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The flat oyster, Ostrea edulis, is the European endemic oyster species. Its production has been reduced because of overfishing and diseases including bonamiosis. Massive mortalities observed on the Pacific cupped oyster these last years explained the wish of shellfish farmers to diversify their production and their revival of interest for this patrimonial oyster species. However, bonamiosis due to the protozoan, Bonamia ostreae, is still a major problem for the production of this species. Measures to control the disease are limited and require a better knowledge of the interactions between the flat oyster and the parasite. Previous studies have suggested the involvement of apoptosis in flat oyster defense mechanisms against B. ostreae. This mechanism is involved in various biological mechanisms including defense against pathogens. In this context, the main objective of this PhD work was to better characterize the involvement of the apoptosis during interactions between the flat oyster and the parasite B. ostreae. In a first step, some tools were developed in order to study the apoptotic process at the cellular level using flow cytometry and microscopy as well as at the molecular level by measuring apoptotic gene expression. In a second step, these tools were used to study O. edulis-B. ostreae interactions in vitro and in vivo. Obtained results confirm the involvement of apoptosis in the response of the flat oyster to B. ostreae and demonstrate the ability of the parasite to inhibit the apoptosis pathway in order to survive and multiply within the hemocytes. Finally, the apoptotic response has been investigated in the flat and Pacific oysters after exposure to diverse micro-organism: OsHV-1, Vibrio aestuarianus and micro-algae., L’huître plate, Ostrea edulis, est l’espèce d’huître endémique européenne. Sa production est aujourd’hui réduite en raison de surpêches historiques et de maladies dont la bonamiose. En raison des fortes mortalités observées chez l’huître creuse ces dernières années les conchyliculteurs tendent à vouloir diversifier leur production et manifestent un regain d’intérêt pour cette espèce patrimoniale. Néanmoins, la bonamiose, maladie due au parasite protozoaire, Bonamia ostreae, reste un problème majeur pour la production de cette espèce. Les moyens de lutte contre cette maladie sont limités, mais nécessitent de meilleures connaissances sur les interactions entre l’huître plate et le parasite. De précédentes études ont suggéré que l’apoptose est activée par l’huître plate pour se défendre contre le parasite. Ce mécanisme est connu pour être impliqué dans de nombreux processus biologiques dont la défense contre des organismes pathogènes. Dans ce contexte, l’objectif général de ce travail de thèse est de mieux caractériser l’implication de l’apoptose dans la réponse de l’huître plate à une infection à B. ostreae. Des outils ont tout d’abord été développés afin d’étudier le processus apoptotique d’un point de vue cellulaire en cytométrie en flux et microscopie ainsi que d’un point de vue moléculaire en mesurant l’expression de gènes impliqués dans l’apoptose. Ces outils ont alors été utilisés pour étudier les interactions entre O. edulis et B. ostreae in vitro et in vivo. Les résultats obtenus confirment l’implication de l’apoptose dans les mécanismes de défense de l’huître plate en réponse à B. ostreae et mettent en évidence la capacité du parasite à déjouer ce mécanisme afin de survivre et se multiplier dans les hémocytes. Enfin, la réponse apoptotique a été appréhendée chez l’huître plate et l’huître creuse dans le cadre d’expositions à divers micro-organismes : OsHV-1, Vibrio aestuarianus et des micro-algues

The history of the French oyster production highlights the fragility of this production against overexploitation and disease outbreaks. In particular, the production of flot oyster, Ostrea edulis, has decreased following the emergence of two parasitic diseases including bonamiosis. The means to fight against bonamiosis are relatively limited. They are mainly based on oyster health surveillance to limit the spread of the disease. However, the use of predictive models of disease progression in infected area would help to improve stock management and minimize the impact pathogens. Moreover the development of resistant animais could help to revive this production. These different approaches require appropriate diagnostic tools, a good knowledge of the life cycle of the pathogen, and the interactions between the parasite and its host. In this context, the main objective of the phD work is to understand the interactions between the fiat oyster Ostrea edulis and the parasite Bonamia ostreae, and particularly the molecular basis of the resistance to the parasite. In a first step, a subtractive cDNA bank allowed the identification of ESTs differentially expressed in haemocytes in response to the parasite. Expression of some genes, among which a galectin, was measured by Real lime PCR in the context of in vitro infections. In addition, the cellular response was investigated by flow cytometry and the infection was checked by microscopy. These experiments showed a multiplication of the parasite inside haemocytes assoclated with a decreased of esterases and of the production of ROS. In a second step, a comparative approach was carried out between a population of oysters resistant to bonamiosis and a natural population. Results suggest that modulation of apopotosis and decrease of phagocytosis could be involved in mechanisms related to resistance to bonamiosis. This work is the first study on the response of haemocytes of fiat oysters to an infection with the parasite Bonamia ostreae at the cellular and molecular levels., L'histoire de l'ostréiculture française met en évidence la fragilité de cette production face à la surexploitation des stocks et l'apparition de maladies. En particulier, la production d'huître plate, Ostrea edulis, a fortement diminué suite à l'apparition de deux maladies parasitaires dont la bonamiose. Les moyens de lutte contre la bonamiose sont relativement restreints. Ils sont essentiellement basés sur la surveillance de la santé des huîtres afin de limiter la dissémination et la propagation de la maladie. Cependant l'utilisation de modèles prédictifs de l'évolution de la maladie en zone infectée permettrait d'optimiser la gestion des stocks et minimiser l'impact des agents pathogènes. De plus, le développement d'animaux résistants à l'infection pourrait permettre de relancer cette production. Ces différentes approches nécessitent des outils diagnostiques adaptés, une bonne connaissance du cycle de vie de l'agent pathogène, et, plus particulièrement des interactions du parasite avec son hôte. Dans ce contexte, l'objectif principal du travail de thèse proposé est de comprendre les interactions entre l'huître plate Ostrea edulis et son parasite Bonamia ostreae, et. plus particulièrement les bases moléculaires de la résistance au parasite. Dans un premier temps, la réalisation d'une banque soustractive d'ADNc a permis d'identifier des ESTs différentiellement exprimées chez des hémocytes en réponse au parasite. L'expression de certains gènes dont une galectine a été mesurée en PCR en temps réel dans le contexte d'infections in vitro. En complément, la réponse cellulaire a été étudiée par cytométrie en flux et l'infection contrôlée en microscopie. Ces expériences ont montré une multiplication parasitaire dans les hémocytes au cours du temps associée à une diminution de la production d'EOR et d'estérases. Dans un second temps, il a été entrepris une étude comparative entre une population d'huîtres plates résistantes à la bonamiose et une population naturelle. Les résultats obtenus tendent à montrer qu'une modulation de l'apoptose et une diminution de la phagocytose seraient impliquées dans les mécanismes liés à la résistance à la bonamiose. Ce travail est le premier à étudier la réponse des hémocytes d'huîtres plates à une infection par le parasite Bonamia ostreae au niveau cellulaire et moléculaire.

