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Orientadores: Fabio Cesar Gozzo, Juliana Helena Costa Smetana Tese (doutorado) - Universidade Estadual de Campinas, Instituto de Química Resumo: A técnica de ligação cruzada associada à espectrometria de massas (XL-MS) baseia-se na união covalente de resíduos de aminoácidos estruturalmente próximos por meio de um agente de ligação cruzada (ALC). O ALC atua como uma régua molecular gerando informações a respeito da distância em que os resíduos reativos encontram-se na estrutura terciária e quaternária de proteínas. A técnica de troca de hidrogênio-deutério associada à MS (HDX-MS) consiste na troca de átomos de hidrogênio lábeis por átomos de deutério presentes na solução. Essa técnica fornece informações sobre mudanças conformacionais e dinâmica de proteínas e complexos proteicos. A Hsp90 é uma chaperona molecular essencial para células que exerce um papel fundamental na homeostase. A Hsp90 atua também no processo de translocação de proteínas do citosol para as mitocôndrias via complexo TOM, por meio da interação entre os domínios C-terminal da Hsp90 (CHsp90) e o citosólico da proteína Tom70 (Tom70C). As características estruturais do complexo CHsp90-Tom70C foram investigadas utilizando XL-MS e HDX-MS. Os resultados demonstraram uma nova região de interação entre essas proteínas que envolve a hélice A7 da Tom70C e o peptídeo TLRQKAEADKNDKSVKDLVILLY presente na Hsp90. Ensaios de importações mitocondriais confirmaram essa nova região de interação. Os resultados permitiram propor um modelo estrutural de baixa resolução para o complexo CHsp90-Tom70C e ampliar as informações descritas na literatura quanto ao mecanismo de importação de pré-proteínas para mitocôndria. A PP2A, segundo alvo desta tese, é uma serina/treonina fosfatase que atua em diversos processos celulares e é um importante supressor tumoral. A holoenzima funcional da PP2A é heterotrimérica e composta por uma subunidade ancoradora, regulatória e catalítica (PP2Ac). A sequência conservada do extremo C-terminal (306DYFL309) da PP2Ac sofre modificações pós-traducionais que regulam a interação com outras subunidades e conferem seletividade ao substrato. A TIPRL é uma proteína conservada que interage e inibe a atividade da PP2Ac. Existe uma escassez nas informações sobre os mecanismo regulatórios e estruturais no processo de biogênese da PP2A e também do papel da TIPRL. Estudos utilizando co-imunoprecipitação combinada com western blot e MS foram propostos para analisar o processo de biogênese da PP2A comparando duas isoformas da PP2Ac: ativa e inativa. Informações estruturais da regulação da PP2A por TIPRL foram obtidos usando XL-MS e HDX-MS para estudar a estrutura e dinâmica da TIPRL em solução e complementar dados de cristalografia. Os resultados da biogênese da PP2A evidenciaram que esse processo ocorre em um tempo menor que 48 horas. O cristal da TIPRL humana é um novo fold, composto por folhas betas e uma fenda ligada a um peptídeo derivado do sítio de clivagem da enzima TEV. O peptídeo co-cristalizado (LYFQ) apresenta similaridade de sequência com o extremo C-terminal da PP2Ac. Análises de HDX-MS utilizando TIPRL e os tetrapeptídeos sintéticos (DYFL e DpYFL) demonstram que o extremo C-terminal da PP2Ac interage nessa fenda e existe maior afinidade com o peptídeo não fosforilado. Essas descobertas abrem novas vias de desenvolvimento de fármacos, já que a fenda na TIPRL pode ser alvo de fármacos para liberar a atividade da fosfatase em células cancerígenas Abstract: Chemical cross-linking followed by mass spectrometry (XL-MS) involves the covalent linkage of amino acids that are close in space by using chemical agents (cross-linkers). The cross-linkers act as molecular rules that provide information on distances between the cross-linked amino acids residues in the tertiary and quaternary structure of proteins. The hydrogen-deuterium exchange is a chemical reaction in which label hydrogen of proteins is replaced by a deuterium in solution. This technique coupled to mass spectrometry (HDX-MS) is used to study the conformation and dynamics of proteins and complexes. Hsp90 is a molecular chaperone that is crucial to maintain cellular homeostasis. Hsp90 also facilitates the transport of preproteins from the cytosol to the mitochondria via TOM complex, through interaction between cytosolic domain of Tom70 (Tom70C) and C-terminal domain of Hsp90 (CHsp90). Structural insights of CHsp90-Tom70C complex were investigated using XL-MS and HDX-MS. This strategy has identified a novel region of contact between CHsp90-Tom70C (TLRQKAEADKNDKSVKDLVILLY and helix A7, respectively). The new interface was confirmed via mitochondrial import assays. The results allowed to generate a low resolution molecular model to the CHsp90-Tom70C complex and fulfill information of the mechanism which preproteins are translocated via Tom70 to the mitochondria. Protein phosphatase 2A (PP2A) is a serine/threonine phosphatase in cells, which acts in several cellular processes and is an important tumor suppressor. Functional PP2A holoenzymes are heterotrimers composed of scaffold, regulatory and catalytic (PP2Ac) subunits. The catalytic subunit has a conserved C-terminus (306DYFL309) that undergoes post-translational modifications, which regulate the interactions with the other subunits and confer substrate selectivity. TIPRL is a conserved protein that binds and inhibits PP2Ac. There is a dearth of information regarding the regulatory and structural mechanisms in the assembly of PP2A heterotrimers and the possible role of TIPRL. Co-immunoprecipitation combined to western blot and MS were used to study the biogenesis process of PP2A using two PP2Ac isoforms: active and inative. The structural basis of regulation of PP2A by TIPRL was obtained using XL-MS and HDX-MS to understand the dynamics of TIPRL in solution and complement crystallographic data. The PP2A biogenesis analysis indicate that this process takes up to 48h. The crystal structure of human TIPRL is a new fold with beta-sheet core and a cleft bound to a peptide derived from TEV mediated cleavage of the affinity tag. The TEV-derived peptide (LYFQ) which co-crystallized had a striking similarity with the conserved C-terminus of PP2Ac. The HDX-MS analysis with TIPRL and synthetic tetrapeptides (DYFL and DpYFL) showed that this binding site in TIPRL structure actually harbors the C-terminus of PP2Ac and that TIPRL has a clear preference for the non-phosphorylated peptide. These findings open new drug development avenues as the presence of a druggable pocket in TIPRL could be targeted to release phosphatase activity in cancer cells Doutorado Química Orgânica Doutora em Ciências CAPES CNPQ 203800/2017-6

Orientador: Kleber Gomes Franchini Tese (doutorado) - Universidade Estadual de Campinas, Instituto de Biologia Resumo: A via de sinalização da Calcineurina (Cn), uma fosfatase dependente de cálcio, desempenha papel chave no desenvolvimento, na hipertrofia e no remodelamento patológico do coração. A Calcineurina é negativamente regulada pelas Calsarcinas (CS), uma família de proteínas específicas do músculo estriado, que interagem diretamente com Cn. No entanto, os mecanismos moleculares de inibição de Cn por CS permanecem obscuros. Compreender a estrutura do complexo Cn:CS é fundamental para desvendar esse mecanismo de regulação. Neste trabalho foram combinados ensaios bioquímicos, crosslinking químico acoplado à Espectrometria de Massas (experimentos de MS / MS), análise mutacional e uma estratégia de modelagem computacional para a caracterização estrutural do complexo CnA:CS1 (isto é, constituído pela subunidade A de Cn e a isoforma 1 de CS, ambas murinas). O complexo recombinante foi submetido a crosslinking químico, tripsinizado e analisado por LC-MS/MS. Os dados obtidos foram utilizados em um docking in silico dos modelos de ambos os polipeptídeos, gerando várias poses para o complexo. As poses de menor energia de ligação foram agrupadas de acordo com semelhança estrutural e submetidas à simulação de dinâmica molecular. A superfície de interação identificada em CnA abrangeu as ?-hélices 1, 3 e loops vizinhos, enquanto a superfície correspondente de CS1 compreendeu os loops carboxiterminais das regiões Leu179-Phe185, Phe195-Ser199 e Thr250-Leu264. Notavelmente, a superfície de interação de CnA situa-se muito próxima à folha-? 14, o principal sítio de ligação do motivo PxIxIT do fator de transcrição NFAT, importante efetor da Calcineurina. Experimentos realizados com vários mutantes de CnA (FLAG- CnA) e CS1 (myc -CS1 ) foram utilizados para validar o modelo estrutural do complexo CnA:CS1. Os resíduos Lys40 (CnA) e Glu254 (CS1) foram identificados como críticos para a estabilidade do complexo. O modelo gerado neste estudo apoia a hipótese de que CS1 interage com um sítio alostérico para inibir a atividade de CnA Abstract: Signaling by the calcium-dependent phosphatase calcineurin (Cn) plays key roles in regulating cardiac development, hypertrophy, and pathological remodeling. Cn binds to and is negatively regulated by calsarcins (CS), a family of muscle-specific proteins. However, the molecular mechanisms involved in the inhibition of Cn by CS remain unclear. Understanding the architecture and structure of Cn-CS complex is critical to unravel the regulation of Cn by CS. Here we combined biochemical assays, chemical crosslinking coupled to mass spectrometry experiments (MS/MS), mutational analysis and a modeling strategy for structural characterization of CnA-CS1 assembly. The MS/MS data obtained from the cross-linked peptides of both proteins were used to guide an in silico docking of their polypeptide models. The protein complex models with the smallest estimated binding energy were clustered according to structural similarity and submitted to molecular dynamics simulation. The interacting surface of CnA was mapped in a pocket between the 1st and 3rd ?-helixes and surrounding loops, while the corresponding surface of CS1 was mapped to the carboxyterminal loops within the Leu179-Phe185, Phe195-Ser199 and Thr250-Leu264 regions. Notably, the region of CnA that interacts with CS1 was found to be located in close proximity, but not coincident, to the ?-sheet 14, the main binding site for the PVIVIT sequence of NFAT. Experiments performed with several CnA (FLAG-CnA) and CS1 (myc-CS1) mutants were used to validate the structural model of the CnA-CS1 assembly. The Lys40 (CnA) and Glu254 (CS1) residues were identified as critical for the complex stability. The model that emerges from this study supports the notion that CS1 interacts with an allosteric site to inhibit the activity of CnA Doutorado Bioquímica Doutor em Biologia Funcional e Molecular

Orientador: Carlos Henrique Inácio Ramos Tese (doutorado) - Universidade Estadual de Campinas, Instituto de Química Resumo: Chaperonas moleculares e proteínas de choque térmico (Heat shock protein, Hsp) atuam contra a agregação e o enovelamento incorreto de proteínas, que são os agentes causais de doenças neurodegenerativas, como por exemplo, Alzheimer e Parkinson. A Hsp90 é uma das mais importantes chaperonas moleculares, considerada essencial para a viabilidade celular em eucariotos, pois está associada com a maturação de proteínas atuantes na sinalização e ciclo celular. Além disso, foi demonstrado que a Hsp90 está envolvida na estabilização do fenótipo tumoral de diversos tipos de câncer, destacando a sua importância biomédica. A interação com co-chaperonas, proteínas auxiliares das chaperonas, permite que a Hsp90 atue como uma proteína "hub", ou seja, um ponto central de regulação de diversas proteínas. Muitas dessas co-chaperonas possuem um ou mais domínios do tipo TPR (do inglês, tetratricopeptide repeat) que interagem com o C-terminal da Hsp90. No presente projeto de doutorado, investigamos as características estruturais e termodinâmicas da interação entre o domínio C-terminal da Hsp90 (C-Hsp90) e a co-chaperona TPR Tom70 humana, utilizando técnicas de reação-cruzada acoplada à espectrometria de massas (LC-MS/MS), calorimetria de titulação isotérmica (ITC), espalhamento de raios-X à baixos ângulos (SAXS) e modelagem molecular. Os resultados de LC-MS/MS e ITC evidenciaram novas regiões na interação do complexo C-Hsp90/Tom70 que envolve a hélice A7 presente na Tom70 e experimentos de SAXS revelaram a estrutura em baixa resolução das proteínas C-Hsp90, Tom70 e do complexo C-Hsp90/Tom70. Além disso, investigamos o efeito do celastrol, um composto com potencial atividade anti-câncer, na conformação e na função da Hsp90. Na presença do composto, a Hsp90 sofre um processo de oligomerização e a natureza dos oligômeros foi determinada por ferramentas bioquímicas e biofísicas, tais como espalhamento dinâmico de luz (DLS), cromatografia de exclusão molecular analítica acoplada a espalhamento de luz em multiângulos (SEC-MALS) e eletroforese em gel nativo. Interessantemente, a oligomerização induzida pelo celastrol não afetou a atividade de proteção da Hsp90 contra a agregação protéica e a capacidade de ligação as co-chaperonas com enovelamento tipo TPR. Este é o primeiro trabalho a apontar um possível mecanismo para a ação do celastrol sobre a Hsp90. Coletivamente, nossos resultados e descobertas contribuem para uma melhor compreensão dos mecanismos moleculares relacionados à interação entre chaperonas e co-chaperonas, bem como, chaperonas e potenciais ligantes. Abstract: Molecular chaperones and heat shock proteins (Hsp) act against protein aggregation and misfolding, which are the causal agents of neurodegenerative diseases such as Alzheimer and Parkinson. Hsp90 is one of the most important molecular chaperones, considered essential for cell viability in eukaryotes, since it is associated with the maturation of proteins involved in cell cycle and signaling. In addition, it was demonstrated that Hsp90 is implicated in the stabilization of the tumor phenotype of various types of cancer, highlighting its biomedical importance. The interaction with co-chaperones, auxiliary proteins of chaperones, allows that Hsp90 acts as a hub, being a central point for regulation of several other proteins. Many of these co-chaperones have one or more TPR domains that interact with the C-terminus of Hsp90. In this PhD project, we investigated structural and thermodynamic characteristics of the interaction between the C-terminus domain of Hsp90 (C-Hsp90) and the TPR co-chaperone human Tom70, using techniques of cross-linking coupled with mass spectrometry (LC-MS/MS), isothermal titration calorimetry (ITC), small angle X-ray scattering (SAXS) and molecular modeling. The results of LC-MS/MS and ITC revealed new regions involved in the interaction of the C-Hsp90 with Tom70, which encompasses the A7 helix from Tom70, and SAXS experiments unveiled the low resolution structure of the proteins C-Hsp90, Tom70 and the C-Hsp90/Tom70 complex. In addition, we investigated the effect of celastrol, a compound with a potential anti-cancer activity, on the conformation and function of Hsp90. In the presence of celastrol, Hsp90 undergoes oligomerization and the nature of the oligomers was determined by biochemical and biophysical tools such as dynamic light scattering (DLS), size-exclusion chromatography coupled to multi-angle light scattering (SEC-MALS) and native gel electrophoresis. Interestingly, the celastrol-induced oligomerization did not affect the protective activities of Hsp90 against protein aggregation or the capacity to bind TPR co-chaperones. This is the first study to point out a possible mechanism for the action of celastrol on Hsp90. Collectively, our findings contribute to a better understanding of the molecular mechanisms associated to the interaction between chaperones and co-chaperones, as well as chaperones and potential ligands Doutorado Química Orgânica Doutora em Ciências

