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Here we discuss the developmental and homeostatic conditions necessary for Hydra regeneration. Hydra is characterized by populations of adult stem cells paused in the G2 phase of the cell cycle, ready to respond to injury signals. The body column can be compared to a blastema-like structure, populated with multifunctional epithelial stem cells that show low sensitivity to proapoptotic signals, and high inducibility of autophagy that promotes resistance to stress and starvation. Intact Hydra polyps also exhibit a dynamic patterning along the oral-aboral axis under the control of homeostatic organizers whose activity results from regulatory loops between activators and inhibitors. As in bilaterians, injury triggers the immediate production of reactive oxygen species (ROS) signals that promote wound healing and contribute to the reactivation of developmental programs via cell death and the de novo formation of new organizing centers from somatic tissues. In aging Hydra, regeneration is rapidly lost as homeostatic conditions are no longer pro-regenerative.

L'hydre est un polype d'eau douce à symétrie radiaire appartenant au phylum des Cnidaires. Elle est constituée de deux couches cellulaires et trois types de cellules souches dotées d'une capacité d'auto-renouvèlement indéfini, ce qui la rend immortelle. Depuis 2006, la production d'hydres transgéniques stables est possible mais des promoteurs endogènes inductibles n'ont pas été identifiés. Le but de cette étude est d'identifier un promoteur inductible qui permettrait de diriger l'expression transitoire de gènes placés en aval. Dans ce but, nous nous sommes concentrés sur le gène Hsp70.1 hautement conservé chez les métazoaires et responsable du maintien de l'équilibre homéostatique et de la viabilité de la cellule. Alors que ce gène Hsp70.1 a été décrit comme existant sous forme d'une seule copie, nous avons trouvé que ce gène est en fait présent sous forme d'au moins trois copies chez deux espèces d'hydre, H. oligactis et H. vulgaris. Nous avons aussi localisé une série d'éléments consensus sensibles au choc thermique dans les séquences promotrices des gènes Hsp70.1. En comparant l'inductibilité de l'expression de ces trois gènes Hsp70.1 par choc thermique dans deux souches de H. vulgaris, Hm-105 et AEP. Deux de ces gènes, Hsp70.1a et Hsp70.1b, sont induits suite à un choc thermique tandis que le troisième Hsp70.1c montre un niveau d'expression stable. Ces expériences nous ont permis d'établir les conditions optimales qui permettent une réponse transcriptionnelle maximale au choc thermique sans induire la mort des animaux. Nous avons produit une série de constructions rapportrices exprimant la protéine GFP sous le contrôle du promoteur Hsp70.1a. Afin de valider l'inductibilité de ces constructions, différents tests ont été conduits dans des cellules humaines transfectées et chez l'Hydre après électroporation. Nous avons aussi produit une lignée transgénique stable exprimant la construction Hsp70.1a_0.5kb::GFP chez l'Hydre AEP. Cependant nous n'avons obtenu aucune évidence de l'inductibilité de ces séquences promotrices suggérant que les séquences régulatrices des gènes Hsp70.1 bien que sensibles aux chocs thermiques ont un fonctionnement plus complexe qu'anticipé pour diriger de façon inductible l'expression de gènes d'intérêt chez l'Hydre.

Hydra is a freshwater cnidarian polyp that regenerates any missing part after amputation. This study focuses on the potential role of injury-induced ROS signaling in triggering head regeneration. We detected immediately after mid-gastric bisection symmetrical levels of mitochondrial superoxide and asymmetrical levels of hydrogen peroxide (H2O2), higher in head-regenerating tips than in basal-regenerating ones. This asymmetry likely results from a higher superoxide dismutase (SOD) activity in head-regenerating tips while catalase is lower. Pharmacological treatments (Tiron, DPI) and transient gene silencing approaches (sod-1, catalase) indicate that signaling via mitochondrial ROS plays a role in wound healing while high levels of H2O2 are necessary for apical regeneration. Through paracrine signalling, H2O2 triggers CREB phosphorylation as well as death of interstitial cells, while H2O2 levels are amplified by apoptotic cells via a feedback loop. Thus, asymmetric ROS signaling immediately after bisection is critical to induce cell death and apical regeneration.

TCTP est une protéine conservée avec des fonctions importantes dans la croissance cellulaire, la prolifération, la réponse anti-apoptotique et la réponse au stress cellulaire induit. Le génome de l'Hydre contient deux gènes différents du TCTP. HyTCTP1 a été décrit dans la littérature scientifique étant fortement exprimé dans les trois populations des cellules souches, dans la zone médiane du corps. HyTCTP2 a été découvert par notre laboratoire, il enregistre une expression faible et prépondérante dans les cellules interstitielles. L'information sur l'expression et la régulation des deux gènes au niveau de la transcription a été décrite auparavant dans deux travaux de Master et elle a été complémentée par l'analyse quantitative du séquençage de l'ARN faite par notre laboratoire. L'information sur l'expression protéique est pourtant manquante, pour cette raison mon étude a été concentrée sur l'analyse de l'expression des TCTPs dans l'Hydre au niveau protéique, suivant la production des anticorps spécifiques.