L’objectif de ce rapport est de détailler les productions d’huîtres plates européennes, Ostrea edulis, dans le cadre des projets de recherche développés autour de l’amélioration génétique de cette espèce. Nous avons choisi de synthétiser les actions de recherche dans un premier temps puis la production des huîtres et les expérimentations dans un ordre chronologique.

L'huître plate européenne Ostrea edulis a connu une période faste dans l'aquaculture jusqu'à la fin des années 1960, lorsque deux parasites, Marteilia refringens (1969) et Bonamia ostreae (1979), ont successivement décimé les bancs naturels de cette espèce endémique, déjà affaiblis par la sur-exploitation de ses gisements. Historiquement présente sur toute la côte européenne, de la Mer du Nord à la Mer Méditerranée, en passant par l'Océan Atlantique, la Mer Adriatique et la Mer Noire, les bancs naturels de cette espèce sont devenus très localisés, laissant penser à des phénomènes d'adaptation locale de l'huître vis à vis de son environnement biotique et abiotique. La diversité et la structuration génétique de plusieurs populations de l'espèce, à l'échelle de son aire de distribution géographique, a déjà été caractérisée au moyen de plusieurs types de marqueurs moléculaires (allozymes, marqueurs mitochondriaux, microsatellites). Une différenciation génétique par isolement par la distance, entre les populations naturelles de la façade Atlantique et celles de la zone méditerranéenne a été rapportée au dernier événement glaciaire, mais la potentielle adaptation locale de ces populations a été jusque-là ignorée. Dans ce contexte, nous avons choisi de combiner l'information apportée par des marqueurs moléculaires déjà disponibles (mitochondriaux et microsatellites) et de développer des marqueurs de type SNPs, par séquençage direct de plusieurs portions de gènes chez des individus provenant de différentes populations naturelles de l'espèce. Les gènes étudiés proviennent de librairies de gènes candidats identifiés comme potentiellement impliqués dans la résistance ou la sensibilité à la bonamiose (maladie due à B. ostreae). Le génotypage de ces marqueurs devrait permettre d'augmenter la couverture du génome et la probabilité de détecter des « outliers » afin de mettre en évidence une potentielle sélection des allèles identifiés sur les gènes ciblés ou sur les autres marqueurs. Pour cette étude, sept populations de O. edulis, isolées géographiquement, ont été choisies afin d'identifier de potentielles traces de sélection et d'adaptation locale.

The French ostreiculture history highlights the fragility of its production caused by stocks overexploitation and diseases. Particularly, the flat oyster production decreased a lot after the appearance of two parasitic diseases: marteilliose and bonamiose. The bonamiose is due to a parasite Bonamia ostreae. The study of interactions between the parasite and oysters hemocytes with flow cytometry allowed to identify modifications of hemocytes activities wh en active parasite is present. On the other hand, inactive parasite does not induce modification for the same hemocyte's activities. Finally, a new study approach, subtractive and suppressive hybridization, has been undertaken in order to identify genes expressed by hemocytes and parasites during in vitro infections., L'histoire de l'ostréiculture française met en évidence la fragilité de cette production face à la surexploitation des stocks et l'apparition de maladies. En particulier la production d' huître plate, Ostrea edulis, a fortement diminué suite à l'apparition de deux maladies parasitaires: la marteilliose et la bonamiose. Cette dernière est due au parasite Bonamia ostreae. L'étude des interactions entre le parasite et les hémocytes en cytométrie en flux a permis d'identifier des modifications des activités hémocytaires en présence de parasite actif. En revanche le parasite inactif n'induit pas de modification des activités mesurées. Une approche en hybridation soustractive sup~ressive a été initiée afin d' identifier des gènes exprimés par les hémocytes et le parasite au cours d'une infection in vitro.