Orientador: Orientador : Kleber Gomes Franchini Tese (doutorado) - Universidade Estadual de Campinas, Faculdade de Ciências Médicas Resumo: Durante os primeiros dias do desenvolvimento pós-natal, os miócitos cardíacos perdem a capacidade de proliferação, sendo o crescimento adicional do coração decorrente de hipertrofia e não hiperplasia dos miócitos cardíacos. No entanto, em situações de estresse os miócitos cardíacos diferenciados podem apresentar desdiferenciação e reestabelecimento do ciclo celular. Os mecanismos envolvidos nesse fenômeno são ainda pouco compreendidos. No presente estudo, demonstramos que a ativação do fator de transcrição MEF2C (Myocyte Enhancer Factor 2-C) tem papel crítico no processo de desdiferenciação de miócitos cardíacos. Essa conclusão foi obtida por meio de experimentos de ganho de função pela superexpressão de MEF2C em miócitos ventriculares de ratos neonatos em cultura (MVRNs). Demonstramos que a superexpressão de MEF2C em MVRNs induziu a desdiferenciação e a ativação de mecanismos envolvidos na progressão do ciclo celular. Esses resultados foram obtidos por meio de experimentos de microarranjo de DNA, PCR em tempo real, western blotting e análise do fenótipo celular por microscopias de luz, confocal e eletrônica de transmissão. Esses fenômenos foram atenuados pela superexpressão da quinase de adesão focal (FAK), uma proteína que reconhecidamente exerce efeitos pró-hipertróficos em miócitos cardíacos adultos. Experimentos in vivo e in vitro demonstraram a interação direta entre o fator de transcrição MEF2C e a FAK. Estudos com base em ensaios de reação cruzada associada à espectrometria de massas, dinâmica molecular, espalhamento de raios-X a baixos ângulos e mutação sítio dirigida, demonstraram que as hélices 1 e 4 do domínio FAT da FAK interagem diretamente com a domínio de ligação ao DNA do dímero de MEF2C. Estudos de afinidade e de gel shift demonstraram que a porção FAT da FAK desloca a interação MEF2C/DNA in vitro. Ensaios de gene repórter demonstraram que a FAK, mediada pela região C-terminal, diminui a atividade transcricional de MEF2C em células C2C12. O conjunto de dados demonstra que a ativação do fator de transcrição MEF2C em MVRNs induz a desdiferenciação e ativação de mecanismos de progressão do ciclo celular e que a FAK impede esses efeitos através da interação inibitória no domínio de ligação de MEF2C ao DNA Abstract: During the first days of postnatal development, cardiac myocytes lose their ability to proliferate, and the further growth of the heart is due to hypertrophy and not hyperplasia of cardiac myocytes. However, in response to stress, cardiac myocytes may have dedifferentiation and re-establishment of the cell cycle. The mechanisms involved in this phenomenon are still poorly understood. In the present study, we demonstrated that activation of the transcription factor MEF2C (myocyte enhancer factor 2-C) plays a critical role in the process of dedifferentiation of cardiac myocytes. This conclusion was obtained by gain-of-function experiments through overexpressing MEF2C in neonatal rat ventricular myocytes in culture (NRVMs). We also showed that overexpression of MEF2C in NRVMs induced the dedifferentiation and activation of mechanisms involved on cell cycle progression. These results were obtained by DNA microarray experiments, real time PCR, western blotting and cell phenotype analysis by light microscopy, confocal and electronic transmission. These effects were attenuated by overexpression of focal adhesion kinase (FAK) protein known to exert pro-hypertrophic effects on adult cardiac myocytes. In vivo and in vitro experiments demonstrated the direct interaction between the transcription factor MEF2C and FAK. A model based on crosslinking technology coupled with mass spectrometry, small angle X-ray scattering and the site directed mutation analyses indicated that alpha-helices 1 and 4 of FAK FAT domain interacts directly with the DNA binding domain of MEF2C dimer. Affinity studies and gel shift assay demonstrated that the FAK FAT domain displaces the MEF2C/DNA interaction in vitro. Reporter gene assays demonstrated that FAK, mediated by the C-terminal region, decreases the transcriptional activity of MEF2C in C2C12 cells. The data set shows that the activation of the transcription factor MEF2C in MVRNs induces dedifferentiation and activation of cell cycle progression and that FAK prevents these effects by inhibitory interaction with DNA binding domain of MEF2C Doutorado Biologia Estrutural, Celular, Molecular e do Desenvolvimento Doutor em Ciências

Orientador: Carlos Henrique Inácio Ramos Tese (doutorado) - Universidade Estadual de Campinas, Instituto de Biologia Resumo: A função biológica das proteínas está relacionada à sua estrutura tridimensional adquirida pelo processo de enovelamento protéico. Neste contexto, proteínas denominadas, genericamente, de chaperonas moleculares exercem papel fundamental atuando no auxílio do enovelamento correto, no reenovelamento e na dissociação de agregados protéicos. A Hsp90 é uma das chaperonas moleculares mais importantes, é essencial para a viabilidade celular em eucariotos e está normalmente associada a proteínas atuantes no ciclo e sinalização celular, o que torna essa chaperona um alvo bastante interessante para abordagens terapêuticas de diversas doenças. A Hsp90 pode ser modulada por co-chaperonas diversas. Nesse trabalho foram caracterizadas as proteínas CHsp90 (domínio C-terminal da Hsp90 humana), e as co-chaperonas Hop e Tom70, além da interação entre C-Hsp90 e Tom70. Foram aplicadas técnicas de dicroísmo circular e emissão de fluorescência do triptofano; seguidas pela caracterização por ultracentrifugação analítica, gel filtração analítica, espalhamento dinâmico de luz, cromatografia de gel filtração acoplada a espalhamento de luz em multi-ângulos (SEC-MALS) e gel nativo. Para os ensaios de interação foram aplicadas técnicas de pull-down, SEC-MALS e calorimetria de titulação isotérmica. As proteínas foram produzidas puras e enoveladas, com estado oligomérico determinado como dímero para C-Hsp90 e monômero para Hop e Tom70, sendo que essas também foram encontradas como espécies diméricas. A estequiometria de interação entre a C-Hsp90 e Tom70 foi determinada em 1 monômero da Tom70 para 1 dímero da C-Hsp90, com KD de 360 ± 30 nM, ?Happ = -2,6 ± 0,1 kcal/mol e ?S = 21 ± 1 cal/mol.K, sugerindo que a interação é dirigida por entalpia e entropia. Os resultados obtidos nesse trabalho contribuem para uma melhor compreensão do sistema Hsp90, que está envolvido em diversos processos celulares essenciais e patológicos, como doenças neurodegenerativas, processos inflamatórios, infecções e câncer Abstract: The biological function of proteins is related to its three dimensional structure acquired via protein folding process. In this context, the molecular chaperones play a key role acting as auxiliary protein on protein folding, refolding and dissociation of protein aggregates. Hsp90 is one of the most important molecular chaperones, is essential for cell viability in eukaryotes and is usually associated with proteins involved in cell cycling and cell signaling, which makes these chaperone a very interesting targeting for therapeutic approaches for several diseases. The chaperone activity of Hsp90 can be modulated by other proteins, called co-chaperones. In this work, we characterized the protein C-Hsp90 (Cterminal domain of human Hsp90) and the co-chaperones Hop and Tom70, and also the interaction between C-Hsp90 and Tom70. Circular dichroism and fluorescence emission of tryptophan was first applied for initial characterization of the proteins, followed by analytical ultracentrifugation, analytical gel filtration, dynamic light scattering, size exclusion chromatography - multi angle light scattering (SEC-MALS) and native gel. The interaction between C-Hsp90 and Tom70 were measured by techniques like pull-down, SEC-MALS and isothermal titration calorimetry. The proteins were produced pure and soluble and their oligomeric state were determined as dimer for C-Hsp90, and monomer for Hop and Tom70, these two co-chaperones were also found as dimeric species. The stoichiometry of interaction between C-Hsp90 and Tom70 was determined by SEC-MALS and ITC as been 1 dimer of C-Hsp90 to 1 monomer of Tom70, with a KD of 360 ± 30 nM, ?Happ = -2.6 ± 0.1 kcal/mol and ?S = 21 ± 1 cal/mol.K, suggesting that these interaction is driven by both, enthalpy and entropy. The results contribute to a better understanding of the important Hsp90 machinery, which is involved in many essential cellular and pathological processes, such as neurodegenerative diseases, inflammation, infection and cancer Doutorado Bioquímica Doutor em Biologia Funcional e Molecular

Orientador: Kleber Gomes Franchini Dissertação (mestrado) - Universidade Estadual de Campinas, Faculdade de Ciencias Medicas Resumo: Estudos anteriores demonstraram que em miócitos cardíacos submetidos a estímulos mecânicos ocorre pronta fosforilação e ativação da FAK. Resultados de estudos recentes, realizados em corações de ratos indicaram que em resposta a estímulos mecânicos, a FAK, além de ser ativada, localiza-se no núcleo dos miócitos cardíaco. Estudos conduzidos em corações de ratos Wistar adultos, utilizando a técnica de Imunoprecipitação de cromatina (ChIP) com anticorpo anti- FAK, identificaram uma seqüência intrônica de 182pb do gene fosfolambam (plnil), contendo sítio para a ligação do fator de transcrição MEF2. Portanto, no presente estudo, investigamos se a região intrônica do gene que codifica o fosfolamban tem função regulatória transcricional. Utilizando técnicas de EMSA (Ensaio de retardamento da mobilidade eletroforética), ensaios de Precipitação e de gene reporter, avaliamos a interação entre a FAK e plnil além da função regulatória transcricional dessa seqüência. Como resultado, demonstramos que ocorre pronta ativação da FAK e seu acúmulo no núcleo de miócitos cardíacos de ventrículo esquerdo de ratos submetidos a coarctação da aorta. Através de ensaios de EMSA, demonstramos que proteínas nucleares de ventrículo esquerdo de ratos submetidos a sobrecarga pressórica, apresentaram um aumento na interação com a sonda plni1 em relação aqueles de ratos controles. Também, ensaios de EMSA indicaram uma interação entre MEF2 e a sonda plnil, mas não entre a FAK ou seus domínios (FERM e Cterminal) com a sonda plnil. Ensaios de precipitação com fragmentos recombinantes da FAK (GST-FERM e GSTCterminal) com extratos nucleares de coração de ratos coarctados indicaram uma associação entre FAK e MEF2. Ensaios adicionais demonstraram que a interação entre FAK e MEF2 é dependente do domínio Cterminal e do estado fosforilado da FAK. Estudos de transfecção com gene reporter, utilizando plasmídeo contendo a seqüência plnil, em cultura de miócitos cardíacos submetidos ao estiramento, demonstraram que a região intrônica plnil possui função regulatória transcricional e esse papel é dependente da ligação do fator de transcrição MEF2 ao seu sítio específico no DNA. Portanto, esses dados indicam que FAK e MEF2 podem estar envolvidos na regulação da expressão do gene pln através de regulação mediado pela região intrônica plnil. Abstract: Previous studies have shown that mechanical stress induces phosphorylation and activation of FAK in cardiac myocytes. Recent studies carried out in rat overloaded hearts indicated that FAK re-locates in the nucleus of the cardiac myocytes. By assays in the nuclei of overloaded cardiac myocytes with chromatin immunoprecipitation (ChIP) approach with anti-FAK antibody, we identified an intronic sequence of phospholamban gene (plnil), containing a MEF2 consensus site. In the present study, we investigated whether Plnil has any regulatory function in the pln. To accomplish this, we combinated techniques such as EMSA (Electrophoreses Mobility Shift Assay), reporter gene and pulldown assays. FAK was shown to be rapidly activated and to accumulate in the nuclei of cardiac myocytes taken from overloaded left ventricle. Using EMSA assays, we demonstrated that nuclear extracts of left ventricle rats overloaded, interacted with the plnil probe. EMSA assays, also indicated an interaction between MEF2 and the plnil probe, but no interaction was found between FAK or its domains (FERM and Cterminal) with the plni1. Pulldown assays with FAK recombinant fragments (GST-FERM and GST-Cterminal) and nuclear extracts from left ventricle overloaded indicated that FAK and MEF2 physically interact through FAK Cterminal domain. Reporter gene assays, using a construction of plnil coupled luciferase transfected to cardiac myocytes culture underwent stretching, had demonstrated that the intronic region has transcriptional regulatory function and this role is dependent of the transcription factor MEF2 binding site in the DNA. Therefore, these data indicate that FAK and MEF2 interact in the nuclei of cardiac myocytes and that FAK/MEF2 complex may regulate phospholamban gene expression through the plnil. Mestrado Medicina Experimental Mestre em Fisiopatologia Médica

Orientadoesr: Carlos Henrique Inácio Ramos, Gonçalo Amarante Guimarães Pereira Dissertação (mestrado) - Universidade Estadual de Campinas, Instituto de Biologia Resumo: Chaperonas moleculares (Heat Shock proteins - HSPs) são componentes chave do sistema de controle de qualidade de proteínas (PQC - Protein Quality Control), que é essencial para a vida, sendo responsável por manter a homeostase proteica e a adequada função de diversas vias. Problemas no processo de enovelamento estão relacionados a doenças degenerativas, amilóides e câncer. Em plantas, as chaperonas moleculares desempenham um papel crucial na proteção contra estresses bióticos e abióticos, pois como organismos sésseis, as plantas devem ser capazes de responder rapidamente a mudanças na temperatura, salinidade, déficit hídrico, entre outros. A chaperona molecular Hsp90 (Heat Shock protein 90 kDa) compreende uma família ubíqua, considerada um 'hub' por interagir com chaperonas, co-chaperonas e ter como clientes proteínas regulatórias essenciais como fatores de transcrição, quinases, receptores de hormônios, entre outros. A Hsp90 age em conjunto com co-chaperonas, as quais modulam e direcionam sua função. Uma destas co-chaperonas é a Hop (Hsp70-Hsp90 organizing protein), capaz de interagir simultaneamente com a Hsp90 e Hsp70, mediando a transferência de substratos. A Hop é composta por três domínios com repetições de tetratricopeptídeos (TPR) (TPR1, TPR2A e TPR2B), responsáveis pela interação com as chaperonas, porém a dinâmica desta interação não está bem entendida, uma vez que ainda não há estrutura da Hop inteira e o estado oligomérico desta co-chaperona ainda é controverso na literatura. Neste trabalho apresentamos a classificação de um gene de Hsp90 de cana-de-açúcar, e o início de sua caracterização funcional através de transgenia em Arabidopsis thaliana. Apresentamos também a caracterização biofísica de uma importante co-chaperona da Hsp90, a Hop (Hsp70-Hsp90 organizing protein) humana. Através da análise de sequências a Hsp90 de cana-de-açúcar foi classificada como Hsp90-3, uma isoforma citosólica. Plantas transgênicas de A. thaliana, produzidas a partir da inserção do gene da Hsp90-3 de cana-de-açúcar, apresentaram níveis reduzidos de Hsp90. Tal perturbação nos níveis de Hsp90 parece ter afetado a expressão de outras proteínas da rede de interações, relacionadas com processos diversos como resposta imune e fotossíntese. As plantas transgênicas também exibiram germinação mais rápida e raízes mais longas em relação ao controle. Sob estresse térmico, linhagens transgênicas apresentaram maior suscetibilidade à alta temperatura em relação ao controle. Tais resultados sugerem que a Hsp90 tem um importante papel na fisiologia celular e no desenvolvimento, e que os níveis de Hsp90 são críticos para a resposta frente a estresses. A caracterização biofísica do mutante Hop D456G, uma mutação no domínio TPR2B, mostrou que esta proteína é uma mistura de monômeros, dímeros e oligômeros maiores, porém com prevalência do estado monomérico. O resíduo D456 pode ter uma participação na dinâmica de dimerização e é possível que o estado oligomérico da Hop seja regulado entre os estados monomérico e dimérico, com a finalidade de facilitar sua atividade adaptadora Abstract: Molecular chaperones (heat shock proteins - HSPs) are key components of protein quality-control system (PQC - Protein Quality Control), which maintains protein homeostasis and the proper function of several pathways, being essential for life. Defects in folding processes are related to degenerative diseases, amyloidosis and cancer. In plants, which as sessile organisms must be able to respond rapidly to changes in temperature, salinity, water deficit, and others, molecular chaperones play a crucial role in protecting against such biotic and abiotic stresses. Molecular chaperone Hsp90 (Heat Shock Protein 90 kDa) comprise an ubiquitous family, considered a hub as it interacts with chaperones, co-chaperones, and have as clients key regulatory proteins such as transcription factors, kinases, hormone receptors, and others. The chaperone acts together with co-chaperones, which modulate and guide Hsp90 function. The co-chaperone Hop (Hsp70-Hsp90 organizing protein), interacts simultaneously with Hsp90 and Hsp70, mediating substrate transfer. Hop has three TPR domains (TPR1, and TPR2A TPR2B) responsible for interaction with the chaperones, but this interaction dynamics remains unclear, since there is no structure of full length Hop and its oligomeric state is controversial in literature reports. This work presents the classification of an Hsp90 gene from sugarcane, and primary functional characterization studies in Arabidopsis thaliana transgenic lines. We also present the biophysical characterization of the human Hsp90 co-chaperone Hop (Hsp70-Hsp90 organizing protein). Through sequence analysis the Hsp90 from sugarcane has been classified as Hsp90-3, a cytosolic isoform. Transgenic A. thaliana, produced by Hsp90-3 insertion, exhibited reduced transcript levels of Hsp90. This disruption in Hsp90 levels seems to affect the expression of other proteins from the interaction network, which are related to various processes such as immune response and photosynthesis. Transgenics also exhibited faster germination and longer roots than the control. Under heat stress, transgenic lines showed increased susceptibility to high temperature. These results suggest that Hsp90 has an important role in cellular physiology and development; in addition the levels of Hsp90 are critical for responses to stresses. The biophysical characterization of the mutant D456G Hop, a mutation in domain TPR2B showed that this protein is a mixture of monomers, dimers and higher oligomers, but the monomeric state is majoritary. The residue D456 may be involved in dimerization dynamics, and it is possible that Hop is regulated between monomeric and dimeric species, to enable its adaptor functions Mestrado Bioquímica Mestre em Biologia Funcional e Molecular

