivåer i henholdsvis avføring og blod. Resultater: Resultatene viste at fravær av NOX1 i liten grad påvirket synlig sykdomsgrad, ekspresjon av inflammasjonsrelaterte gener eller tarmbarrierens gjennomtrengelighet i den etablerte modellen. Det ble imidlertid observert forhøyede nivåer av den sensitive inflammasjonsmarkøren Lcn-2 i avføring i NOX1 knockoutmus sammenlignet med villtype. I tillegg viste optisk ex vivo-avbildning med den sensitive ROS-proben L-012, at ROS-produksjonen var kraftig redusert i knockoutmus, både med og uten DSS-eksponering. Konklusjon: Til sammen gav resultatene en viss indikasjon på at NOX1-generert ROS har en positiv effekt ved lavgrads, DSS-indusert tykktarmsinflammasjon. Nøyaktig hvilke mekanismer som fører til den positive effekten er derimot uklart, og krever videre undersøkelser. En naturlig videreføring av prosjektet vil være å undersøke om fravær av NOX1-generert ROS fører til endringer i tykktarmens mikrobiotasammensetning, som tidligere observert for nedre del av tynntarm. Background: Virtually all cells throughout the body produce reactive oxygen species (ROS), where they perform many important and different functions. In this regard, enzymes called NADPH oxidases (NOX enzymes) are the most important contributors. ROS produced by these enzymes in the colon, may have important functions both as a defense system and for maintaining a healthy gut. Nevertheless, it is unclear exactly which effects or roles these compounds have in different settings, especially NOX1-generated ROS. Aim: We therefore aimed to explore how knockout of NOX1 affects ROS-production, colon inflammation, intestinal barrier function and disease severity in a situation where the colon epithelium is subject to a mild irritation/inflammation. To do this, we first had to establish a model that mimicked this situation, where mice were chosen as model organism. Methods: To establish the low-grade inflammation model in colon, we exposed wildtype mice to different doses of dextran sulfate sodium (DSS). After the initial experiments, the established model was applied on NOX1 knockout and wildtype mice (1 % DSS, six days). To evaluate differences between the mice, different observations and analyses were done. These included visible disease evaluation during the experiments, measurement of ROS production by optical imaging, gene expression analyses of inflammatory and ROS-related genes, and estimation of Lcn-2 and LBP levels in feces and blood, respectively. Results: Our results showed that the absence of NOX1 to minimal degree affects disease severity, expression of inflammatory genes and the intestinal permeability in the established model. We did however observe increased levels of the sensitive inflammation marker Lcn-2 in feces, when comparing DSS-exposed knockout and wildtype animals. In addition, we observed that the ROS production, measured by optical imaging with the ROS-sensitive probe L-012, was substantially reduced in knockout mice, both with and without DSS-exposure. Conclusion: Our findings suggest that NOX1-generated ROS have a positive effect during low-grade, DSS-induced colon inflammation. However, exactly which mechanisms that lead to the positive effect are still unclear and require further investigation. A natural continuation of the project could be to investigate whether the absence of NOX1-generated ROS leads to changes in colon microbiota composition, as previously seen in the lower part of the small intestine. M-BIOTEK

Bakgrunn: Metabolsk syndrom er sterkt knyttet til fedme hvor vanligste årsak er høyfettdietter og sedativ livsstil. Fedme fører til lavgradsinflammasjon i fettvev og lever og er pådriver for insulinresistens og MetS. Belgvekster slik som favabønner blir benyttet i behandling og forebygging av T2D, da de er funnet å inneholde komponenter som bedrer insulinresistens. I de seinere årene er det funnet at reaktive oksygen forbindelser (ROS) har en medvirkende rolle i opprettholdelse av homeostasen i tarmen. Det er sett at ved forhøyet bakterievekst i tarm vil NOX1 enzymet i samspill med iNOS sørge for ROS produksjon med antimikrobiell effekt i tynntarm. Det er også funnet at tarmens mikrobiota, barrierefunksjoner og inflammasjonstilstand spiller en viktig rolle i utviklingen av fedme og metabolske sykdommer. Høyfettdietter er funnet å føre til metabolsk endotoksemi som er en tilstand hvor økt tilstedeværelse av gramnegative endotoksinproduserende bakterier aktiverer immunsystemet og bidrar til systemisk inflammasjon med metabolsk syndrom som følge. Hensikt: Med denne oppgaven skulle det undersøkes om det var noen effekt av høyfettdiett med og uten favabønner på barrierefunksjon i tynntarm hos NOX1KO mus og om en eventuell svikt i barrieren ville føre til økt lekkasje av endotoksiner, endring i kroppsvekt, leverfett og insulinresistens. Metode: For å oppnå rask vekt oppgang og metabolske forandringer ble våre C57BL/6 hannmus fôret ad libitum med en 60% høyfettdiett med eller uten favabønner. Etter 9 uker på diett ble ROS målt ved hjelp av in vivo avbildning etter IP injeksjon av L-012 probe. Etter 10 uker ble blodprøver tatt fra leggvenen etter 5 timers faste for å evaluere insulinresistens ved blodglukose og plasma insulin. Etter anestesiinjeksjon ble hjertepunktur utført før terminering i uke 14. Blod ble benyttet til serum LBP analyse og til slutt ble levervev høstet for kvantifisering av triglyserider. Blodglukosen ble målt ved hjelp av en accu check glukosemåler. Insulin, LBP og TAGs ble analysert ved hjelp av ELISA. Resultat: Etter 14 uker viste alle de fire eksperimentelle gruppene (VT HF, VT HF+FB, NOX1KO HF, NOX1KO HF + FB) signifikant vektoppgang som følge av høyfettdiett med eller uten favabønner. Selv om det ikke ble funnet noen signifikante forskjeller ble det vist ved energiomdannelse at genotype kan utgjøre en liten forskjell, at intakt ROS produksjon via NOX1 fører til høyere vektoppgang på mindre mengder fôr særlig for favabønne - gruppen. In vivo avbildning bekreftet redusert lyssignal fra mageregion hos NOX1KO mus. Mellom VT gruppene ble det funnet en svak trend til at høyfettdietten med Favabønner bidro til redusert lyssignal sammenlignet med ren høyfett diett. Sammenlignet med kontolldyr på standard lavfettdiett ble det funnet høyere grad av insulinresistens hos alle mus i de eksperimentelle gruppene, det ble videre ikke sett noen korrelasjon mellom vekt og HOMA indeks som antyder at effekten kan komme fra høyfettdietten. Det ble funnet signifikante forskjeller mellom genotypene ved målte triglyserider i levervev. NOX1KO mus viste seg å være mer utsatt for akkumulering av TAGs, også her ble det funnet en svak trend til lavere TAGs i favabønne gruppen. Korrelasjon mellom vekt og mengde TAG ble ikke funnet, til tross for at de tyngre musene hadde blekere utseende på levervevet. Alle mus viste ekstremt høye LBP verdier i serum, inkludert kontrollgruppen på standard lavfett. Resultatet kunne derfor ikke gi oss noe informasjon vedrørende tilstedeværelse av endotoksiner og effekt av NOX1 eller favabønner. Konklusjon: På tross av få signifikante funn ble det likevel sett en trend til at ROS produsert via NOX1 kan ha en betydning for utviklingen av metabolsk syndrom ved en intervensjon med høyfettdiett med eller uten favabønner. Background: Metabolic syndrom is strongly connected to obesity usually caused by high fat diets and a sedentary lifestyle. Obesity creates a low-grade inflammation in adipose and liver tissue and causes insulin resistance and MetS. Legumes, such as favabeans are being used both preventive and in treatment of T2D as legumes has been found to contain components that ameliorate insulin resistance. Resent research has discovered that reactive oxygen species (ROS) has a contributing role in maintaining the gut homeostasis. It has been shown that iNOS and NOX1 enzymes collaborate to decrease bacterial growth by their production of antimicrobial ROS. It has also been discovered that the guts microbiota, barrier functions and state of inflammation has a crucial role in the development of obesity and metabolic syndrome. High fat diets has been shown to create a condition known as metabolic endotoxemia where the presence of gram- negative- endotoxin producing bacteria contributes to a systemic inflammation with metabolic syndrome as a result. Aim: The purpose with this research was to investigate whether there was any effect of the high fat diet with and without fava beans on gut barrier function in NOX1KO mice. And further if a potential barrier breach would lead to increased leakage of endotoxins, change in body weight, liver fat and insulin resistance. Method: To achieve rapid weight gain and metabolic changes, our C57BL / 6 male mice were fed ad libitum with a 60% high-fat diet with or without fava beans. After 9 weeks on the diet, ROS was measured by in vivo imaging after IP injection of the L-012 probe. After 10 weeks, blood samples were taken from the leg vein after 5 hours of fasting to evaluate insulin resistance by blood glucose and plasma insulin. Following anesthesia injection, cardiac puncture was performed before termination at week 14. Blood was used for serum LBP analysis and finally liver tissue was harvested for quantification of triglycerides. Blood glucose was measured using a Accu Check glucose meter. Insulin, LBP and TAGs were analyzed by ELISA. Result: After 14 weeks, all four experimental groups (VT HF, VT HF + FB, NOX1KO HF, NOX1KO HF + FB) showed significant weight gain due to high-fat diet with or without fava beans. Although no significant differences were found, it was shown by energy conversion that genotype can make a small difference, that intact ROS production via NOX1 leads to higher weight gain on smaller amounts of feed especially for the fava bean group. In vivo imaging confirmed decreased light signal from the abdominal region in NOX1KO mice. Between the VT groups, a slight trend was found that the high-fat diet with Fava beans contributed to a reduced light signal compared with a pure high-fat diet. Compared with control animals on the standard low-fat diet, a higher prevalence of insulin resistance was found in all mice in the experimental groups, no correlation was seen between weight and HOMA index, which suggests that the effect may come from the high-fat diet. Significant differences were found between the genotypes when triglycerides in liver tissue was measured. NOX1KO mice were found to be more prone to accumulation of TAGs, a slight trend for lower TAGs in the fava bean group was also found. Correlation between weight and TAG was not found, despite the heavier mice having a paler appearance on the liver tissue. All mice showed extremely high serum LBP values, including the standard low-fat control group. The assumption that our result is incorrect makes us in no position to evaluate the effect of NOX1 or fava beans on the potential endotoxins produced. Conclusion: The results from this study did not show us many significant findings, although several trends support the theory that the ROS produced by NOX1 is important regarding the development of metabolic syndrome induced by high fat diets with or without favabeans. M-MAT