L'ostréiculture représente une part économique régionale et française importante avec une production d'environ 117 106 Tonnes de coquillages par an (FAO, 2003). Cependant le développement de cette activité peut être limité par des mortalités, parfois massives, dues à des maladies infectieuses. L'huître plate Ostrea edulis a subi deux maladies majeures : la Marteiliose due à Marteilia refringens et la Bonamiose due à Bonamia ostreae. Ces maladies à déclaration obligatoires ont fait chuter la production de 20 000 tonnes dans les années 70 à 2 098 Tonnes aujourd'hui. Suite à ces mortalités, différents programmes de recherche ont été lancés par Ifremer pour tenter de préserver voire de relancer la culture de l'huître plate. Un de ces programmes concerne la Bonamiose, maladie due au protiste Bonamia ostreae. Le diagnostic de la maladie repose essentiellement sur deux techniques : cytologie par appositions de tissus cardiaques et de branchies ainsi que l'histologie. Cependant la sensibilité de ces techniques reste relativement faible et ne permet pas de détecter une pré infection ou une infection peu intense et ces outils ne permettent pas de différencier des parasites proches morphologiquement. Des outils de biologie moléculaire telles que l'hybridation in situ ou la PCR ont été développés afin d'améliorer la spécificité et la sensibilité du diagnostic de la bonamiose. Néanmoins, pour garantir les résultats apportés pour de telles techniques, il est indispensable de les valider. Lors de ce stage, je me suis donc attaché à valider et optimiser une technique de PCR ciblant le gène de l'ARN 18 S du parasite, mise au point pour le diagnostic de Bonamia ostreae chez l'huître plate. La portion ITS (Internal Transcript Segment) segment localisé entre les gènes codant les ARNs de la petite sous-unité ribosomale 18S et 5,8S a été également étudiée afin d'apprécier sa variabilité et son éventuel intérêt pour le développement d'outils moléculaires plus spécifiques.

Le but de ce travail était de rechercher des marqueurs non neutres afin de comparer ces données obtenues avec celles données par les marqueurs précédemment étudiés (marqueurs neutres ou supposés l'être à savoir microsatellites, enzymatique et mitochondriales). Dû à des soucis d'ADN extrait des populations qui avaient été étudiées jusqu'alors, il a fallu effectuer un nouvel échantillonnage de l'huître plate Européenne, Ostrea edulis, sur son aire de répartition. Nous avons donc analysé en plus du but majeur, les données microsatellites pour ces nouvelles populations de manière à avoir un jeu de données de marqueurs non neutres. Ces analyses ont ainsi complété l'arbre phylogénétique déjà existant, et ont confirmé dans une moindre mesure puisque tous les microsatellites n'ont pas été analysés ici, les données mitochondriales, à savoir que les populations appartenant aux extrêmes de l'aire de répartition (Norvège et Mer Noire) semblent être liées. A la suite de ce travail, un seul marqueur présentant du polymorphisme a été trouvé. Ce fragment du gène de la Métallothionéine faisant 389 pb environ présente 6 substitutions, dont une dans un exon changeant ainsi l'acide aminé de la protéine. Les tests de neutralité effectués sur ce gène ne présentent pas de résultats significatifs malgré la présence de génotypes quasi spécifiques départageant les populations Atlantiques de celles Méditerranéennes. Ce gène ne serait donc pas soumis à la sélection. Aucune corrélation entre ces deux types de marqueurs ont été mis en évidence. Ce marqueur contribuera par ailleurs à la réalisation de la cartographie de cette espèce qui est actuellement en cours.

PCR-based DNA markers enable the study of diversity and differentiation of marine organisms at different stages of their life cycle. Our study of European fiat oyster (Ostrea edulis) populations aimed to describe their spatial and temporal dynamics. First, we analyzed adults sampled over the natural range of the species. An Atlantic/Mediterranean differentiation pattern was observed. Similar patterns of variation were found using allozymes, microsatellites and mitochondrial DNA, aIl which support an isolation by distance model. High variability was observed in the range of diversity between populations using a mitochondrial marker, a reflection of small effective population sizes in sorne locations. A 10fold quantitative difference was observed in Fst, between the genomes, which may be due to an unbalanced sex ratio and/or differential reproductive success. Secondly, we initiated the study of reproductive dynamics at a finer scale. Several experiments were performed to document: 1- the variance inallele frequencies during a natural settlement period, 2- the paternal contribution to fertilization by analyzing larvae sampled at the brooding stage within individual females, 3- the individual reproductive success within an experimental population. Our results are relevant in terms of management of the genetic diversity and the potential impact of hatchery propagation., Les marqueurs génétiques basés sur la technique de PCR permettent l'étude de la diversité et de la différenciation des populations d'organismes marins à différents stades de leur cycle de vie, dès la phase larvaire. Notre étude sur l'huître plate européenne avait pour but de décrire la dynamique spatiale et temporelle de la diversité génétique présente chez cette espèce. Dans un premier temps, nous avons analysé des adultes échantillonnés sur l'ensemble de J'aire de répartition. Les résultats sont qualitativement similaires quels que soient les marqueurs utilisés (al1ozymes, microsatellites et ADN mitochondrial), validant l'existence d'un modèle d'isolement par la distance. Une différenciation significative entre populations atlantiques et méditerranéennes est démontrée. Cependant, une différence d'un facteur 10 sur le niveau de différenciation des populations a été mise en évidence entre marqueurs des génomes mitochondrial et nucléaire. Cette différence pourrait s'expliquer par un sex-ratio déséquilibré et/ou une plus grande variance dans le succès reproducteur femelle. De plus, une forte variabilité du niveau de variabilité a été observée entre populations pour l'ADN mitochondrial, indice de tailles efficaces femel1es localement réduites. Dans un second temps, nous nous sommes intéressés à une échelle plus fine, celle de la population, et plus particulièrement à sa dynamique de reproduction. Plusieurs volets ont été abordés dans le cadre de ce travail: 1- la variance des fréquences alléliques au cours d'une saison de recrutement, 2- les contributions paternelles en réalisant des échantillonnages de larves encore non émises de femelles incubantes, 3- le succès reproducteur individuel au sein de populations d'écloserie. Ces résultats seront discutés en terme de gestion de la diversité génétique de cette espèce et de l'impact potentiel du développement de la production de naissain d'écloserie.