Tese (doutorado)—Universidade de Brasília, Instituto de Ciências Biológicas, Departamento de Biologia Celular, Programa de Pós-Graduação em Biologia Molecular, 2021. Coordenação de Aperfeiçoamento de Pessoal de Nível Superior (CAPES). Proteínas são essenciais para diversos processos celulares. Assim, um dos objetivos centrais da Biologia é entender as relações entre sequência, estrutura e função dessas macromoléculas. Nesse contexto, as marcas deixadas pelo processo coevolutivo em sequências de proteínas parceiras são uma importante fonte de informação estrutural. De fato, as correlações estatísticas entre sítios de aminoácidos em sequências de proteínas são a base dos métodos mais modernos para a previsão de contatos inter- e intra-proteínas, predição de estrutura tridimensional, identificação de sítios funcionais e resíduos determinantes de especificidade, inferência de interações entre parálogos, entre outras aplicações. Em consonância com isso, o presente trabalho apresenta um conjunto de resultados teóricos sobre como proteínas parceiras específicas podem ser recuperadas com base apenas nas informações da sequência. No primeiro capítulo, é realizada uma decomposição da informação mútua (MI) presente nos complexos proteína-proteína, considerando a hipótese de que a MI em proteínas se origina de uma combinação de diferentes fontes: coevolutiva, evolutiva e estocástica. Foi observado que a interface contém, em média por contato, mais informações do que o restante do complexo protéico, resultado que se mantém quando se considera tanto a MI de Shannon quanto a de Tsallis como medida de informação. Essa observação levou à conclusão de que a interface contém o sinal de informação mais forte para distinguir o conjunto correto de proteínas parceiras em famílias de proteínas que interagem. Com base nisso, a utilidade de usar a MI armazenada em interfaces proteína-proteína para recuperar o conjunto correto de proteínas parceiras é avaliada no segundo capítulo. Um algoritmo genético (GA) foi desenvolvido para explorar o espaço de possíveis concatenações entre um par de famílias de proteínas que interagem usando a MI da interface como função objetivo. Usando o GA, a maximização da MI da interface foi realizada para 26 pares de famílias de proteínas que interagem e foi observado que concatenações otimizadas correspondem a soluções degeneradas com duas fontes de erro distintas, decorrentes de pareamentos errados entre (i) sequências similares e (ii) não similares. Quando os erros cometidos com sequências semelhantes foram desconsiderados, as soluções do tipo (i) apresentaram taxas de verdadeiros positivos (TP) de 70 % - muito acima das mesmas estimativas para soluções do tipo (ii). Esses resultados se mantêm quando as otimizações são feitas com base na MI de Tsallis. Essas descobertas levantam questões sobre os mecanismos por trás da coevolução de proteínas parceiras e ajudam a racionalizar os dados da literatura que mostram uma forte deterioração das taxas de TP com o aumento do número de sequência em abordagens baseadas em MI. Proteins are essential for several cellular processes. Hence, one of the central objectives in Biology is to understand the relationships between sequence, structure and function of these macromolecules. In this context, marks left by the coevolutionary process in interacting protein sequences are an important source of structural information. In fact, statistical correlations between amino acid sites in protein sequences are at the basis of state-of-the-art methods for prediction of inter- and intra-protein contacts, template-free structure prediction, identification of functional sites and specificity determining residues, inference of interacting paralogs, among other applications. In line with that, the present work conveys a set of theoretical results on how specific protein partners can be recovered based on sequence information alone. In the first chapter, a decomposition of the mutual information (MI) present in protein-protein complexes is carried out, considering the hypothesis that MI in proteins is originated from a combination of coevolutive, evolutive and stochastic sources. It was observed that the interface contains on average, by contact, more information than the rest of the protein complex, a result that holds when considering both Shannon and Tsallis MI as a measure of information. This observation led to the conclusion that the interface contains the strongest information signal for distinguishing the correct set of protein partners in interacting protein families. Building on that, the utility of using MI encoded on protein-protein interfaces to recover the correct set of protein partners is assessed in the second chapter. A genetic algorithm (GA) was developed to explore the space of possible concatenations between a pair of interacting protein families using the interface MI as objective function. Using the GA, interface MI maximization was performed for 26 different pairs of interacting protein families and it was observed that optimized concatenations corresponded to degenerate solutions with two distinct error sources, arising from mismatches among (i) similar and (ii) non-similar sequences. When mistakes made among similar sequences were disregarded, type-(i) solutions were found to resolve correct pairings at best true positive (TP) rates of 70% - far above the very same estimates in type-(ii) solutions. These results hold when the optimizations are made based on Tsallis MI. These findings raise further questions about the mechanisms behind protein partners coevolution and help rationalize literature data showing a sharp deterioration of TP rates with increasing sequence number in MI-based approaches.

Tir é uma proteína efetora intrinsecamente desordenada (IDP) de Escherichia coli Enteropatogénica (EPEC) e Enterohemorrágica (EHEC) que é translocada para o interior do hospedeiro. Na região C-terminal (C-Tir), este efetor mimetiza quatro motivos, conhecidos como ITIMs, que contêm tirosinas (Y454, Y474, Y483, Y511) que são fosforiladas por cinases do hospedeiro. Os padrões de fosforilação resultantes são reconhecidos por uma série de proteínas do hospedeiro que desencadeiam mudanças na sinalização e nos processos celulares do mesmo. Destas proteínas, destaca-se a fosfatase SHP-1, essencial em vias de sinalização de resposta imunitária. Nesta dissertação propusemos clarificar os aspetos moleculares da interação entre C-Tir e o domínio C-SH2 de SHP-1 e perceber como molecularmente a fosforilação molda essa interação. Através da espetroscopia de RMN, foi realizada a reatribuição das ressonâncias da versão fosforilada de C-Tir e foram analisadas as propensões de estruturas secundárias. Este estudo permitiu a identificação de regiões com tendência para hélices-α, localizadas em zonas conhecidas por interagir com proteínas do hospedeiro. A fosforilação é descrita como um requisito para a interação entre C-Tir e SHP-1. Contudo, os ensaios de interação realizados entre as duas proteínas pré-fosforilação sugerem que a mesma pode ocorrer intrinsecamente, através da região ITIM, que compreende Y511, identificada como uma região com preponderância para estrutura hélice-α. Foi monitorizada a cinética e a extensão da fosforilação das quatro tirosinas, demonstrando que todas são fosforiladas simultaneamente, com Y454 a ser a mais rápida e Y483 a ser a mais lenta. Além disso, foi verificado que C-Tir fosforilada interage com o domínio C-SH2, através das quatro regiões ITIM. A região ITIM que contém Y454, cuja fosforilação é mais rápida, é a que apresenta menos afinidade para C-SH2, comparativamente com as restantes que apresentam afinidades semelhantes entre elas. Este trabalho abre caminho para novos estudos sobre os mecanismos de virulência com implicações na saúde e na doença. Tir is an intrinsically disordered protein (IDP) from Enteropathogenic (EPEC) and Enterohemorrhagic (EHEC) Escherichia coli that is translocated into the host. In its C-terminal region (C-Tir), this effector mimics four motifs, commonly known as ITIMs, containing tyrosine residues (Y454, Y474, Y483, Y511) that are phosphorylated by host kinases. The resulting phosphorylation patterns are recognized by various host proteins that trigger changes in signaling and host cellular processes. Among these proteins is SHP-1 phosphatase, an essential protein in signaling pathways of the immune response. In this thesis, we proposed clarifying the molecular aspects of the interaction between C-Tir and the C-SH2 domain of SHP-1 and understanding how phosphorylation shapes this interaction. Using NMR spectroscopy, we reassigned the backbone NMR resonances of the phosphorylated version of C-Tir and analyzed its secondary structural propensities. This study allowed us to identify regions with a tendency for helical structures located at sites known to interact with host proteins. Phosphorylation seems to be essential for the interaction between Tir and SHP-1. However, binding assays between the two proteins pre-phosphorylation suggests that it can occur intrinsically through the ITIM region comprising Y511, identified to adopt a partial-folded α-helix We also monitored the kinetics and the extension of the phosphorylation reaction of the four tyrosines in the ITIM regions. In doing so, we found that the four positions are phosphorylated simultaneously, with Y454 being the fastest and Y483 being the slowest. Moreover, we showed that phosphorylated C-Tir interacts with the C-SH2 via its four ITIMs. The ITIM region containing Y454, whose phosphorylation is faster, is the one with a lower affinity for the C-SH2, than the others with similar binding strengths. This work paves the way for further studies to understand virulence mechanisms with implications for health and disease.

Orientador: Prof. Dr. David Corrêa Martins Júnior Tese (Doutorado) - Universidade Federal do ABC, Programa de Pós-Graduação em Neurociência e Cognição, Santo André, 2021. O Transtorno do Espectro da Esquizofrenia (SCZ) é caracterizado por ser um transtorno complexo e multifatorial. Variantes genéticas raras - ou seja, variantes com uma frequência do menor alelo < 1% na população e variantes comuns tem contribuição para o SCZ. Por outro lado, a herdabilidade do SCZ varia de 50-80%, indicando que fatores epigenéticos exercem um papel fundamental. O SCZ apresenta um claro dimorfismo sexual: ela costuma ser diagnosticada em homens durante a adolescência - e em mulheres de forma tardia, a partir dos 25 anos. Desta forma, a integração de dados que abordam tanto contribuições genéticas (expressão gênica) e/ou ambientais (metilação de DNA), podem refletir de uma forma mais abrangente as alterações das vias biológicas importantes no contexto da doença. Em sua maioria, os algoritmos que propõem a integração desses tipos de dados utiliza genes diferencialmente expressos (DEG) e genes diferencialmente metilados (DMG). Entretanto, essas propostas atuais resultam em um pequeno conjunto de genes, que pode não refletir os genes e vias biológicas alterados no SCZ. O NERI é um algoritmo capaz de integrar dados de PPI, genes sementes e expressão gênica. Ele utiliza a análise de caminhos mínimos entre todos os pares de semente da rede, selecionando os melhores caminhos através da concordância dos valores de co-expressão e comparando esses valores entre duas condições (sub-redes) diferentes. Adaptamos o algoritmo NERI para utilizar além da expressão gênica, a metilação de DNA (provenientes do córtex pré-frontal dorsolateral de homens e mulheres), por meio de uma nova abordagem integrativa, não dependentes da utilização de DEG ou DMG. Utilizamos 3 conjuntos de genes sementes que apresentam risco para SCZ, expressos no cérebro fetal em 3 períodos da gestação distintos. Selecionamos os genes que apresentavam a maior concordância entre as sub-redes de co-expressão e co-metilação. Demonstramos que os genes com maior concordância: I) apresentam concordância somente quando analisados no contexto de redes de co-expressão e co-metilação - existe baixa correlação entre os sinais de expressão gênica e metilação de DNA; II) homens e mulheres com SCZ apresentam genes concordantes únicos - porém, apontam para vias metabólicas semelhantes, sugerindo que estes genes fazem parte do mesmo módulo na rede do interatoma humano; III) apresentaram altíssima importância estrutural dentro da rede do interatoma humano; IV) genes DEG e DMG no SCZ estariam localizados na periferia da rede do interatoma e apresentaram pouco enriquecimento para vias biológicas. Demonstramos que além de ser possível integrar dados biológicos de diferentes tipos, essa nova abordagem é capaz de encontrar padrões únicos de co-expressão e co-metilação, apontando para genes centrais de elevada importância no interatoma humano - que previamente não foram associados ao SCZ. Schizophrenia Spectrum Disorders (SCZ) is characterized by being complex and multifactorial. Rare genetic variants - those with the lowest allele frequency

Trabalho de Projeto do Mestrado Integrado em Engenharia Biomédica apresentado à Faculdade de Ciências e Tecnologia As proteínas são indispensáveis para os seres vivos e são a base de quase todos os processos celulares. No entanto, estas macromoléculas raramente actuam sozinhas, formando as interações proteína-proteína. Dada a sua importância biológica não é de surpreender que a sua desregulamentação seja uma das principais causas de vários estados de doença.A súbita onda de interesse nesta área de estudo motivou o desenvolvimento de métodos in silico inovadores. Apesar dos avanços óbvios nos últimos anos, a eficácia destes métodos computacionais permanece questionável. Ainda não existem evidências suficientes que apoiem o uso apenas de técnicas in silico para prever interações proteína-proteína ainda não determinadas experimentalmente. Está provado que uma das principais razões que leva a esta situação é a inexistência de um conjunto de dados de interações negativas padrão. Contrariamente à grande abundância de interações positivas disponíveis publicamente, os exemplos negativos são frequentemente gerados artificialmente, culminando em amostras tendenciosas.Nesta tese de mestrado, é apresentado um novo conjunto de dados imparciais, que não restringe em demasia a distribuição das interações negativas. Além do novo conjunto de dados, são também propostos modelos distintos de aprendizagem profunda como uma ferramenta para prever se duas proteínas individuais são capazes de interagir uma com a outra, usando exclusivamente as sequências completas de aminoácidos. Os resultados obtidos indicam firmemente que os modelos propostos são realmente uma ferramenta valiosa para prever interações proteína-proteína, principalmente quando comparados com as abordagens existentes, além de destacarem ainda que existe espaço para melhorias quando implementados em conjuntos de dados imparciais. Proteins are indispensable to the living organisms and are the backbone of almost all the cellular processes. However, these macromolecules rarely act alone, forming the protein-protein interactions. Given their biological significance it should come as no surprise that their deregulation is one of the main causes to several disease states. The sudden surge of interest in this field of study motivated the development of innovative in silico methods. Despite the obvious advances in recent years, the effectiveness of these computational methods remains questionable. There is still not enough evidence to support the use of just in silico techniques to predict protein-protein interactions not yet experimentally determined. It is proved that one of the primary reasons leading to this situation is the non-existence of a "gold-standard" negative interactions dataset. Contrary to the high abundance of publicly available positive interactions, the negative examples are often artificially generated, culminating in biased samples. In this master thesis a new unbiased dataset is presented, that does not overly constraint the negative interactions distribution. Beyond the novel dataset, also distinct deep learning models are proposed as a tool to predict whether two individual proteins are capable of interacting with each other, using exclusively the complete raw amino acid sequences. The obtained results firmly indicate that the proposed models are actually a valuable tool to predict protein-protein interactions, principally when compared with the existing approaches, while also highlighting that there is still some room for improvement when implemented in unbiased datasets. Outro - Portuguese Research Agency FCT, through D4 - Deep Drug Discovery and Deployment (CENTRO-01-0145-FEDER-029266).