Hydraexhibits a negligible senescence as its epithelial and interstitial stem cell populations continuously divide. Here we identified twoH. oligactisstrains that respond differently to interstitial stem cell loss. Cold-resistant(Ho_CR)animals adapt and remain healthy while cold-sensitive(Ho_CS)ones die within three months, after their epithelial stem cells lose their selfrenewal potential. InHo_CSbut not inHo_CRanimals, the autophagy flux is deficient, characterized by a low induction upon starvation, proteasome inhibition or Rapamycin treatment, and a constitutively repressed Ulk activity. In the non-agingHydra vulgaris, WIPI2 silencing suffices to induce aging. Rapamycin can delay aging by sustaining epithelial self-renewal and regeneration, although without enhancing the autophagy flux. Instead Rapamycin promotes engulfment in epithelial cells where p62/SQSTM1-positive phagocytic vacuoles accumulate. This study uncovers the importance of autophagy in the longevity of early-branched eumetazoans by maintaining stem cell renewal, and a novel anti-aging effect of Rapamycin via phagocytosis.

The aim of my PhD project was to investigate the molecular mechanisms underlying Hydra regeneration. I approached this question mainly through transcriptomic analysis, namely RNA-seq thanks to Next Generation Sequencing. In spite of more than 250 years of accumulated research on its regenerative potential, the Hydra model system was yet to benefit from the recent development of high throughput sequencing methods. The Hydra genome was recently made available, however a global perspective of the genes expressed in Hydra was missing and thus several important biological questions that extend beyond the Hydra model system were difficult to address. In an attempt to fill this gap, we applied RNAseq to focus on three aspects: i) produce an inventory of the genes expressed in Hydra vulgaris, ii) analyze the evolution of proteomes among metazoans, iii) characterize the transcriptional modulations along the Hydra body axis and in regenerative contexts.

Here we have studied some biochemical and molecular characteristics of lipid metabolism in the Hydra cnidarian polyp. We have characterized variations in lipid metabolism in response to diet by establishing lipid profiles in starved and fed Hydra, and quantifying with the Red Nile technique the accumulation of lipid droplets in the digestive cells upon starvation. As expected, Hydra uses lipid reserves as fuel for survival, suggesting that fatty acids and cholesterol in the diet are esterified and stored when abundant and then released when fasting. During regeneration, specific classes of lipids appear to be needed, possibly for cell membrane synthesis and/or specific signalling. We finally identified five orthologs of the bilaterian genes encoding the dihydrolipoamide branched-chain transacylase (DBT), hydroxyacyl-CoA dehydrogenase (HCD), choline phosphotransefrase (CHPT), phosphatidylcholine Sterol-O acyltransferase (PCSAT) and lipophorin receptor /LDL (LpR/LDL). Phylogenetic analyses confirm that these enzymes and receptor essential for lipid metabolism are conserved in eumtazoans.

In Hydra, the transcription factor CREB is rapidly phosphorylated after amputation in the endodermal cells of the head-regenerating tips, a regulation that plays an important role in the head regeneration process. In bilaterians, the phosphorylated form of CREB binds to the CREB binding protein (CBP), which acts as a general co-activator of transcription. To find out if this regulatory cascade also occurs in Hydra, we analyzed the Hydra CBP protein which we found to be highly conserved during evolution. We detected a high level of CBP transcripts in the endodermal cells of the head-forming regions, either head-regeneration tips or buds growing from intact animals. We also noted hyper-acetylation of histone-4 in head-regenerating tips, and a marked negative effect of Scriptaid, a deacetylase inhibitory drug, on the efficacy of head regeneration. These preliminary results suggest that Hydra CBP could, via chromatin modifications, participate in the reactivation of the head re-development program.

Au cours de ce projet j'ai utilisé l'hydre comme système modèle afin d'analyser la neurogénèse ainsi que les mécanismes développementaux qui sous-tendent l'activité d'organisatrice observée pendant les processus morphogénétiques. En effet, cet animal représente les espèces animales les plus ancestrales capables de différencier une polarité tête/pied et un système nerveux, formé de cellules méchano-réceptrices (nématocytes) et de neurones qui partagent une cellule souche commune. Nous avons identifié des gènes régulateurs dont la fonction neurogénétique est préservée au cours de l'évolution. Parmi ceux-ci "cnox-2" (homologue de "Gsx") est exprimé dans les cellules souches neuronales, les précurseurs des neurones et de nématocytes, de même que certains neurones apicaux. Quand "cnox-2" est inhibé par interférence ARN, la formation de la tête n'a pas lieu. Par ailleurs, l'analyse par transgénèse des séquences régulatrices de "cnox-2" nous a montré que "cnox-2" était déréprimés au cours de la formation de la tête.