Le milieu marin est un milieu difficile à appréhender car composé d'un ensemble d'organismes et d'écosystèmes caractérisés par des conditions de fonctionnement tout à fait originales et souvent difficiles d'accès. Ces spécificités peuvent être attribuées à la structure spatiale du milieu marin, qui à bien des égards, diffère du milieu terrestre. En effet si les notions de barrières géographiques sont une réalité concrète pour les organismes terrestres, elles restent rarement identifiées en milieu marin (PALUMBI 1994). Dans un tel environnement, les organismes présentent des cycles de vie souvent mal connus, notamment ceux qui associent phase benthique et phase planctonique. L'étude de la structure génétique des populations, dans un espace aussi ouvert aux échanges et aux flux migratoires permet de mieux comprendre l' histoire biologique d'une espèce. Il apparaît en effet qu'une description de la variabilité génétique des populations naturelles et de son organisation permet d'approfondir considérablement la connaissance de mécanismes directement liés à l'organisation et l'évolution des espèces (migration, mutation, sélection, dérive). D'autant qu'il est désormais possible de s'appuyer sur des marqueurs moléculaires neutres et hautement polymorphes comme les microsatellites. D'une manière plus globale, la caractérisation de cette variabilité intervient au sein même des problématiques de gestion des ressources génétiques concernant notamment les populations soumises à une exploitation économique.

Bonamia ostreae, l'agent de la bonamiose, est un parasite intracellulaire ayant pour cible les hémocytes (cellules du système de défense) de l'huître plate ostrea edulis. Il induit chez son hôte des lésions branchiales, telles que des perforations ou des indentations pouvant aller jusqu'à la mort du mollusque. Le travail réalisé au cours de ce stage s'inscrivait dans une démarche de validation de méthode de PCR (Polymerase Chain Reaction) pour la détection de ce parasite. Les analyses ont porté sur un lot de trois cent onze huîtres plates ostrea edulis adultes (2-3 ans), issus de captage naturel et provenant de Quiberon (Bretagne). Pour chaque individu, une extraction d'ADN a été réalisée sur un échantillon de coeur et de branchies. Afin de déterminer si l'ADN extrait n'a pas été dégradé et serait à même d'être amplifié, chaque échantillon a été analysé en PCR universelle utilisant des amorces Csi-Casl (s'hybrident à l'ADN codant l'ARNr de la petite sous-unité ribosomale). 211 individus présentant des résultats positifs en PCR universelle ont été analysés en PCR pour la détection de parasite du genre Bonamia en utilisant les amorces Bo-Boas. 25.6% de ces individus présentent des résultats positifs pour le coeur et/ou les branchies. La fréquence de détection du parasite dans les échantillons de coeur et de branchies est respectivement de 13.7% et 21.8%. Pour ces mêmes individus, la lecture d'appositions de coeur et de branchies révèle une parasitose de 9.5%, avec autant d'échantillons de coeur et de branchies positifs. Un plus grand nombre d'individus a été retrouvé positif en PCR qu'en apposition, car cette technique est plus sensible. De plus, comparés aux données antérieures, les résultats en apposition du lot analysé dans le cadre de ce stage (9.5%) sont faibles.