Tese (doutorado)—Universidade de Brasília, Instituto de Ciências Biológicas, Departamento de Biologia Celular, Programa de Pós-Graduação em Biologia Molecular, 2020. Interações proteína-proteína (PPI) são processos-chave para a manutenção da vida. As proteínas sofrem diversas pressões seletivas para serem funcionais o que inclui pressões para a manutenção das interações. Nesse contexto, observamos a coevolução de pares de proteínas, que é quando a evolução de uma delas afeta a evolução da outra e vice versa. A Coevolução pode ser quantificada por medidas de correlação entre as substituições de aminoácidos, como por exemplo a transinformação (I). Essas medidas podem ser utilizadas para resolver diferentes problemas biológicos no contexto de PPI, a saber: (i) predição de contatos tridimensionais, (ii) predição de interfaces de interação, (iii) predição de redes de interação e (iv) proposição de pareamento de sequências homólogas de proteínas que interagem. É sabido que diversas fontes contribuem para os valores de I, entretanto entender como cada uma dessas fontes contribui para a resolução desses problemas permanece um desafio. Nesse sentido, esta Tese de Doutorado tem como objetivo entender como a evolução, a coevolução e a estocasticidade influenciam nos valores I e mais do que isso, compreender qual a usabilidade dessas diferentes fontes na resolução do problema (iv). Utilizando alinhamentos de sequências e estruturas disponíveis em bancos de dados, eu mostro aqui que a quantidade de I resultado da coevolução pode ser a mais interessante para a resolução do problema (iv). Isso porque a essa quantidade é a que possui menor degeneração, isto é, nos permite distinguir melhor entre arranjos de pareamento que fazem sentido biológico de arranjos aleatórios e deve ser a única fonte em sistemas que coevoluem em organismos diferentes. Além disso essa fonte de informação coevolutiva pode ser captada apenas em interfaces de interação corretas e de curta distância. Por fim, apresento perspectivas em otimizações para resolução de problemas do tipo (IV). Protein-protein interactions (PPI) are a key process for maintenance of life. Proteins are under diverse selective pressures to maintain their function and interactions. I this context, we observe the coevolution of protein pairs, which is when the evolution of one affect the evolution of other and vice-versa. The coevolution can be quantified by correlation metrics between the amino acids substitution, like mutual information (I). These metrics can be used to solve different biological problems like: (i) structural contacts prediction, (ii) interaction interface prediction, (iii) network interaction prediction and (iv) interactinng proteins homologous pairing. It has been known that different sources contributes to I values, however, to understand how each one of these sources contributes for these problems remains a challenge. In this way, this PhD thesis has as goal understand how the evolution, the coevolution and the stochastic influences I values and more than that, understand the usability of this different sources to solve problem (iv). Using multiple sequence alignments and structures available in data bases, I show here that the I resulted of coevolution can be the best choice to solve the problem (iv). Because, these quantity has less degeneration than others, that is, I resulted from coevolution allow us to distinguish better biological pairing from random pairing and must be the unique source in systems who evolved in different organisms. Furthermore, this source of coevolutive information could be found just in correct interfaces defined by short distances. finaly, I show perspectives in maximization to solve the problem (iv).

Orientador: Rosiane Lopes da Cunha Tese (doutorado) - Universidade Estadual de Campinas, Faculdade de Engenharia de Alimentos Resumo: Este trabalho abordou o uso de duas tecnologias emergentes, o aquecimento ôhmico e o ultrassom, para promover alterações estruturais em proteínas lácteas e permitir a formação de matrizes alimentícias com características diferenciadas. No aquecimento ôhmico foi analisada a funcionalização do caseinato de sódio (proteína de estrutura flexível) e de proteína isolada do soro (estrutura globular) sob a ação de campos elétricos. Ambas proteínas mostraram alterações conformacionais sendo que o caseinato apresentou-se mais solúvel e formou géis com menor capacidade de retenção de água. Quando utilizadas as proteínas do soro juntamente com o caseinato notou-se um efeito interativo entre elas, mais pronunciado que com o uso de aquecimento convencional, resultando na formação de uma rede gelificada ácida mais frágil e também com menor capacidade de retenção de água. De maneira geral, a aplicação de campos elétricos intermediários foi capaz de promover pequenas alterações nas proteínas que podem estar relacionadas ao equipamento utilizado ou mesmo a um limite de alterações que pode ser alcançado pela técnica. Nos estudos com ultrassom, as mesmas proteínas lácteas foram utilizadas. Foi realizado inicialmente uma extensa investigação sobre as alterações promovidas por ultrassom, a partir do qual observou-se que curtos tempos de processos são mais eficientes na promoção de modificações estruturais e que é possível que ocorra uma ação moduladora (efeito chaperona) do caseinato de sódio sobre a agregação das proteínas do soro. Assim podese modular o processo de agregação com a utilização de ultrassom em combinação com moléculas denominadas chaperonas. A partir das condições que promoveram maiores alterações realizou-se um estudo a fim de se observar a funcionalidade atingida pelo ultrassom em matrizes emulsionadas. Houve uma redução da estabilidade das emulsões a altas concentrações de proteínas do leite, que pode estar associada à competição entre as proteínas pela interface. No entanto, o efeito cooperativo entre as proteínas não ficou evidente. A aplicação dos processos, aquecimento ôhmico e ultrassom, foram de grande valia para a observação de modificações proteicas, já conhecidas em outros processos convencionais. Dessa forma foi possível ressaltar a utilização dessas técnicas (por ação do calor e campos elétricos e pelo efeito da cavitação a temperatura controlada) como promotoras de modificações conformacionais e de interações roteicas; permitindo que em estudos futuros o papel de ambas possa ser avaliado de forma mais aprofundada trazendo contribuições essenciais do ponto de vista tecnológico Abstract: This work addressed the use of two emerging technologies, ohmic heating and ultrasound, to promote structure alterations in milk proteins and allow the formation of food matrices with singular characteristics. In ohmic heating, functionalization of sodium caseinate (protein with flexible structure) and whey protein isolate (globular protein) under the action of electric fields was analyzed. Both proteins showed conformational changes, with caseinate being more soluble and forming acid gels with less water holding capacity. When whey proteins were used together caseinate an interactive effect was noticed between them, more pronounced than with the use of conventional heating, resulting in the formation of more fragile acidic gelled network and also with less water holding capacity. In general, the application of intermediate electric fields was able to promote minor changes in proteins that may be related to the equipment employed or even to a limit of changes that can be achieved by the technique. In ultrasound studies, the same milk proteins were used. Initially, an extensive investigation was carried out on the changes promoted by ultrasound, from which it was observed that short process times are more efficient in promoting structural changes and that it is possible to occur a modulating action (chaperone effect) of sodium caseinate on the aggregation of whey proteins. Therefore, the aggregation process can be with the use of ultrasound in combination with molecules called chaperones. Based on the conditions that promoted major changes, a study was carried out in order to observe the functionality achieved by ultrasound in emulsified matrices. There was a reduction in the stability of emulsions in high concentrations of milk proteins, which may be associated with the competition between proteins for the interface. However, the cooperative effect between proteins was not evident. The application of the processes, ohmic heating and ultrasound, were of great value for the observation of protein changes, already known in other conventional processes. In this way, it was possible to emphasize the use of different techniques (due to the action of heat and electric fields and cavitation effect at controlled temperature) as promoters of conformational changes and protein interactions; allowing that in future studies the role of both can be evaluated more deeply bringing essential contribution from the technological point of view Doutorado Engenharia de Alimentos Doutora em Engenharia de Alimentos CNPQ 207273/2015-4;141768/2016-9

Orientador: Andrea Balan Fernandes Tese (doutorado) - Universidade Estadual de Campinas, Instituto de Biologia Resumo: Os transportadores ABC (ATP-Binding Cassette) formam uma grande superfamília de complexos de proteínas que promovem o transporte de uma ampla gama de substratos através de membranas biológicas em eucariotos e procariotos. Estruturalmente consistem em dois domínios transmembrana hidrofóbicos (TMDs) e dois domínios citoplasmáticos de ligação ao nucleotídeo (NBDs). No caso dos importadores, uma proteína periplasmática ou domínio de ligação ao substrato (SBP) adicional é responsável pela afinidade e a especificidade do transporte. Os importadores ABC de açúcares são de grande importância na nutrição e sobrevivência de bactérias patogênicas e a identificação e caracterização destes sistemas é um passo para o conhecimento sobre a fisiologia do microrganismo. Este trabalho, teve como objetivo principal o estudo de quatro sistemas ABC relacionados ao transporte de açúcares em M. tuberculosis: LpqY/SugABC, Rv2038c-41c, UspABC e UgpAEBC, por meio de análises comparativas genômicas, filogenéticas e estruturais. Os resultados evidenciaram que os transportadores ABC Rv2038c-41c e UgpAEBC são exclusivos de espécies patogênicas do gênero Mycobacterium e podem estar relacionados à infecção e patogenicidade. A comparação das SBPs, TMDs e NBDs de M. tuberculosis com ortólogos putativos e análises filogenéticas mostraram que os componentes se dividem em quatro grupos de acordo com a função dos transportadores. Análises estruturais associadas às de filogenia, revelaram que os componentes de membrana são os mais diversificados e que as principais diferenças nesses TMDs se encontram na região de interface com a proteína periplasmática. Os NBDs são os mais conservados e as SBPs divergem principalmente na região do sítio de interação com os ligantes. Estudos de modelagem e docagem molecular sugerem que LpqY seja uma proteína ligadora de trealose e Rv2041c de açúcares cíclicos. Adicionalmente, avaliamos a possibilidade de estudar as interações entre TMDs e NBDs dos transportadores ABC utilizando-se peptídeos miméticos às hélices de acoplamento. Para tal, foram usados peptídeos das hélices de acoplamento dos componentes transmembrana MalF e MalG e o componente citoplasmático MalK, do sistema de transporte de maltose MalEFGK2 de Escherichia coli. Ensaios biofísicos de fluorescência (Fluorescência Diferencial de Varredura, DSF; Termoforese em microescala, MST) e estudos de espalhamento de raios-X a baixo ângulo (SAXS) mostraram que MalK se liga aos peptídeos com um Kd entre 47.8 e 20.9 µmol L-1, e que MalK sofre desestabilização térmica na presença de MgCl2 e ATP, e do peptídeo MalFch. As análises de SAXS mostraram que os dois peptídeos desencadeiam mudanças conformacionais na proteína MalK. A análise da fluorescência intrínseca do triptofano mostrou que a fluorescência dos dois únicos triptofanos em MalK não muda na presença de ambos os peptídeos. Este trabalho evidenciou o papel dos transportadores ABC de açúcares em M. tuberculosis, e a partir de uma abordagem multidisciplinar mostrou o papel destes componentes na família de transportadores ABC. O uso de peptídeos codificando as hélices de acoplamentos dos componentes transmembrana, se mostrou como uma alternativa interessante para estudos de interação proteína-proteína nestes transportadores, e essa abordagem pode servir como modelo para o estudo destas interações em outros sistemas de membrana e futuros estudos de inibição destes transportadores em bactérias patogênicas Abstract: ABC (ATP Binding Cassette) transporters form a large superfamily of protein complexes that mediate the transport of a wide range of substrates across biological membranes in eukaryotes and prokaryotes. Structurally, they consist of two hydrophobic transmembrane domains (TMDs) and two cytoplasmic nucleotide-binding domains (NBDs). In the case of importers, an additional periplasmic substrate-binding protein or domain (SBP) is responsible for the affinity and specificity of the transport. Sugar ABC importers are of great importance for the nutrition and survival of pathogenic bacteria and the identification and characterization of these systems is a step towards knowledge about the physiology of the microorganism. This work had as main objective the study of four ABC systems related to sugar transport in M. tuberculosis, LpqY/SugABC, Rv2038c-41c, UspABC and UgpAEBC, through comparative genomic, phylogenetic, and structural analyzes. The results showed that the ABC transporters Rv2038c-41c and UgpAEBC are exclusive to pathogenic species of Mycobacterium genus and may be related to infection and pathogenicity. The comparison of M. tuberculosis SBPs, TMDs and NBDs with putative orthologs and phylogenetic analyzes showed that the components are divided into four groups according to the function of the transporters. Structural analyzes associated with those of phylogeny revealed that the membrane components are the most diversified and the main differences in these TMDs are found in the interface region with the periplasmic protein. NBDs are the most conserved and SBPs differ mainly in the region of the site of interaction with the substrates. Molecular modeling and docking studies suggest that LpqY and Rv2041c are a trehalose-binding protein and a cyclic sugar-binding protein, respectively. Additionally, we evaluated the possibility of studying the interactions between TMDs and NBDs of ABC transporters, using peptides mimetizing to the coupling helices. For this purpose, peptides from the coupling helices of the transmembrane components MalF and MalG and the cytoplasmic component MalK from the MalEFGK2 maltose ABC transport system of Escherichia coli were used. Biophysical fluorescence assays (Differential Scanning Fluorescence, DSF; Microscale thermophoresis, MST), and small angle X-ray scattering (SAXS) studies showed that MalK binds to peptides with a Kd between 47.8 and 20.9 µmol L-1, and that MalK undergoes thermal destabilization in the presence of MgCl2 and ATP, and of the MalFch peptide. SAXS analyzes showed that both peptides trigger conformational changes in the MalK protein. Analysis of the intrinsic fluorescence of tryptophan showed that the fluorescence of the only two tryptophans in MalK does not change in the presence of both peptides. This work highlighted the role of sugar ABC transporters in M. tuberculosis, and from a multidisciplinary approach showed the role of these components in the ABC transporter family. The use of peptides encoding the coupling helix of the transmembrane components, proved to be an interesting alternative for studies of protein-protein interaction in these transporters, and this approach can serve as a model for the study of these interactions in other membrane systems and future transporter inhibition studies in pathogenic bacteria Doutorado Genética de Microorganismos Doutora em Genética e Biologia Molecular CAPES 001 FAPESP 2018/20162-9

Agradecimentos: The present work was supported by FAPESP [grant number: 2014/09720-9 (to M.T.M.); grant numbers: 2018/04017-9 and 2013/08135-2 (to E.M.E); grant number: 2014/00584-5 (to L.G.D.); grant number: 2011/20229-7 (to L.H.P.A); grant number: 2009/14257-8 (to A.F.Z.N.); grant number: 2016/10862-8 (to J.S.A); grant number: 2014/03989-6 (to R.M.P.S.J.)]. Grant to multiuser facilities [grant number: 2004/08868-0]; CNPq [grants numbers: 478059/2009-4 and 486841/2012-0 (to M.T.M.), grants numbers: 457603/2013-5 and 309187/2015-0 (to E.M.E)] and CAPES [grant number: 88887.137811/2017-00 (to R.M.P.S.J.) Abstract: Myosin Va (MyoVa) is an actin-based molecular motor that plays key roles in the final stages of secretory pathways, including neurotransmitter release. Several studies have addressed how MyoVa coordinates the trafficking of secretory vesicles, but why this molecular motor is found in exosomes is still unclear. In this work, using a yeast two-hybrid screening system, we identified the direct interaction between the globular tail domain (GTD) of MyoVa and four protein components of exosomes: the WD repeat-containing protein 48 (WDR48), the cold shock domain-containing protein E1 (CSDE1), the tandem C2 domain-containing protein 1 (TC2N), and the enzyme spermine synthase (SMS). The interaction between the GTD of MyoVa and SMS was further validated in vitro and displayed a Kd in the low micromolar range (3.5 ± 0.5 µM). SMS localized together with MyoVa in cytoplasmic vesicles of breast cancer MCF-7 and neuroblastoma SH-SY5Y cell lines, known to produce exosomes. Moreover, MYO5A knockdown decreased the expression of SMS gene and rendered the distribution of SMS protein diffuse, supporting a role for MyoVa in SMS expression and targeting FUNDAÇÃO DE AMPARO À PESQUISA DO ESTADO DE SÃO PAULO - FAPESP CONSELHO NACIONAL DE DESENVOLVIMENTO CIENTÍFICO E TECNOLÓGICO - CNPQ COORDENAÇÃO DE APERFEIÇOAMENTO DE PESSOAL DE NÍVEL SUPERIOR - CAPES Aberto

Agradecimentos: This study was funded by Fundação de Amparo do Estado de São Paulo FAPESP (2012/50161-8, 2014/17264-3 and 2015/15822-1), CNPq (305018/2015-9 and 306943/2015-8) and CAPES (88887.125517/2016-00). We thank the National Laboratory of Synchrotron Light (Campinas, SP, Brazil) and its staff for the use of SAXS beam line facilities. We acknowledge the Protein Analysis Facility (Center for Integrative Genomics, Faculty of Biology and Medicine, University of Lausanne, Switzerland) for cross-linking MS data Abstract: Proteostasis is dependent on the Hsp70/Hsp90 system (the two chaperones and their co-chaperones). Of these, Hop (Hsp70/Hsp90 organizing protein), also known as Sti1, forms an important scaffold to simultaneously binding to both Hsp70 and Hsp90. Hop/Sti1 has been implicated in several disease states, for instance cancer and transmissible spongiform encephalopathies. Therefore, human and yeast homologous have been better studied and information on plant homologous is still limited, even though plants are continuously exposed to environmental stress. Particularly important is the study of crops that are relevant for agriculture, such as Sorghum bicolor, a C4 grass that is among the five most important cereals and is considered as a bioenergy feedstock. To increase the knowledge on plant chaperones, the hop putative gene for Sorghum bicolor was cloned and the biophysical and structural characterization of the protein was done by cross-linking coupled to mass spectroscopy, small angle X-ray scattering and structural modeling. Additionally, the binding to a peptide EEVD motif, which is present in both Hsp70 and Hsp90, was studied by isothermal titration calorimetry and hydrogen/deuterium exchange and the interaction pattern structurally modeled. The results indicate SbHop as a highly flexible, mainly alpha-helical monomer consisting of nine tetratricopeptide repeat domains, of which one confers high affinity binding to Hsp90 through a conserved carboxylate clamp. Moreover, the present insights into the conserved interactions formed between Hop and Hsp90 can help to design strategies for potential therapeutic approaches for the diseases in which Hop has been implicated CONSELHO NACIONAL DE DESENVOLVIMENTO CIENTÍFICO E TECNOLÓGICO - CNPQ COORDENAÇÃO DE APERFEIÇOAMENTO DE PESSOAL DE NÍVEL SUPERIOR - CAPES FUNDAÇÃO DE AMPARO À PESQUISA DO ESTADO DE SÃO PAULO - FAPESP Fechado

Dissertação de Mestrado em Bioquímica apresentada à Faculdade de Ciências e Tecnologia Devido à relevância das interações proteicas nas diferentes funções celulares, é importante conseguir detetar a existência das mesmas. Como os métodos computacionais conseguem lidar com um grande número de dados de forma rápida, têm sido muito usados na previsão das interações proteína-proteína. Dessa forma esta tese pretende, com o recurso a novas features, desenvolver um método que melhore a performance da previsão de interações proteicas num dataset aleatório. O resultado destas pesquisas foram três novas abordagens de extração de features sendo elas o recurso a bases de dados de inibidores, o recurso a redes de co-expressão génica e o recurso a módulos de reconhecimento peptídico. Destas três, devido à maior simplicidade e praticabilidade, desenvolveu-se estudos usando a última abordagem enunciada, recorrendo nomeadamente aos domínios SH3, SH2, PDZ, WW e LRR. Para saber se estes domínios são uma boa fonte de features e que podem ser usados utilizando qualquer dataset, analisaram-se os mesmos na deteção de novas interações entre proteínas que não os possuem. Assim no decorrer do trabalho desta tese foram criadas três estratégias, a primeira baseava-se na extração de features pelo software PyDPI (fazendo uso dos descriptors AAC, CTD, Moranauto, QSO, SOCN e CT) e na avaliação da performance dos datasets por descriptor; a segunda estratégia recorreu às mesmas features mas avaliou a performance em datasets com todos os descriptors; a terceira estratégia avaliou a performance como a segunda estratégia mas usando features criadas para o artigo “A Sequence-Based Mesh Classifier for the Prediction of Protein-Protein Interactions". As duas primeiras estratégias foram postas de parte devido a metodologia incorreta e a valores pouco significativos. A terceira estratégia apesar de ter sido efetuada de uma forma bastante controlada também resultou em valores pouco significativos, pelos que se aconselha ao prosseguimento do estudo desta abordagem com novas estratégias e features. Due to the relevance of protein interactions in different cellular functions, it is important to be able to detect their existence. Because computational methods can handle large numbers of data quickly, they have been widely used in predicting protein-protein interactions. Thus, this thesis intends, with the use of new features, to develop a method that improves the predictive performance of protein interactions in a random dataset. The results of these researches were three new approaches of extraction of features, being: the use of databases of inhibitors, the use of gene co-expression networks and the use of peptide recognition modules. Of these three, due to the greater simplicity and practicality, studies were developed using the last approach enunciated, resorting in particular to the SH3, SH2, PDZ, WW and LRR domains. In order to know if these domains are a good source of features and that can be used using any dataset, they were analyzed in the detection of new interactions between proteins that do not possess them. Thus, in the course of the work of this thesis three strategies were created, the first one was based on the extraction of features by the software PyDPI (making use of descriptors AAC, CTD, Moranauto, QSO, SOCN and CT) and in the performance evaluation of datasets by descriptor ; the second strategy resorted to the same features but evaluated the performance in datasets with all descriptors; the third strategy evaluated performance as the second strategy but using features created for the article "The Sequence-Based Mesh Classifier for the Prediction of Protein-Protein Interactions." The first two strategies were set aside due to incorrect methodology and poor values. The third strategy, despite being carried out in a very controlled manner, also resulted in insignificant values, for which it is advisable to continue the study of this approach with new strategies and features.

O transcriptograma, um método utilizado na análise de transcriptomas, utiliza dados de interação proteína-proteína para construir uma lista ordenada de genes. Nesta lista, genes são posicionados de forma que a probabilidade de interação entre seus produtos decaia exponencialmente com o aumento da distância entre suas posições. A lista ordenada de genes é então utilizada para calcular o valor de expressão médio de genes funcionalmente associados numa janela com raio configurável, permitindo a expressão diferencial de grupos gênicos não pré-definidos em estudos caso-controle. O objetivo deste estudo é a implementação de um pacote em R que use transcriptogramas e integre funcionalidades de pacotes já conhecidos pela comunidade científica, capaz de realizar: expressão diferencial, enriquecimento funcional, e visualização de rede. O pacote transcriptogramer foi implementado e encontra-se disponível no Bioconductor, um repositório para softwares open source desenvolvidos na linguagem R para utilização em bioinformática. Numa comparação entre o transcriptogramer e um pipeline combinando funcionalidades dos pacotes limma e topGO, observou-se que o transcriptogramer identificou aproximadamente 10 vezes mais termos do Gene Ontology significativamente enriquecidos, dentre os quais foram encontrados a maioria dos termos identificados pelo pipeline convencional. The transcriptogram, a method used on transcriptomes analysis, uses protein-protein interaction data to build an ordered gene list. On this list, genes are placed such that the probability of interaction between its products exponentially decreases with the increase of the distance between its positions. The ordered gene list is then used to calculate the average expression value of functionally associated genes in a window with settable radius, allowing the differential expression of non-predefined gene sets in case-control studies. This study aims to implement an R package that uses transcriptograms and integrates features from packages known by the scientific community, able to perform: differential expression, functional enrichment, and network visualization. The transcriptogramer package was implemented and is available at Bioconductor, a repository for open source softwares developed in the R language for use in bioinformatics. In a comparison between the transcriptogramer and a pipeline combining features from limma and topGO packages, was noticed that the transcriptogramer identified nearly 10 times more Gene Ontology terms significantly enriched, among which most of the terms identified by the conventional pipeline were found.

Orientador: Andréa Dessen de Souza e Silva Tese (doutorado) - Universidade Estadual de Campinas, Instituto de Biologia Resumo: As interações entre proteínas desempenham papéis biológicos importantes nas células, como no caso da biossíntese do peptideoglicano (PG), maior componente da parede celular bacteriana e responsável por definir a morfologia e proteger a célula do estresse causado pela alta pressão osmótica intracelular presente tanto em bactérias Gram-negativas como Gram-positivas. A síntese do PG é um processo dinâmico e altamente complexo, consistente de muitos passos de síntese que são orquestrados por diferentes enzimas localizadas em diferentes espaços na célula. As ligases Mur (MurC a MurF) são as proteínas responsáveis por catalisar a síntese dos precursores de PG no citoplasma juntamente com as proteínas MurG e MraY, as quais também estão relacionadas com a síntese dos precursores do PG na membrana, lipídeo I e lipídeo II, respectivamente. Esse grupo de proteínas são essenciais para a sobrevivência da bactéria e são encontradas somente em células de organismos procariota, deste modo, tornando-se alvos potenciais para o desenvolvimento de novos antibióticos. No presente trabalho foi realizada a expressão e purificação de MraY de Streptococcus pneumoniae, proteína integral de membrana, e foi analisada a sua possível interação com a enzima MurF. Existem muitas evidências sobre a formação de complexos entre essas proteínas, no entanto este trabalho descreve de forma inédita a interação direta entre as ligases Mur de Streptococcus pneumoniae, as quais formam um mega-complexo em solução. Também observamos que a interação entre essas proteínas está fortemente relacionada com a presença dos seus estados oligoméricos. Outro achado inédito é a habilidade de MurG de se auto associar em diferentes espécies, dependendo da concentração de detergente em solução, representando um processo dinâmico, importante para a montagem do mega-complexo entre as ligases Mur, uma vez que a interação entre essas proteínas também foi observada neste estudo. Assim, a formação do mega-complexo pode ser explorada como um mecanismo regulatório espacial e temporal da síntese do peptideoglicano Abstract: Protein interactions play important biological roles for cells, as in the case of the biosynthesis of peptidoglycan (PG), the major component of the bacterial cell wall. The PG is involved in the determination of cell morphology and protection against osmotic stress, both in Gram-negative and Gram-positive bacteria. The synthesis of PG is a dynamic and highly complex process, which requires many steps mediated by different enzymes located in different compartments of the cell. The Mur (MurC to MurF) ligases are responsible for the catalysis of the synthesis of PG precursors in the cytoplasm, together with the MurG and MraY proteins, which are related to the synthesis of lipid I and lipid II respectively. These proteins are essential for bacterial survival and are found only in prokaryotic organisms, and are thus potential targets for the development of new antibiotics. Here we present the expression and purification of MraY from Streptococcus pneumoniae, an integral membrane protein, as well as its analysis of the interaction with MurF. There is vast evidence regarding the formation of complexes between these proteins; however, this work describes, for the first time, the direct interaction between the Mur ligases of Streptococcus pneumoniae, which form a mega-complex in solution. We also observed that the interaction between these proteins is strongly related to the presence of their oligomeric forms. Interestingly, we have found that S. pneumoniae MurG is able to self-associate and form different oligomeric species in solution. This fact represents a dynamic process, important for the assembly of a mega-complex within the cytoplasm, and could be representative of a spatial and temporal PG-regulatory mechanism Doutorado Genética de Microorganismos Doutora em Genética e Biologia Molecular FAPESP 2013/02451-0

Orientadores: Jörg Kobarg, José Xavier Neto Tese (doutorado) - Universidade Estadual de Campinas, Instituto de Biologia Resumo: A proteína UNC-76 foi identificada como essencial para a fasciculação e elongação de axônios em Caenorhabditis elegans. Da mesma forma, a proteína ortóloga de mamíferos FEZ1 apresenta expressão em tecidos neuronais e camundongos knockout para o gene FEZ1 apresentaram desvios de comportamento que remetem à hiperatividade e resposta alterada à psicoestimulantes. Já a proteína FEZ2 tem expressão ubíqua e sua função parece estar relacionada aos seus parceiros de interação. Trabalhos do grupo mostraram que FEZ1 é uma proteína multifuncional (hub), capaz de interagir com inúmeras proteínas através do C-terminal, e apresenta estrutura naturalmente desenovelada, formando dímero através do N-terminal. Dados da literatura demonstraram que FEZ1 está relacionada ao desenvolvimento neuronal, crescimento axonal e organização dos microtúbulos/transporte celular. Dessa forma, FEZ1 se caracteriza como uma proteína tipicamente citoplasmática que poderia atuar junto ao citoesqueleto como uma proteína adaptadora dimérica e bivalente. Essa hipótese foi reforçada pelas observações de que FEZ1 interage e colocaliza com elementos do citoesqueleto e proteínas motoras do tipo kinesina. Além disso, algumas evidências da literatura demonstraram a relação de FEZ1 com proteínas nucleares, envolvidas na regulação transcricional e reorganização de cromatina bem como a sua presença em frações nucleares. Nesse trabalho foi caracterizado o papel nuclear de FEZ1 através da sua interação com o receptor do ácido retinóico (RAR). Foi possível demonstrar, através de experimentos in vitro e em cultura de células, a interação proteína-receptor bem como relacionar a expressão de FEZ1 com a indução do gene hoxb4 e, com isso, um papel para FEZ1 no complexo de transcrição gênica. Além disso, a partir de evidências da literatura e de trabalhos prévios do grupo demonstrando que a superexpressão de FEZ1 provocou o aparecimento de núcleos multilobulados em mais de 40% de células, sendo este fenótipo comum em alguns tipos de leucemia e associado à resistência das células tumorais a drogas, avaliou-se neste trabalho a expressão de FEZ1 em tecidos de pacientes leucêmicos. Em conjunto, esses dados demonstram novas atribuições para FEZ1: funcionalmente envolvida com o receptor do ácido retinóico e com a transcrição e patologicamente associada à leucemia mielóide aguda Abstract: The protein UNC-76 was identified as an essential component for axon fasciculation and elongation in Caenorhabditis elegans. In the same line its mammalian ortholog FEZ1 presents neuronal expression and its gene knockout in mice showed hyperactivity and altered response to psychostimulants. The human paralogue FEZ2 shows ubiquitous expression and its functions seems to be related to its interaction partners. Our group previous works showed that FEZ1 is a multifunctional (hub) protein, meaning that interacts with many other proteins through its C-terminal, and structurally is natively unfolded and dimerizes through its N-terminal. Functionally, data from the literature, have shown that FEZ1 relates to neuronal development, axon outgrowth and microtubule organization/cellular transport. Hence FEZ1 is typically cytoplasmic and could act at the cytoskeleton as a dimeric and bivalent transport adaptor. This hypothesis is further supported by the observation that FEZ1 interacts and colocalizes with cytoskeleton elements and motor proteins of the kinesin family. Furthermore, evidences from the literature also demonstrated FEZ1¿s relation to nuclear proteins involved in transcription regulation and chromatin reorganization, as well as the presence of FEZ1 in nuclear extracts. This work characterized the nuclear role of FEZ1 by addressing its interaction with the retinoic acid receptor (RAR). It was demonstrated, through in vitro and cell culture experiments, the protein-receptor interaction as well as the relation of FEZ1 expression to the induction of hoxb4 gene and, therefore, a possible role for FEZ1 in a transcriptional regulation complex. Moreover, after literature evidence and also findings from our group that the super expression of FEZ1 caused the generation of "flower-like" nuclei in more than 40% cells, which is a phenotype commonly found in certain leukemias and has been associated to an increased drug resistance of the cells, this work also deepened the understanding of the expression of FEZ1 by evaluating these protein expression in leukemic patient tissue. The data provided here added new attributions to FEZ1 protein: functionally involved with retinoic acid receptor and transcription and pathologically associated to acute myeloid leukemia Doutorado Bioquímica Doutora em Biologia Funcional e Molecular FAPESP 2012/00792-1, 2016/11059-1

A paracoccidioidomicose (PCM) é uma micose sistêmica endêmica no Brasil, onde são registrados cerca de 80% dos casos mundiais, e possui como agente etiológico o fungo Paracoccidioides spp. A Malato sintase (MLS) é uma importante enzima relacionada ao metabolismo fúngico, uma vez que é essencial no ciclo do glioxilato, uma via metabólica importante de produção de glicose para parede celular, sendo exclusiva de micro-organismos e plantas. Sua ausência em humanos a torna um alvo interessante de estudo, principalmente, no desenho racional de fármacos. A partir de recentes estudos in vitro, várias proteínas que interagem com a PbMLS (receptor) foram classificadas, porém os modos de interação e as regiões chaves envolvidas nas interfaces proteína-proteína (IPP’s), não foram ainda descritas. Neste trabalho, 6 (seis) proteínas ligantes (PL) foram selecionadas para verificar suas interações com PbMLS. As estruturas tridimensionais dessas proteínas, bem como de PbMLS, foram preditas por homologia, usando o servidor I-TASSER. Simulações de dinâmica molecular (DM) foram realizadas pelo programa GROMACS, e os modos das conformações mais representativas de cada proteína foram determinados baseando-se nas análises de agrupamentos a partir das trajetórias geradas por DM. Simulações de ancoragem molecular com GRAMM-X foram então realizadas entre os modos conformacionais de PbMLS contra os obtidos de PL’s, resultando num total de 36 complexos. Baseado na frequência maior de alguns pequenos fragmentos de proteínas, observados nas IPP’s, 57 peptídeos de tamanhos entre 5 e 20 resíduos de aminoácidos, foram inicialmente selecionados a partir de 5 regiões da PbMLS consideradas mais frequentes na interação proteína-proteína. Simulações com FlexPepDock foram realizadas para otimizar as coordenadas atômicas dos peptídeos complexados com MLS e, concomitantemente, simulações com PepFOLD foram realizadas para avaliar a estabilidade de cada peptídeo em solução. Com base nos mais baixos scores de energia dos peptídeos ligados a MLS bem como na estabilidade de suas estruturas não ligadas em solução , 5 peptídeos foram selecionados como promissores ligantes ao modo 1 de MLS. A estabilidade e os padrões de interações destes peptídeos são avaliados em detalhes. Paracoccidioidomycosis (PCM) is a systemic mycosis endemic in Brazil, where are recorded about 80% of cases worldwide, and has Paracoccidioides sp. as the etiologic agent. Malate synthase (MLS) is an important enzyme related to the fungal metabolism, once it is essential in the glyoxylate cycle, a secondary metabolic pathway of the citric acid cycle exclusive to microorganisms and plants. Its absence in humans makes this enzyme an interesting subject to study, mainly in rational drug design. From recent in vitro studies, several interacting proteins of MLS (receiver) were classified, but the modes of interaction and key regions involved in protein-protein interfaces (PPIs) have not yet been described. In this work, six (6) binding proteins (BPs) were selected to describe the IP's of MLS. Their tridimensonal structures, as well as MLS, were predicted by homology modeling using I-TASSER server, and subsequent molecular dynamics simulations (MD). The most common conformational modes of each protein were obtained by cluster analysis of the trajectories generated by MD. Molecular docking simulations using Gramm-X were then performed for the conformational modes of MLS against the BP's, resulting in a total of 36 complexes. Based on the higher frequency of some small fragments of proteins observed in the IPP's, 57 peptides with sizes between 5 and 20 residues, were initially selected from 5 regions of MLS which are considered more frequent in protein-protein interaction. FlexPepDock simulations were performed to optimize the atomic coordinates of the peptide complexed with MLS, and concomitantly, PepFOLD simulations were performed to evaluate the stability of each peptide in solution. Based on the lower energy score of peptides linked to MLS, and the stability of their structures in solution (MLS-free), 6 peptides were selected as promising ligands to MLS mode 1. The stability and patterns of interactions of these peptides were evaluated in detail. Coordenação de Aperfeiçoamento de Pessoal de Nível Superior - CAPES