In order to understand better some fundamental aspects of the bivalve biology, one has to pay attention to the variance of their breeding success, the time structure of the populations and their effective size. An abundant literature shows the existence of a heterozygote deficit as well as positive relationships between heterozygoty and fitness components. This last point is the subject of explanatory hypotheses which have never been clearly decided between until now. One of these hypotheses is the possible existence of a certain degree of inbreeding among those populations. This is only possible in the case of separated colonies coming from a small amount of spawners, thus creating blood relations between individuals recruited from the same area, and consequently a restricted local effective stock and the inbreeding of their offspring. In order to go deeper into this hypothesis, the interactions between genetics and demography at a population level have been studied on flat oyster larvae, spats and adults, through the analysis of five microsatellite markers. ..., Chez les Bivalves, la variance du succès reproducteur, la structure temporelle des populations et leur taille efficace sont autant d'éléments dont la connaissance est indispensable pour comprendre certains aspects fondamentaux de leur biologie. En particulier, une abondante littérature montre l'existence de déficits en hétérozygotes et de relations positives entre hétérozygotie et composantes de la valeur sélective. Ce dernier point fait l'objet d'hypothèses explicatives qui n'ont pas été clairement départagées jusqu'à présent. Une de ces hypothèses est l'existence possible d'un certain niveau de consanguinité dans les populations. Ceci n'est possible que s'il existe des cohortes séparées issues d'un nombre restreint de géniteurs, créant ainsi de l'apparentement entre individus recrutés au même endroit, et donc un effectif efficace local réduit et de la consanguinité dans leur descendance. Afin d'approfondir cette hypothèse, les interactions entre génétique et démographie à l'échelle de la population ont été étudiées chez des larves, naissains et adultes d'huître plate, grâce à l'analyse de 5 marqueurs microsatellites. Nous avons réalisé trois études complémentaires qui nous ont permis d'étudier : - la variance des fréquences alléliques au cours d'une saison de recrutement dans une population naturelle Les tailles efficaces des populations ont été estimées en comparant la variabilité observée dans les 3 cohortes recrutées à celle observée chez les adultes. - les contributions paternelles en réalisant des échantillonnages de larves non encore émises de femelles incubantes. La variabilité génétique de chaque "portée" (famille maternelle) a été analysée et comparée avec la variabilité observée au sein de la population adulte. - la variance du succès reproducteur individuel au sein d'une population expérimentale en écloserie.

The fact that molluscs from the Mediterranean have benefited from a privileged zoosanitary condition compared to those of the other French coasts has for a long time limited the control of farms and natural fields in this area. It is only in the early 70's, because of the pathological problems and risks observed in other areas that Mediterranean molluscs started to be stictly under zoosanitory control. This control was however limited until the early 90's. With the implementation of the European directives 91/67 and 95/70 for the protection of molluscs against diseases and their propagation, with the creation in 1992 of REPAMO- IFREMER (with a watch unit in the Mediterranean), the control of molluscs in the Mediterranean has considerably improved. Since 1995 more than 2,000 marine bivalve molluscs have been annually controlled. More than 3,300 in 1997. The detection of infectious agents liable to explain the etiology of death rate or disease has been performed on the main species presenting a commercial interest. All the farms and natural fields in the Mediterranean have been examined, especially since 1993. The results covering 13 years are presented here., La considération d'une situation zoosanitaire privilégiée des mollusques de Méditerranée par rapport à ceux du reste du littoral français a longtemps limité les actions de surveillance des élevages et produits des gisements naturels du secteur. Ce n'est qu'au début des années 70 qu'en raison des problèmes et risques pathologiques observés sur les autres secteurs, les mollusques de Méditerranée ont fait l'objet d'un suivi zoosanitaire. Suivi qui est toutefois resté réduit jusqu'au début des années 90. Avec la mise en oeuvre des Directives Européennes 91/67 et 95/70 portant en particulier sur la protection des cheptels contre les maladies (leur propagation) et avec la création en 1992 du Réseau de Pathologie des Mollusques (REPAMO - IFREMER) dont une cellule de veille zoo sanitaire a été identifiée en Méditerranée, l'effort d'examens sur les mollusques de Méditerranée a considérablement augmenté. Depuis 1995 plus de 2000 mollusques bivalves marins ont été analysés annuellement. Plus de 3300 l'ont été en 1997. La recherche d'agents infectieux susceptibles d'expliquer l'étiologie de mortalités, ou affectant de façon opportuniste les mollusques, a été menée sur les principales espèces présentant un intérêt commercial. Tous les sites d'élevage et de nombreux gisements naturels de Méditerranée ont été examinés surtout à partir de 1993. Les résultats obtenus au cours de 13 années d'examens sont présentés.

Oyster productions represent an important part of the french aquaculture. However, diseases are considered as the first limiting factors for the development of this activity around the world. Two exemples point out this problem for the french flat oyster production: Marteiliosis, the disease of the digestive gland, caused by Marteilia refringens, and Bonamiosis, the hemocytic disease, caused by Bonamia ostreae. This report proposes a bibliography analysis of major results obtained for Bonamiosis studies., L'ostréiculture représente une part importante de l'aquaculture française. Cependant, les pertes liées aux maladies dans ce domaine d'activité sont aujourd'hui considérées comme l'un des principaux facteurs limitants de son développement au niveau mondial. Deux exemples récents suffisent à illustrer ce problème pour l'élevage de l'huître plate française. Il s'agit de la Marteiliose, due au parasite, Marteilia refringens, et de la Bonamiose due à Bonamia ostreae. Ce rapport présente une analyse bibliographique des principaux résultats obtenus concernant l'étude de la Bonamiose.

The European flat oyster Ostrea edulis has been considered as the traditional French oyster for a very long time and has now nearly disappeared from our farms, as a consequence of the two successive epizootic of the Marteilia refringens parasite and Bonamia ostreae. The actual quasi monoculture of Crassostrea gigas has made necessary the search for a diversification in oyster culture, including the search for a new start of the indigenous flat oyster culture. The Ifremer has been conducting parallel works since 1985 in order to better understand the biology of the parasite as well as to try and select different lines of flat oyster resistant to Bonamia ostreae., Longtemps considérée comme l'huître traditionnelle des côtes françaises, l'huître plate européenne Ostrea edulis a quasiment disparu des parcs français, suite aux épizooties successives des parasites Marteilia refringens, puis Bonamia ostreae. La quasi monoculture actuelle de Crassostrea gigas rend nécessaire la recherche d'une diversification de l'activité ostréicole, dont celle des moyens de relance de la culture de l'huître plate indigène. Ifremer mène parallèlement depuis 1985 des travaux pour mieux connaître la biologie du parasite et pour vérifier la possibilité de sélectionner des lignées d'huîtres plates résistantes à Bonamia ostreae.

Within the context of the mollusc pathology monitoring network, this report assesses the follow-up and work done by the zoosanitary unit of Trinité-sur-Mer on the whole of the French farming and bed areas of the North Loire for the year 1999., Dans le cadre du réseau de surveillance de la pathologie des mollusques, ce rapport fait le bilan des suivis et travaux réalisés par la cellule zoosanitaire de la Trinité-sur-Mer, sur l'ensemble des secteurs d'élevage et de gisements français du Nord de la Loire, pour l'année 1999

Marteilia refringens est un protozoaire parasite de l'huître plate Ostrea edulis, à l'origine de mortalités dramatiques en élevage depuis les années 1970. En zone endémique, le seul moyen de contrôle de la marteiliose, est une gestion du risque de contamination. Dans ce cadre, la connaissance du cycle parasitaire de Marteilia refringens est primordiale. Les travaux réalisés à ce sujet ont permis de poser l'hypothèse d'un cycle hétéroxène. Le parasite a été détecté par PCR puis localisé au sein des tissus par hybridation in situ au sein d'une espèce de copépode Calanoide prélevée dans une claire ostréicole. A ce stade, cette espèces peut être considéré comme un hôte de Marteilia refringens. Notre étude consistait à mettre en évidence la dynamique des populations zooplanctoniques et plus particulièrement, suivre la dynamique des espèces de Calanoides au sein de la claire ostréicole, dans le cadre de l'étude de la stratégie du parasite. Dans cet écosystème, le volume réduit des bassins et le renouvellement d'eau de mer limité aux périodes de grandes marées sont à l'origine les variations importantes des paramètres environnementaux (température et salinité), qui limitent le nombre d'espèces pouvant survivre. Les copépodes représentent une grande partie des populations zooplanctoniques de la claire. Des espèces pélagiques ont été observées comme Acartia bifilosa, Acartia clausi Acartia discaudata ou bien Euterpina acutifrons mais leur abondance est faible par rapport au copépode Calanoide Acartia grani. Cette espèce est donc adaptée à ce type d'écosystème confiné. La dynamique temporelle des espèces planctoniques apparaît fortement influencée par la gestion de l'eau des claires.

Un programme de soutien à la conchyliculture était inscrit au contrat Etat-région 1994-1998, intitulé "amélioration des écloseries et soutien à la conchyliculture bretonne". Ce rapport synthétise les résultats acquis au laboratoire Ifremer DRV/RA-LCB de La Trinité-surMer, qui portent sur la surveillance et l'amélioration génétique : 3 volumes plus détaillés traitant du suivi de la croissance, de la surveillance des maladies et d'un système de surveillance biologique de la qualité de l'eau sont joints. La partie relative à la maîtrise des écloseries est rapportée séparément par le laboratoire de physiologie des mollusques d'Ifremer Brest.

Within the context of the mollusc pathology monitoring network, this report assesses the follow-up and work done by the zoosanitary unit of Trinité-sur-Mer on the whole of the French farming and bed areas of the North Loire for the year 1998., Dans le cadre du réseau de surveillance de la pathologie des mollusques, ce rapport fait le bilan des suivis et travaux réalisés par la cellule zoosanitaire de la Trinité sur mer, sur l'ensemble des secteurs d'élevage et de gisements français du Nord de la Loire, pour l'année 1998

La structuration géographique des populations naturelles d'huître plate (Ostrea edulis) a été étudiée à partir de l'analyse du polymorphisme de conformation simple brin (SSCP), d'un fragment d'environ 300 pb du gène de l'ARNr mitochondrial 12S. les échantillons (13 localités, 507 individus) utilisés avaient fait l'objet d'une étude antérieure de structuration des populations avec 5 locus microsatellites. Il ont été analysés ici dans le but d'une comparaison des structurations observées sur marqueurs mitochondrial et nucléaire. La diversité moyenne intrapopulation du gène de l'ARNr 12S (Hn.b = 0,494) est presque la moitié de celle estimée avec les microsatellites (Hn.b = 0,904) bien que la variance entre populations soit beaucoup plus forte pour l'ADN mitochondrial. Il n'exite pas de corrélation significative entre les diversités estimées des deux marqueurs. Le Fst, estimé par le Théta de Wier et Cockerham, est significatif dans l'ensemble de l'échantillonnage (Theta = 0,179) et à l'intérieur de l'Atlantique (Tetha = 0,153) mais pas au sein de la Méditerranée. Il est sept fois plus grand que le Fst estimé avec l'ensemble des locus microsatellites. Les dendrogrames des échantillons obtenus avec les deux corrélations significatives des distances génétiques (mesurées par Theta/(1-Theta)) et géographiques. Nous discutons des causes possibles des différences observées (faible effectif efficace et haploïdie de l'ADN mitochondrial, forts taux de mutation des microsatellites....). De nouveaux échantillons provenant de la Mer Noire montrent une forte différenciation avec les stocks de Méditerranée et d'Atlantique, ainsi que de très faibles diversités haplotypiques. Ces résultats suggèrent un faible flux génique entre ces mers et l'existence d'un goulot d'étranglement récent.