Orientador: Ana Carolina Migliorini Figueira Tese (doutorado) - Universidade Estadual de Campinas, Instituto de Biologia Resumo: Receptores Nucleares (RNs) são proteínas ativas na presença de moléculas pequenas e hidrofóbicas, os quais atuam na regulação direta sobre a transcrição de genes. Os Receptores de Hormônios Tireoidianos (TRs) são RNs que possuem efeitos na taxa metabólica e consumo de oxigênio, e também funções únicas em diversos órgãos. Os TRs possuem duas isoformas: TR? e TR?, e sua expressão é diferenciada em vários tecidos. Os hormônios que se ligam aos TRs são a tiroxina (T4) e a triiodotironina (T3). Atualmente, um melhor entendimento sobre a regulação da transcrição por estes receptores tem se tornado uma necessidade para o mapeamento de diferenças que poderiam resultar em novos alvos para a regulação de diversas patologias. Para isso, usamos screenings de duplo-híbrido (y2h) e imunoprecipitação (IP) seguida de espectrometria de massas (LC-MS/MS) para identificar o maior número possível de parceiros de interação, buscando diferenças entre suas isoformas e a influência do T3 nestas interações. Primeiramente, concluímos que TR? faz mais interações com outras proteínas, se comparado à isoforma ?. Em segundo lugar, observamos a diminuição da expressão de TRs após tratamento com T3. Em terceiro lugar, foram montadas redes de interação nas quais foram evidenciados os processos biológicos nos quais os candidatos participam. Em seguida, algumas interações encontradas com proteínas reguladoras de ciclo celular foram confirmadas por co-imunoprecipitação (Co-IP), sendo uma delas formada por TR-PDI. Esta interação foi investigada mais profundamente e nossos resultados demonstram que a PDI é capaz de interferir na expressão regulada por TR, sendo que o knockdown de PDI revelou a alteração na expressão de alguns genes. Este complexo foi caracterizado através de ensaios biofísicos e observamos que a formação do complexo não altera o recrutamento de coativadores por TR. Por fim, modelos in silico demonstraram as possíveis interfaces de interação do complexo. Com isso, sugerimos que TRs podem ter um papel muito importante em vias pouco estudadas como ciclo celular, e que mecanismos redox podem ser importantes para alterar a regulação gênica mediada por TR Abstract: Nuclear Receptors (NRs) are proteins activated by small hydrophobic molecules that act directly in regulation of gene expression. Thyroid Hormone Receptors (TRs) are NRs involved in maintaining metabolic rates, oxygen consumption and have unique functions in different organs. There are two isoforms of TRs: TR? and TR?, each one has different expression among human tissues. The small hydrophobic molecules responsible for TRs regulation are triiodothyronine (T3) and thyroxine (T4) hormones. Nowadays, a deeply understanding of indirect non-classical transcription regulation by TRs could lead to a better mapping of the main differences between normal and pathological states of the cell. To do so, we performed screenings in yeast two-hybrid system (y2h) and immunoprecipitation (IP) followed by Mass Spectrometry (LC-MS/MS) to identify novel interactors for TRs and to elucidate possible differences between both isoforms plus and minus T3. The results showed TR? binding a superior number of interactors in comparison with TR?. In second place, treatment with T3 decreases TR expression. In third place, we build interactomes for TRs and we classified the protein candidates by biological process (BP). Following, important candidates from cell cycle regulation BP were confirmed by Co-immunoprecipitation (Co-IP) with TRs. One of those interactions, TR-PDI was further investigated and our results showed that PDI changes TR-gene regulation in reporter gene assays. In addition, PDI knockdown alters expression of some genes. In Biophysical Assays we characterized TR-PDI complex and measure binding affinities (Kd). We observed that complex formation do not change coactivator recruitment. Finally, we built in silico models in order to elucidate TR-PDI possible interfaces of interaction. Overall, we suggest that TRs have important roles in less studied pathways, as cell cycle regulation, and TRs could be regulated by redox mechanism to change gene expression Doutorado Fármacos, Medicamentos e Insumos para Saúde Doutora em Ciências FAPESP 2011/23659-2, 2014/22215-1, 2013/08743-2

Estudos que envolvem estrutura de proteínas lidam na maioria das vezes com uma grande quantidade de informação. Para compreender melhor o processo de interações proteína-proteína é necessário estudar os fenômenos que ocorrem em suas interfaces moleculares. Interações podem ser observadas do ponto de vista de resíduos, porém sabe-se que elas ocorrem na realidade em nível atômico. Vários paradigmas propõem formas distintas para definir interações atômicas e sabe-se que é necessário comparar estes paradigmas para melhorar nossa compreensão sobre interações moleculares, permitindo abranger nosso conhecimento sobre os vários mecanismos e funções celulares. Com isso, propomos aqui o banco de dados CAPRI, para análise comparativa entre três paradigmas distintos que são usados paradefinir contatos em interface proteína-proteína. O banco de dados CAPRI possui informações de cerca de 45 mil complexos proteicos, contendo dados quanto as interações realizadas entre pares de átomos, resíduos e cadeias. Ao todo, quatro tipos de interações são investigadas,sendo elas: pontes de hidrogênio, interações hidrofóbicas, pontes salinas e empilhamento aromático. Os resultados obtidos, juntamente com a obtenção da base de dados criada podem ser acessados através do endereço: http://homepages.dcc.ufmg.br/~pmartins/capri1/. Studies involving protein structures most often deal with a large amount of information. To understand the process of protein-protein interactions is necessary to study the processes that occur in their molecular interfaces. Interactions can be observed at the residue level, but it is known that they occur in reality at the atomic level. Several paradigms propose different ways to define atomic interactions, and it is known that it is necessary to compare these paradigms to improve our understanding of the molecular interactions allowing to expand our knowledge of the many mechanisms and cellular functions. Thus, we propose herethe CAPRI database for comparative analysis of three different paradigms that are used to define contacts in protein-protein interface. CAPRI has information of about 45,000 protein complexes containing data about interactions between pairs of atoms, residue and chains. Four types of interactions are investigated: hydrogen bonds, hydrophobic interactions, salt bridges and aromatic stacking. The results and the database can be accessed through the link: http://homepages.dcc.ufmg.br/~pmartins/capri1/.

O uso de solventes específicos para extração de proteínas determina o tipo de reação química que ocorre entre os componentes proteicos, principalmente quando estes foram submetidos a tratamentos térmicos como a extrusão termoplástica, uma tecnologia de alta versatilidade, baixo custo, alta produtividade e que não gera efluentes. No entanto, é necessário o uso de concentrações adequadas dos solventes para maximizar a extração das proteínas. Neste trabalho foi avaliada a solubilização de proteínas de análogo de carne a base de isolado proteico de soja e glúten vital, submetidos ao processo de extrusão termoplástica a baixa (23%) e alta (60%) umidade. Os solventes utilizados foram: tampão fosfato (pH 7,5) de 10, 20, 40, 60, 80 e 100mM, dodecil sulfato de sódio de 1, 2, 3, 4 e 5%, β-mercaptoetanol de 1, 2, 3 e 4%, Triton X-100 de 1, 2, 3 e 4% e ureia de 6, 7, 8, 9 e 10M. Todos os reagentes foram dissolvidos ou solubilizados em tampão fosfato 40mM (pH 7,5). Os resultados mostraram que as maiores extrações proteicas foram obtidas com o uso de 40mM de tampão fosfato, 2% de dodecil sulfato de sódio, 2% de β-mercaptoetanol, 3% de Triton X-100 e 7M de ureia The use of specific solvents for protein extraction determines the type of chemical reaction, which occurs between the protein components, mainly when the protein was submitted to thermal treatment, such as thermoplastic extrusion, a technology with high versatility, low cost and high throughput and without effluent generation. However, it is necessary to use adequate solvents concentration in order to maximize the protein extraction. The aim of this research was to evaluate the protein solubilization of meat analogue based on isolate soy protein and vital gluten submitted to thermoplastic extrusion process at low moisture content (23%) and high moisture content (60%). The solvents used were: phosphate buffer (pH 7.5) at 10, 20, 40, 60, 80 and 100mM, sodium dodecyl sulphate at 1, 2, 3, 4 and 5%, β-mercaptoethanol at 1, 2, 3 and 4%, Triton X-100 at 1, 2, 3 and 4% and urea at 6, 7, 8, 9 and 10M. All the chemical reagents were dissolved or solubilized in phosphate buffer 40mM (pH 7.5). The results showed that the highest protein extraction were obtained when phosphate buffer 40mM, sodium dodecil sulphate 2%, β-mercaptoethanol 2%, Triton X-100 3% and urea 7M were used

Orientadores: Ricardo Aparicio, Juliana Helena Costa Smetana Tese (doutorado) - Universidade Estadual de Campinas, Instituto de Biologia Resumo: O câncer é um conjunto de doenças de proliferação celular descontrolada cuja incidência na população mundial cresce continuamente ano após ano, atingindo índices alarmantes. A origem dos diversos tipos de câncer está em alterações genéticas e metabólicas das células, dentre as quais se destacam as alterações na sinalização celular mediada pela fosforilação reversível de proteínas, um processo altamente regulado por proteínas quinases e fosfatases. Neste trabalho, foram estudadas as fosfatases humanas PP2A e PTP1B. A proteína tirosina fosfatase PTP1B é superexpressa em tumores e está envolvida no câncer e em outras doenças como resistência a insulina e diabetes tipo 2, sendo considerada um bom alvo para o desenvolvimento de novas drogas. Nessa direção, foram analisadas várias séries de pequenas moléculas quanto à capacidade inibitória, tendo sido realizados esforços na obtenção de complexos cristalográficos. A PP2A é uma serina-treonina fosfatase que atua na célula como um importante supressor tumoral, exercendo sua atividade na forma de heterotrímeros formados por uma subunidade catalítica (PP2Ac), uma de ancoragem (PR65/A) e uma subunidade reguladora variável pertencente a uma dentre quatro famílias distintas (B/B¿/B" e striatins). O processo de montagem desses heterotrímeros é fortemente regulado por outras proteínas, e envolve modificações pós-traducionais no extremo C-terminal da PP2Ac em um processo conhecido como biogênese da PP2A. A proteína TIPRL inibe a atividade de PP2A e há evidências de que atue em algum ponto do processo de biogênese. Esta tese reporta avanços significativos no estudo da TIPRL e sua interação com a PP2Ac, dentre eles, a estrutura cristalográfica da TIPRL, determinada a partir de proteína marcada com Se-Met, uma vez que não havia qualquer informação estrutural disponível nos bancos de dados, que pudesse ser utilizada para Substituição Molecular. A estrutura apresenta um novo tipo de enovelamento e um inesperado sítio de interação com o C-terminal da PP2A, conforme indicam nossos estudos, realizados por mutagênese sítio-dirigida, pulldown e análise de troca hidrogênio/deutério acoplada a espectrometria de massas. Esses resultados permitiram, pela primeira vez, propor uma função biológica para a TIPRL na biogênese da PP2A Abstract: The incidence of cancer in the world population continually grows year after year, reaching alarming levels. Cancer is characterized by uncontrolled cell proliferation, originated from genetic and metabolic anomalies including changes in cell signaling mediated by the reversible phosphorylation of proteins, a highly regulated process mediated by protein kinases and phosphatases. The present work focused on studies of human phosphatases PP2A and PTP1B. The protein tyrosine phosphatase PTP1B is overexpressed in tumors and is involved in cancer and other diseases such as insulin resistance and type 2 diabetes, and is considered a good target for the development of new drugs. Accordingly, we analyzed several series of small molecules for inhibitory capacity, and efforts have been made to obtain crystallographic structures of enzyme-drug complexes. PP2A is a serine-threonine phosphatase that functions as a major cellular tumor suppressor and exerts its activity as heterotrimers consisting of a catalytic subunit (PP2Ac), a scaffolding (PR65/A) and a variable regulatory subunit belonging to one of four distinct families (B/B¿/B" and striatins). The assembly process of such heterotrimers is tightly regulated by other proteins, and involves post-translational modifications at the C-terminus of PP2Ac in a process known as PP2A biogenesis. The TIPRL protein inhibits PP2A activity and there is evidence that this protein might function in the biogenesis process. This thesis reports significant advances in the study of TIPRL and its interaction with PP2Ac, such as the crystal structure of TIPRL determined from Se-Met labelled protein since there was no structural information available in databases that could be used for Molecular Replacement. The structure presents a new folding and an unexpected site binding site for the C-terminus of PP2A, which was validated by site-directed mutagenesis, pulldown and of hydrogen/deuterium exchange analysis by mass spectrometry. These results allowed us to propose a biological role for TIPRL in the biogenesis of PP2A Doutorado Genética Animal e Evolução Doutora em Genética e Biologia Molecular FAPESP 2011/03054-9 CNPQ 141356/2011-1