La bonamiose, maladie due au protozoaire Bonamia ostreae a été détectée en 1979 pour la première fois en Bretagne au cours d'épisodes de mortalité. Depuis, cette maladie s'est propagée à tous les centres ostréicoles français, puis européens. Cette étude a pour objectif de décrire les compartiments du modèle B. ostreae/hémocyte de l'huître plates, Ostrea edulis et d'analyser leurs interactions in vivo et in vitro. La caractérisation enzymatique, antigénique et moléculaire du parasite a été réalisée. Ceci a permis de disposer d'une palette de réactifs pour la comparaison de ce parasite avec d'autres protozoaires. Ainsi, un parasite de l'huître creuse chinoise Crassostrea rivularis a té décrit, puis rapproché du genre Bonamia. La morphologie et l'équipement enzymatique des hémocytes totaux et séparés de l'huître plate Ostrea edulis ont été étudiés. L'analyse des fonctions des différents types hémocytaires dans les mécanismes cellulaires a permis de mettre en évidence des différences. En particulier, dans ces travaux, il ressort que les cellules agranuleuses possèdent un équipement enzymatique réduit. Afin d'étudier l'existence d'une corrélation entre le statut de résistance à la bonamiose et la formule hémocytaire de animaux, une comparaison du nombre ds hémocytes totaux et du comptage différentiel des types hémocytaires a été effectuée. Les résultats indiquent que le statut de résistance est associée à une modification de la formule hémocytaire des animaux. En particulier, le pourcentage des cellules agranuleuses est significativement plus faible chez les huîtres sélectionnées que chez les huîtres sensibles. L'analyse in vitro de primocultures d'hémocytes provenant d'animaux sains et parasités montre une diminution des cellules agranuleuses pour les cellules provenant d'animaux infectés. L'ensemble des résultats converge vers l'hypothèse que les cellules agranuleuses sont plus sensibles à l'infection par le parasite B. ostreae que les autres types cellulaires du fait d'un équipement enzymatique réduit.

Depuis la fin des années soixante, la conchyliculture française doit faire face à des mortalités importantes d'huître plate, Ostrea edulis, causées entre autres, par le protozoaire, Bonamia ostreae, responsable de la bonamiose. Peu de moyens sont à l'heure actuelle à la disposition des professionnels pour lutter contre cette maladie. L'obtention d'animaux résistants à cette infection est une voie retenue et explorée par l'Ifremer pour combattre la bonamiose et tenter d'apporter des solutions aux conchyliculteurs. Dans cette optique, l'Ifremer, a entrepris un programme de sélection pour obtenir des animaux résistants en exerçant une pression de sélection par inoculation de parasites purifiés dans la cavité péricardique d'animaux anesthésiés. Les premières études ont porté, au sein de ce programme, sur les hémocytes de l'huître plate, Ostrea edulis. Ces cellules sont en effet intéressantes à étudier, car elles sont à la fois, impliquées dans les mécanismes de défense chez les bivalves et les cellules cibles du parasite Bonamia ostreae. Les travaux réalisés ont montré qu'il semble exister trois types cellulaires dans l'hémolymphe, sur la base de caractères morphologiques et de coloration : les granulocytes, les grands hyalinocytes et les petits hyalinocytes et que les animaux sélectionnés pour leur résistance accrue à la bonamiose possèdent un faible pourcentage de grands hyalinocytes par rapport aux animaux contrôles. Ainsi l'hémogramme (porucentage des trois types hémocytaires) pour un individu semble pouvoir donner une information concernant son état de résistance vis à vis de la bonamiose. Partant de cette observation, il a été émis l'hypothèse que la répartition hémocytaire pour un individu donné pourrait être associée aux mécanismes de résistance vis à vis du parasite Bonamia ostreae, voir même de les expliquer. Pour tenter d'apporter des éléments de réponse à cette hypothèse, deux approches complémentaires ont été envisagées dans ce travail : une approche in vivo et une approche in vitro.

Ce rapport représente la synthèse des travaux réalisés de mars 1996 à février 1997 au laboratoire de Génétique, Aquaculture et Pathologie de la station IFREMER de La Tremblade, dans le cadre de l'étude du virus de type herpès observé chez les huîtres et de la mise au point de méthodes de diagnostic. La majorité des travaux rapportés ici de façon complète, a déjà fait l'objet de comptes rendus intermédiaires.

Les méthodes de classification sont largement utilisées en vision par ordinateur et reconnaissance des formes. La classification floue a d'ailleurs montré de bonnes performances dans ces domaines, non seulement dans la reconnaissance de classes en volume, mais aussi pour des formes fines, des droites, des courbes, et également des surfaces. L'idée est d'utiliser la classification automatique pour tenter de caractériser des types hémocytaires présents dans l'hémolymphe de l'huître plate. Actuellement, trois types d'hémocyte ont été définis, mais la difficulté d'établir un classement des cellules dans ces trois groupes, laisse penser qu'ils ne sont pas exhaustifs. Différentes approches de classification ont été tentées sur des mesures morphométriques de cellules. Ces mesures ont été réalisées à l'aide du logiciel IPS-SAMBA (Système d'Analyse Microphotométrique à Balayage Automatique) de chez Alcatel, sur des lames cytocentrifugées et colorées. Les résultats obtenus n'ont pas permis de confirmer ou d'infirmer l'hypothèse émise par les chercheurs quant au nombre et à la caractérisation des types hémocytaires, mais on cependant permis de réaliser une application d'analyse d'image capable de reconnaître et compter les cellules d'hémolymphe avec une fiabilité relativement bonne.