Orientador : Prof. Dr. Luciano Fernandes Huergo Tese (doutorado) - Universidade Federal do Paraná, Setor de Ciências Biológicas, Programa de Pós-Graduação em Ciências : Bioquímica. Defesa: Curitiba, 09/11/2015 Inclui referências : f. 137-154 Resumo: As proteínas PII são proteínas transdutoras de sinais, ubíquas em bactérias. Elas estão envolvidas com a regulação do metabolismo de nitrogênio e atuam principalmente por interação direta com proteínas alvo em resposta a ligação dos efetores ATP, ADP e 2-oxoglutarato (2-OG). A ligação de efetores por PII acarreta em alterações conformacionais que refletem diretamente na interação de PII com proteínas alvo. Em Azospirillum brasilense existem duas proteínas PII denominadas GlnB e GlnZ, relacionadas com a ativação transcricional de genes do metabolismo de nitrogênio e regulação pós traducional da nitrogenase em resposta a alteração dos níveis celulares de amônio e 2-OG. Visto que proteínas PII têm a capacidade de sensoriar 2-OG, um metabólito diretamente relacionado ao nível de carbono e nitrogênio celular, é possível que proteínas PII possam desempenhar um papel regulatório no metabolismo de carbono, porém essa hipótese ainda não foi confirmada. Como a atuação de proteínas PII se dá principalmente por interação proteína-proteína, o objetivo deste trabalho foi detectar novas proteínas ligantes das proteínas PII em A. brasilense, para melhor compreender o papel de PII no metabolismo deste organismo. Foram realizados ensaios de interação entre a proteína GlnZ com cauda 6xHis imobilizada em coluna de afinidade e extratos proteicos de A. brasilense 2812 (glnB-/glnZ-), com variação dos efetores ADP, ATP e 2-OG para interação e eluição das proteínas. As proteínas obtidas foram analisadas por espectrometria de massa e classificadas em grupos funcionais. Dentre as proteínas identificadas destacou-se a proteína BCCP (componente da enzima acetil- CoA carboxilase - ACC) por já ter sido descrita por interagir com PII em Arabidopsis thaliana. O gene accB (BCCP) foi clonado do genoma de A. brasilense FP2 e ensaios in vitro foram realizados para caracterização do complexo PII-BCCP. Foram realizados ensaios de atividade com a enzima ACC de Escherichia coli (EcACC) e com proteínas PII de E. coli (EcGlnB), A. brasilense (AbGlnB) e Synechococcus elongatus (SeGlnB) para verificação do efeito de PII na atividade de ACC. Os dados obtidos sugerem uma função conservada de GlnB na regulação da biossíntese de ácidos graxos através de inibição de ACC, uma vez que as proteínas GlnB diferentes organismos foram capazes de inibir a enzima EcACC. O efeito inibitório de EcGlnB e AbGlnB sobre EcACC foi afetado por altas concentrações de 2-OG e por uridililação de PII. Esses dados, juntamente com a análise de variantes de GlnB, sugerem a participação do loop T de GlnB na interação GlnB-ACC. O modelo proposto para a inibição de ACC por GlnB sugere que isso ocorra em baixos níveis de carbono e altos níveis de nitrogênio, quando a concentração de 2-OG é baixa. Além de BCCP, algumas proteínas encontradas nos ensaios de interação têm alta probabilidade de serem alvos de PII. Dentre elas, outras proteínas do metabolismo de ácidos graxos, e proteínas envolvidas com vias metabólicas diversas, como NAD+ sintetase, proteínas do sistema PTS, Glutamato sintase, RelA e RNAses. Os resultados obtidos indicam que em A. brasilense as proteínas PII podem estar atuando na regulação de processo metabólicos diversos. Abstract: PII proteins are signal transducer proteins, ubiquitous in bacteria. They are involved in nitrogen metabolism regulation and act mostly by direct protein-protein interaction in response to effector binding of ATP, ADP and/or 2-oxoglutarate (2-OG). Effectors binding by PII cause conformational changes, which reflect directly on PII interaction with target proteins. In Azospirillum brasilense there are two PII proteins named GlnB and GlnZ, involved with transcriptional activation of nitrogen metabolism genes and nitrogenase post-translational regulation in response to variation of ammonium and 2-OG cellular levels. Since PII proteins are able of sensing 2-OG, which is directly involved with carbon and nitrogen cellular levels signaling, a role in carbon metabolism by PII proteins have been addressed. As PII act by protein-protein interaction, in this study protein interaction assays were performed using a Histagged GlnZ fusion immobilized on a Ni2+-bound resin and a crude extract of A. brasilense strain 2812 (glnB-/glnZ-), using different levels of the effectors ADP, ATP and 2-OG. Protein that were retained by this affinity chromatography were identified by mass spectrometry and classified into functional groups. One of the identified proteins was BCCP protein (component of acetyl-CoA carboxylase or ACC) which interaction with PII has been described earlier in Arabidopsis thaliana. The accB gene (coding for BCCP) was cloned from A. brasilense FP2 genome allowing in vitro assays to be performed in order to characterize PII-BCCP interaction. Enzymatic assays with Escherichia coli ACC and PII proteins from E. coli, A. brasilense and Synechococcus elongatus were carried out to determine the effect of PII on ACC activity. Our data suggested a conserved role of GlnB regulating fatty acids biosynthesis by inhibiting ACC, since GlnB protein from E. coli, A. brasilense, S. elongatus and A. thaliana produced an inhibitory effect on the acetyl-CoA carboxylase activity. 2-OG levels and the uridylylated state of PII affected the inhibitory effect of EcGlnB and AbGlnB on EcACC. These results and assays using GlnB variants suggest involvement of GlnB T loop in the GlnB-ACC interaction. The proposed model for the inhibition of ACC by GlnB suggests that it occurs in low carbon and high nitrogen levels, when the concentration of 2-OG is low. Besides BCCP, some proteins found in interaction assays have a high probability of being the targets of PII. Among these, other proteins from fatty acids metabolism, and proteins involved in various metabolic pathways, like NAD+ synthetase, PTS system proteins, glutamate synthase, RelA and RNAses. The results indicate that in A. brasilense PII proteins can act in the regulation of many metabolic processes.

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Made available in DSpace on 2014-11-10T11:09:55Z (GMT). No. of bitstreams: 0 Previous issue date: 2014-05-23Bitstream added on 2014-11-10T11:57:42Z : No. of bitstreams: 1 000790896.pdf: 1624782 bytes, checksum: 86f691c9d97bad42fa2588df159f183a (MD5) O Vírus da Febre amarela (YFV) causa doença com considerável morbidade e mortalidade nas regiões tropicais. Diversos vírus possuem estratégias para a alteração dos processos celulares. Mecanismos de splicing celulares são essenciais para diversificar a expressão dos genes e podem aumentar seu potencial de gerar proteínas. A replicação de YFV e as interações entre proteínas virais e celulares não são totalmente conhecidas. A proteína celular hSlu7 possui sinal de localização nuclear e tem um papel importante nas reações catalíticas do segundo passo do splicing. Estudos demonstram que sob infecção de YFV hSlu7 transloca para o citoplasma. A translocação de proteínas entre o citoplasma e o núcleo pode representar um mecanismo viral da regulação da expressão gênica. Este estudo teve como objetivo a caracterização da interação entre a proteína hSlu7 e NS5 viral, bem como estudar os efeitos de interações sobre os mecanismos de splicing alternativo após a infecção de YFV. Para identificar interação de NS5 de YFV com hSlu7 foi realizado ensaio de co-imunoprecipitação. Para verificar alteração de splicing celular foram utilizados replicons pEGFP-ADAR, pI12-IL7R, pEFGP-FGFR2, bem como a alteração de isoformas de XBP-1 endógenos. Os resultados indicam que NS5 de YFV interage com proteína hSlu7 e que sua interação pode influenciar no metabolismo RNA celular. YFV demonstrou exercer modulação no splicing celular, a avaliação de replicons sugerem que em splicing dependente de hSlu7, bem como a independente ocorre uma regulação viral atuando sobre sítios de splicing fraco e que a interação hSlu7-NS5 pode alterar direta e indiretamente a regulação trans-acting Yellow fever virus (YFV) causes disease with significant morbidity and mortality in tropical regions. Several viral strategies are avail for recruitment and alteration of the biochemical cellular processes. Cellular splicing mechanisms are essential to diversify the gene expression and increase it’s proteomic potential. Replication of YFV and the interactions between viral and cellular proteins are unknown. The cellular protein hSlu7 has an nuclear localization and an important role in the second catalytic reaction step of the alternative splicing. In our study group demonstrated that under YFV infection hSlu7 translocates to the cytoplasm. The translocation of proteins between nucleus and cytoplasm may represent a viral mechanism of cellular gene expression regulation, interference in the protein availability of the alternative splicing and viral replication control. This study aimed to characterize the interaction between the viral protein hSlu7 and NS5, as well as studying the effects of interactions on the mechanisms of alternative splicing after YFV infection. To identify interaction with YFV NS5 hSlu7 was conducted co-immunoprecipitation assay. To verify changes in cellular splicing replicons were used pEGFP-ADAR, PI12-IL7R, pEFGP-FGFR2 as well as the change of isoforms of XBP-1 endogenous.The results indicated that YFV NS5 protein interacts with hSlu7 and that their interaction may influence cellular metabolism RNA. YFV perform modulation on cellular splicing, the evaluation of replicons suggest that in hSlu7 splicing dependent and independent regulation occurs viral acting on weak splice sites and that the interaction hSlu7-NS5 can change directly or indirectly to regulate trans- acting

Made available in DSpace on 2014-06-11T19:32:14Z (GMT). No. of bitstreams: 0 Previous issue date: 2013-02-21Bitstream added on 2014-06-13T21:03:46Z : No. of bitstreams: 1 000741895.pdf: 15459081 bytes, checksum: d63bdd273032427c5d062ded87237abe (MD5) Atualmente os sistemas biológicos vem sendo abordados por diversas áreas de pesquisas, dentre elas a biologia de sistemas. Essa área tem centrado esforços para descrever e compreender as relações entre os componentes bióticos e abióticos desses sistemas, utilizando para isso a teoria de grafos. Uma forma de estudar esses sistemas, é avaliar as interações entre proteínas, que são as interações biomoleculares mais abundantes nas células. Nesse contexto, a presente tese focou no desenvolvimento de um algoritmo computacional capaz de predizer interações entre proteínas de qualquer espécie ou conjunto protéico. Para isso, foram utilizadas técnicas de aprendizado de máquina (sub-área da inteligência artificial) para a construção e aplicação desse preditor, o qual mostrou-se eficaz em predizer interações entre proteínas de mais de 80 espécies diferentes, incluindo interações entre proteínas de parasita e hospedeiro. Esse novo preditor foi aplicado no proteoma de zebrafish (Danio rerio) e humanos (Homo sapiens), gerando assim redes de interações proteicas para ambas as espécies. As interações obtidas foram avaliadas em um contexto geral e o foco das análises foi direcionado para a sub-rede relacionada com as vias de determinação e diferenciação sexual em vertebrados. Os resultados demonstraram uma relativa baixa conservação desses grafos ao longo da evolução dos vertebrados, tanto do ponto de vista global quanto da sub-rede relacionada com a determinação e diferenciação sexual em vertebrados. Além disso, foi possível observar ao menos um hub conservado entre as duas sub-redes, o qual representa um novo alvo a ser avaliado por pesquisas experimentais. Contudo, os dados demonstram que o preditor gerado possui um grande potencial para diversas áreas de estudos e é bastante útil para predição de interações em larga-escala. Além disso, os aspectos evolutivos aqui... Nowadays the biological systems have been analyzed under several research foci, including the system biology. This area focus to describe and understand the relationship between biotic and abiotic factors using the graph theory. The protein interactions are target interactions to the system biology because they are the most abundant biomolecular interactions within a cell. Thus, this thesis reported the development of a computational algorithm to predict proteinprotein interactions for all species or protein sets. The machine learning technique (sub-area of artificial intelligence) were used to develop and apply this method, giving effective results to predict protein-protein interaction for more than 80 different species, including parasitehost associations. This new predictor was applied to the proteome set of zebrafish (Danio rerio) and humans (Homo sapiens), generating the protein-protein interactions for both species. Evolutionary aspects of the protein interactions were studied in a broad context and the focus was directed to the sub-network involved in the vertebrate sex determination and differentiation. The results reported a low conservation of those graphs across the evolution in a general view or for the sub-network related to the vertebrate sex determination and differentiation. Moreover, it was reported at least one conserved hub between both subnetworks, to be further evaluated by experimental procedures. Anyway, the data showed that the predictor here reported may be very useful for several research areas and it is desirable for large-scale prediction procedures. Furthermore, the evolutionary aspects discussed in this thesis open new perspectives concerning system biology and evolutionary pathways of vertebrate sex determination and differentiation

Orientadores: Everson Alves Miranda, Pedro de Alcântara Pessôa Filho Tese (doutorado) - Universidade Estadual de Campinas, Faculdade de Engenharia Química Resumo: O segundo coeficiente virial osmótico, B22, tem sido considerado um preditor para o processo de cristalização. Uma faixa relativamente estreita de valores negativos de B22, -1x10-4 a -8x10-4 mL.mol/g2, é ideal à formação de cristais de acordo com George e Wilson (1994). Essa faixa de valores de B22 é denominada de "janela de cristalização", sendo utilizada para classificar condições adequadas de solvente à formação de cristais. Para valores maiores que -1x10-4 mL.mol/g2, a interação proteína-proteína não é suficientemente forte para a cristalização e nenhuma fase sólida é formada, enquanto para valores menores que -8x10-4 mL.mol/g2, as interações proteína-proteína são muito intensas e precipitados amorfos são formados. Dessa forma, os valores de B22 se tornaram um critério de seleção para a cristalização de proteínas, uma vez que esse coeficiente pode ser determinado por diversos métodos. Este trabalho teve como objetivo determinar experimentalmente diagramas de fases de proteínas (lisozima, insulina suína e bovina) e identificar nesses diagramas, através de análise dos valores do B22, as condições nas quais ocorre a formação de precipitado amorfo, cristalino ou outras fases (por exemplo, fase líquida). O "salting-out" foi o método escolhido para precipitar as proteínas, pois é considerado um dos mais simples e importantes métodos para induzir a cristalização. O sal volátil carbamato de amônio foi o agente de "salting-out" escolhido. As técnicas de espalhamento de luz estático (SLS) e cromatografia de auto-interação (SIC) foram usadas para determinar os valores de B22 para as proteínas em diferentes soluções aquosas de sal a 15 e 25 °C. O fenômeno de "salting-out" foi observado nos diagramas para as três proteínas estudadas. Valores negativos de B22 e altos valores da constante de "salting-out" - entre 1,07 a 3,77 kg/mol - confirmaram que o sal volátil carbamato de amônio empregado neste estudo é um bom agente precipitante. Os valores do B22 para a insulina suína (-250x10-4 a -18x10-4 mol.ml/g2 a 25 °C e -187x10-4 a -45,2x10-4 mol.ml/g2 a 15 °C) e insulina bovina (-999x10-4 a 6,7x10-4 mol.ml/g2 a 25 °C e -533x10-4 a -16,7x10-4 mol.ml/g2 a 15 °C) indicaram a precipitação, o que também foi confirmado pelos ensaios de cristalização. Já para a lisozima, obteve-se formação de cristais independente do valor de B22 encontrado (-20,4x10-4 a -3,6x10-4 mol.ml/g2 a 25 °C e -400x10-4 a -14,4x10-4 mol.ml/g2 a 15 °C). Além disso, os modelos teóricos disponíveis na literatura utilizados para a obtenção de uma estimativa do parâmetro B22 são adequados e válidos para as condições em que a medida experimental não é possível, podendo ser aplicados para o sistema proteína/sal volátil. Dessa forma, este trabalho mostrou que não existe uma "janela de cristalização universal" válida para todos os sistemas e o uso do sal volátil carbamato de amônio como agente de cristalização é uma alternativa ao uso de sais convencionais. Abstract: The osmotic second virial coefficient, B22, has been used as a predictor of crystallization. A relatively narrow range of negative B22 values, -1x10-4 to -8x10-4 mL.mol/g2, is the ideal range for crystal formation according to George and Wilson (1994). This range, referred to as the "crystallization slot", has been used to classify suitable conditions under which proteins will assemble into crystals. For B22 values greater than -1x10-4 mL.mol/g2, the protein-protein interaction is very weak and no solid phase is formed, while for values less than -8x10-4 mL.mol/g2, the protein-protein interactions are very intense and amorphous precipitates are formed. Thus, the B22 value has become a selection criterion for protein crystallization, since this coefficient can be determined by various methods. This study aimed to determine the experimental phase diagrams for proteins (lysozyme and bovine and porcine insulin) and to identify those diagram conditions under which amorphous precipitate, crystals or other phases (for example, liquid phase) are formed, based on the values of B22. The salting-out method to precipitate proteins was chosen because it is considered one of the simplest and most important methods to induce crystallization. The volatile salt ammonium carbamate was chosen as the salting-out agent. Traditional static light scattering (SLS) and the novel self-interaction chromatography (SIC) technique were used to determine B22 values for the proteins in different aqueous salt solutions at 15 and 25 °C. The salting-out phenomenon was observed in the phase diagrams for the three proteins studied. Negative B22 values and high values of the salting-out constant - between 1.07 to 3.77 kg/mole (Cohn, 1925) - confirmed that ammonium carbamate was a good precipitant agent. The B22 values for porcine (-250x10-4 to -18x10-4 mol.ml/g2 at 25 °C and -187x10-4 to -45.2 x10-4 mol.ml/g2 at 15 °C) and bovine (-999x10-4 to 6.7x10-4 mol.ml/g2 at 25 °C and -533x10-4 to -16.7x10-4 mol.ml/g2 at 15 °C) insulin indicated precipitation that was confirmed experimentally. However, lysozyme was obtained as crystals, regardless of the B22 values found (-20.4x10-4 to -3.6 x10-4 mol.ml/g2 at 25 °C and -14.4x10-4 to -400x10-4 mol.ml/g at 15 °C). In addition, thermodynamic models available in the literature and suitable for the conditions under which experimental measurements were done provided a good fit to the data. Thus, this work showed that there is no universal "crystallization slot" applicable to all systems and that for crystallization agent, volatile salt ammonium carbamate can serve as an alternative to conventional salts. Doutorado Desenvolvimento de Processos Biotecnológicos Doutora em Engenharia Química