Dans le cadre du Réseau zoosanitaires CEE (huître plate) et suivi d'autres espèces, 890 individus provenant des zones 5, 6 et 7 ont été examinés sur l'ensemble de l'année 1995 par différentes techniques : 472 analyses sous coupes histologiques, 328 analyses sur appositions d'organes, 90 analyses sur milieu au thioglycolate.

Cette réunion des membres du Réseau Génétique Mollusques avait pour objet de faire un bilan provisoire des actions en cours et surtout de mettre en place les protocoles et les calendriers du début de l'année 1994. La première demi-journée a été réservée à un exposé de Yamama NACIRI sur les bases de la Génétique Quantitative et ses applications dans le cadre des programmes de sélection des mollusques.La deuxième demi-journée a été consacrée au bilan des actions de 1993. Les représentants de chaque site, intervenant dans une opération du réseau en 1993, ont fait une présentation orale de leurs résultats. Un résumé de chaque intervention vous est fourni dans ce document. Il est important de souligner que tous ces bilans sont provisoires, en premier lieu parce que toutes les analyses biochimiques et les contrôles de ploïdie par imagerie numérique ne sont pas achevés, et que d'autre part, les contrôles des performances des populations diploïdes et triploïdes doivent se poursuivre en 1994. En conséquence, il serait hasardeux de statuer sur les avantages ou les inconvénients de la triploïdie sans avoir un suivi complet sur deux années. Actuellement seul le site d'Arcachon, où l'impact de la reproduction a été le plus fort, présente dès la première année des différences significatives entre diploïdes et triploïdes. Ces observations ne sont pas surprenantes puisque les performances des triploïdes ne deviennent théoriquement supérieures à celles des diploïdes, qu'après une réelle période de reproduction. Rappelons que selon Héral & Deslous-Paoli (1989), le poids des gamètes représente 7% de celui de la chair pour l'huître de 1 an, 60% pour celle de 2 ans et 80% à 3 ans. Les présentations ont portées sur: • Bilan des expériences réalisées dans le cadre du programme sélection huître plate Ostrea edulis. • Bilan des expériences réalisées dans le cadre du programme CEE-AIR1 sur l'induction de la triploïdie par rétention du premier ou du deuxième globule polaire. • Recherche de marqueurs génétiques: ~ Clonage et identification de marqueurs génétiques hypervariables (microsatellites) chez Ostrea edulis. ~ Déterminisme génétique du polymorphisme de la pigmentation chez Ruditapes philippinarum. . • Bilan de l'acclimatation et des essais d'hybridation de Crassostrea virginica. • Le prégrosssissement de juvéniles en nurserie intensive. • Bilan de l'acclimatation et des essais d'hybridation de Crassostrea virginica. • L'influence de la polyploïdisation sur les performances de l'huître creuse élevée à différents niveaux trophiques. • Contrôle des performances biologiques de populations diploïdes et triploïdes d'huître plate Ostrea edulis en site profond. • Contrôle des performances biologiques de populations diploïdes et triploïdes d'huître creuse Crassostrea gigas en site profond. • Contrôle des performances biologiques de populations diploïdes et triploïdes d'huître creuse Crassostrea gigas sur estran. • Contrôle des performances biologiques de populations diploïdes et triploïdes d'huître creuse Crassostrea gigas en claire et sur estran. • Bilan des expériences réalisées dans le cadre du programme sélection huître plate Ostrea edulis. • Contrôle des performances biologiques de populations diploïdes et triploïdes d'huître plate Ostrea edulis en site profond. • Contrôle des performances biologiques de populations diploïdes et triploïdes d'huître creuse Crassostrea gigas sur estran. Après un tour de table destiné à faire le bilan du matériel biologique encore vivant dans chaque site, la troisième demi-journée a été consacrée à l'élaboration du calendrier et des protocoles pour l'année 1994.

The genetic structure of populations of the flat oyster Ostrea edulis is described on the basis of multilocus genotypes. This new procedure joined with multivariate analysis of data provides an accurate identification of intrapo-pulationnal subsets as genetic markers in a mixed stock like in the Thau lagoon., La structure génétique des populations de l’huître plate Ostrea edulis est décrite sur la base des génotypes multilocus. Associée au traitement des données de type multivarié, cette nouvelle procédure permet d’identifier les sous-ensembles génétiques intrapopulationnels qui peuvent être repérés dans un échantillon composite résultant de transferts comme dans la lagune de Thau., La estructura genética de las poblaciones de ostra plana Ostrea edulis se describe sobre la base de los genotipos multilocus. Asociado al tratamiento de datos de tipo multivariante, este nuevo procedimiento permite determinar los subconjuntos genéticos intrapoblacionales identificables en una muestra compuesta resultante de transferencias como en la laguna de Thau., Blanc Françoise, Blanc Charles-Pierre. Les structures génotypiques multilocus des populations d'huîtres plates en France . In: Mappemonde, 1987/3. pp. 27-29.