Orientadores: Marcelo Menossi Teixeira, Ricardo Aparicio Tese (doutorado) - Universidade Estadual de Campinas, Instituto de Biologia Resumo: O agronegócio da cana de açúcar movimenta cerca de R$ 40 bilhões por ano no Brasil. A cadeia produtiva da cana de açúcar como atividade na economia é responsável por 1,5% do produto interno bruto (PIB) nacional e um dos principais componentes econômicos é a quantidade de sacarose acumulada nos colmos. No entanto, a síntese de sacarose e sua acumulação em plantas superiores é o resultado do produto de uma extensa rede de interações. Quando descarregada nas células do parênquima de armazenamento, a sacarose é metabolizada por diferentes enzimas, sendo a UDP-glucose pirofosforilase (UGPase) uma das enzimas responsáveis pela síntese de sacarose em cana de açúcar. O objetivo deste trabalho foi avaliar o padrão de expressão do gene ScUGPase-1 e os mecanismos regulatórios que controlam a atividade da proteína UGPase de cana de açúcar. Análises por RT-qPCR revelaram que a expressão do gene ScUGPase-1 diminui ao longo da maturação dos colmos e o gene é mais expresso nos entrenós em comparação com o tecido de folha. Porém, nenhuma diferença de expressão significativa foi observada entre dois cultivares contrastantes em teor de sacarose. In vivo, a localização subcelular da proteína ScUGPase-1 indicou uma associação à membrana nos tecidos de folha e colmo. Utilizando anticorpo primário fosfo-específico, observamos a fosforilação da proteína ScUGPase-1 apenas na fração solúvel e microssomal do tecido de folha. In vitro, a proteína ScUGPase-1 formou um complexo com a proteína recombinante caseína quinase 1 (CK1) e sua atividade foi afetada por agentes óxido-redutores. Para complementar os dados de óxido-redução, análises de espalhamento de luz a baixo ângulo (SAXS) forneceram o primeiro modelo estrutural do dímero da proteína ScUGPase-1 em solução, destacando que a interface de dimerização está localizada na região C-terminal. Os dados indicam que a fosforilação, interação protéica e oligomerização podem exercem um papel importante na regulação da proteína ScUGPase-1 durante a síntese de sacarose em cana de açúcar. Abstract:The sugarcane agribusiness generates around R$ 40 billion per year in Brazil, while the entire supply chain of sugarcane is responsible for 1.5% of the gross domestic product (GDP). Sugarcane productivity is mainly determined by the accumulation of sucrose in the culms. However, the synthesis and accumulation of sucrose in plants is the result of an extensive network. When sucrose is unloaded in the storage parenchyma cells, it is metabolized by different enzymes, and UDP-glucose pyrophosphorylase (UGPase) is one of the enzymes responsible for the synthesis of sucrose in sugarcane. The objective of this work was to gain insights on the ScUGPase-1 expression pattern and the regulatory mechanisms that control protein activity. ScUGPase-1 transcript levels were negatively correlated with sucrose content in the internodes and only a slight difference in the expression pattern was observed between two cultivars that differ in their sucrose content. The intracellular localization of ScUGPase-1 indicated association with membranes in both leaves and internodes. Using a phospho-specific antibody, we observed that ScUGPase-1 was phosphorylated in vivo in the soluble and membrane fractions from leaves, but not from internodes. In vitro, the purified recombinant enzyme interacted with recombinant protein casein kinase 1 and its activity was affected by redox modification. To complement the redox data, Small-Angle X-ray Scattering provided the first structural model of the dimer of sugarcane UGPase in solution, highlighting that the dimer interface is located at the C-terminal. The data indicated that phosphorylation, protein interaction and oligomerization may play an important role in the regulation of ScUGPase-1 activity Doutorado Genética de Microorganismos Mestre em Genética e Biologia Molecular

Orientador: Kleber Gomes Franchini Tese (doutorado) - Universidade Estadual de Campinas, Faculdade de Ciências Médicas Resumo: Diversos tipos celulares respondem ao estresse mecânico ativando sinais que culminam com remodelamento e sobrevivência. O estresse mecânico pode atuar como agente modulador da homeostase celular e de numerosos processos patológicos. Evidências sugerem que a Quinase de Adesão Focal (FAK) medeia a resposta de miócitos cardíacos ao estresse mecânico. Contudo, os mecanismos moleculares que regulam a função da FAK ainda não são totalmente conhecidos. No presente trabalho foi demonstrado que a small heat shock protein ?B-Cristalina interage de forma direta e protege a FAK da degradação pela calpaína 2. Ensaios de pull down, cross-linking acoplado a espectrometria de massas, mutagênese sítio dirigida, docking e modelagem molecular demonstraram que as ?-hélices 1 e 4 do domínio FAT da FAK interage no sítio de ligação constituído pelas folhas ?4 e ?8 da ?B-Cristalina. Os dados funcionais e estruturais obtidos indicaram que ocorre um aumento da associação da ?B-Cristalina e o domínio FAT da FAK após mudanças conformacionais associadas com a fosforilação dependente de Src da tirosina 925. Experimentos de pull down demonstraram que a associação com a ?B-Cristalina protege a FAK da proteólise mediada pela calpaína 2. Miócitos cardíacos submetidos ao silenciamento gênico da ?B-Cristalina apresentaram uma menor quantidade de FAK detectada em 125 KDa, indicando que esta interação protege FAK da proteólise. A submissão dessas células ao estiramento cíclico revelou uma maior taxa de morte celular por apoptose, sendo que a superexpressão da FAK restaurou a viabilidade celular. Os achados deste trabalho indicam que o complexo formado entre FAK e ?B-Cristalina apresenta papel fundamental na proteção da FAK da proteólise durante o estresse mecânico, sendo importante na manutenção da sobrevivência celular Abstract: Cell types of diverse function respond to mechanical stress by triggering downstream signals for remodelling and survival. As such, mechanical stress impacts organismal homeostasis and numerous pathologic processes. Evidence suggests that focal adhesion kinase (FAK) mediates the responses of myocytes to mechanical stress, yet the molecular mechanisms to regulate FAK function are unclear. We find that FAK is recognized and protected from calpain-induced degradation by the small heat shock protein alpha-B crystalline (CryAB). A model based in the pull down, crosslinking technology coupled with mass spectrometry, site-directed mutagenesis, molecular docking and molecular modeling indicated that a cleft formed by ?4 and ?8 sheets of ?B-Crystalline is critical to the interaction with ?-helix 1 and ?-helix 4 of FAK. Functional and structural data indicated that CryAB binds directly the FAT domain of FAK upon changes in conformation associated with Src-dependent phosphorylation of tyrosine 925 induced by cell stretch. Pulldown assay indicated that ?B-Crystalline interacts and protects from calpain-induced degradation FAK. Cardiomyocytes depleted of CryAB show reduced FAK quantity detected in 125KDa, indicating that this interaction protects degradation of FAK. The submission of such cells to stretch cyclic revealed a higher rate of cell death via apoptosis, whereas restoration of FAK expression restored cell viability. Our findings highlight a new role for CryAB in forming a complex with FAK that is essential for regulating cardiomyocyte survival in response to mechanical stress Doutorado Biologia Estrutural, Celular, Molecular e do Desenvolvimento Doutor em Ciências

Orientador: Goran Neshich Tese (doutorado) - Universidade Estadual de Campinas, Instituto de Biologia Resumo: Dentro do ambiente celular, há uma variedade de moléculas e a interação entre si regulam praticamente todos os processos necessários e essenciais para a manutenção da vida. Interações entre proteínas estão envolvidas no controle de vários processos intra e intercelulares, como regulação metabólica e da expressão gênica, reconhecimento antígeno-anticorpo etc. que definem as características biológicas do funcionamento da vida entre os diversos organismos. Ao conhecer a interface de interação de uma proteína chave para desenvolvimento de casos patológicos, é possível desenhar drogas com alta especificidade com o sítio de ligação. Para avançar nessa frente, o conhecimento da estrutura proteica é fundamental, porém não suficiente. É necessário conhecermos o sítio de ligação alvo para cada parceiro de interação. Este estudo visa entender as características do nano-ambiente das interfaces proteicas - área através da qual as macromoléculas se comunicam e exercem sua funcionalidade. Propomos utilizar uma abordagem de estudo das características físico-químicas e estruturais dos resíduos formadores de interfaces de complexos conhecidos e com estrutura quaternária resolvida experimentalmente, utilizando um conjunto de dados sem redundância sequencial, extraindo os parâmetros/descritores que descrevem de forma objetiva as diferentes classes de complexos, revelando as características principais sobre interações proteína-proteína. A finalidade deste trabalho é de conhecer os detalhes que definem uma área como interface e aplicá-lo em uma ferramenta preditiva para todas as proteínas com arranjo estrutural conhecido e/ou modelado. Propomos de forma pioneira, o uso de classificadores específicos para cada tipo de aminoácido e independente do uso de descritores sobre conservação de aminoácidos. Resultados obtidos com classificador linear e por ensemble de redes neurais destacam a nossa abordagem, desenhada e aplicada nesta tese, como uma com os melhores indicadores de desempenho na predição precisa dos resíduos de aminoácido na interface entre as abordagens descritas recentemente na literatura. Ainda, enquanto os outros métodos dependem de descritores sobre conservação de aminoácidos, é mostrado aqui que nenhum ganho de desempenho é obtido com a incorporação de tais descritores em nosso modelo classificador. Esse resultado indica que o uso de descritores puramente físico-químicos e estruturais é suficiente para explicar o grau de conservação dos aminoácidos Abstract: Inside cells, there is a variety of molecules and their interactions regulate virtually all necessary and essential processes to the maintenance of life. Interactions among proteins are involved in the control of several processes within and out of the cell, such as, metabolic and gene expression regulation, anti-body and antigen recognition, etc. that defines biological characteristics of life among many organisms. If the protein interface amino acids of a key protein related to a given pathologic phenomenon are known, it is possible to rationally design drugs with high specificity for a specific binding site. To gain insight in this field, the knowledge of the protein three-dimensional structure is mandatory, but not sufficient. It is also necessary to know the interface between the target protein and its partners. This study focuses in understanding the characteristics of the area through which the macromolecules communicate to each other and exercise their function. Here, it is proposed an approach to study the physicochemical and structural characteristics of the interface forming residues with known quaternary structure (experimentally solved). It was selected a sequence non-redundant dataset and by extracting parameters/descriptors, that objectively describe different complex classes, it was possible to unravel the basic characteristics of protein-protein binding. The goal of this study is to unravel the details that outline a specific area as interface and apply it in a form of a predictive tool for all proteins with known atomic structure. It is proposed by the first time, the use of amino acid specific classifiers regarding amino acid type and free of amino acid conservation attributes. The results obtained here by employing linear and ensemble of neural network classifiers show that, based on purely physicochemical and structural descriptors, it is possible to get precise predictions about interface forming residues in protein-protein assemblies. Comparatively, the method described here retains better performance indicators than the ones recently described in the literature. In addition, we showed that, for our method, adding "conservation" attributes does not induce any performance gain, which is a major difference if compared to other described methods. This result indicates the purely physicochemical and structural descriptors are sufficient to explain how conserved amino acids are Doutorado Bioinformática Doutor em Genética e Biologia Molecular

Paracoccidioides brasiliensis é um fungo termodimórfico, causador da paracoccidioidomicose, uma micose sistêmica prevalente na América do Sul. A infecção em humanos inicia-se com a inalação de propágulos fúngicos que atingem o epitélio pulmonar. A parede celular desempenha um papel importante na patobiologia do P. brasiliensis, pois está envolvida nas mudanças morfogenéticas associadas com o ciclo de vida deste patógeno. A biossíntese e o remodelamento dos polissacarídeos da parede celular são essenciais para o crescimento do fungo e proteínas glicosilfosfatidilinositol (GPI)-ancoradas estão envolvidas nesses processos. As enzimas da família glicanosiltransferase alongando glicana (GEL) são proteínas GPI-ancoradas que possuem atividade de beta-1,3-glicanosiltransferase e desempenham um importante papel nas ligações cruzadas dos componentes da parede celular em fungos. O genoma de P. brasiliensis possui 3 genes codificantes para beta-1,3-glicanosiltransferases (Gel1p, Gel2p e Gel3p). Com o objetivo de se buscar outras possíveis funções da beta- 1,3-glicanosiltransferase 3 (PbGel3p) em P. brasiliensis, as interações entre essa proteína e outras proteínas do fungo foram investigadas através do sistema de duplohíbrido em Saccharomyces cerevisiae e do ensaio de pull-down. O sistema duplohíbrido permite o estudo das interações in vivo e, através dele, foram identificadas 8 proteínas que interagem com PbGel3p. A interação com a fosfatidilinositol-4-fosfato 5- quinase its3 e com a Dsk1 proteína quinase sugere a participação de PbGel3p no ciclo de divisão celular. A RNA helicase Dbp5p, cuja interação com PbGel3p foi confirmada in vitro através do ensaio de coimunoprecipitação, e a 5'-3' exoribonuclease estão envolvidas no metabolismo de RNAm, sugerindo uma função para PbGel3p nesse processo. A interação entre PbGel3p e a enzima serina esterase/lipase, que participa da via de biossíntese da âncora GPI, também foi confirmada por coimunoprecipitação. PbGel3p interage com o fator de transcrição Ctf1Bp e enzima 3-oxoacil redutase, fato que sugere seu envolvimento no metabolismo de lipídeos de P. brasiliensis. A interação com a proteína de resistência à leptomicina B Pmd1p sugere um papel para PbGel3p na resposta à agentes antifúngicos. O ensaio de pull-down in vitro resultou na identificação da proteína de choque térmico de 70 kDa de P. brasiliensis. A interação com essa proteína sugere que PbGel3p pode atuar na resposta à condições de estresse, como o aumento de temperatura. Com base nesses dados, estudos funcionais devem ser realizados para confirmar a multifuncionalidade de Gel3p em P. brasiliensis. Paracoccidioides brasiliensis is a thermodimorphic fungus that causes paracoccidioidomycosis (PCM), a systemic mycosis prevalent in South America. In humans, infection starts by inhalation of fungal propagules that reach the pulmonary epithelium. The cell wall presents an essential role in the pathobiology of P. brasiliensis, since it is involved in the morphogenetic changes associated with the life cycle of this pathogen. The biosynthesis and remodeling of the cell wall polysaccharide network is required for fungal growth and glycosylphosphatidylinositol (GPI)-anchored proteins are involved in these processes. The enzymes of the glucan-elongating (GEL) family are GPI-anchored proteins which have beta-1,3-glucanosyltransferase activity and play important role in the cross-linking of cell wall components in fungi. The P. brasiliensis genome possess 3 genes that encode for beta-1,3-glucanosyltransferases (Gel1p, Gel2p e Gel3p). With the aim of searching for other possible functions for beta-1,3-glucanosyltransferase 3 (PbGel3p) in P. brasiliensis, the interactions between this protein and others proteins of the fungus were investigated through the Saccharomyces cerevisiae two-hybrid system and pull-down assay. The two-hybrid system enables the study of interactions in vivo and, through this approach, 8 proteins which interact with PbGel3p were identified. The interaction with phosphatidylinositol- 4-phosphate 5-kinase its3 and protein kinase Dsk1p suggest the participation of PbGel3p in the cell division cycle. The RNA helicase Dbp5p, whose interaction with PbGel3p was in vitro confirmed by coimunoprecipitation, and the 5'-3' exoribonuclease are involved in the mRNA metabolism suggesting a function for PbGel3p in this process. The interaction between PbGel3p and the lipase/serine esterase, which participates on the biosynthesis of the GPI-anchor, was also confirmed by coimunoprecipitation. PbGel3p also interacts with the transcription factor Ctf1Bp and the 3-oxoacyl reductase enzyme, which suggests its involvement in the lipid metabolism. The interaction with the leptomycin B resistance protein Pmd1p suggests a role for PbGel3p in the response to antifungal drugs. The in vitro pull-down assay resulted in the identification of P. brasiliensis 70 kDa heat shock protein. The interaction with this protein suggests that PbGel3p may act in the response to stress conditions, as in the temperature increase. On basis of these data, functional studies may be carried out in order to confirm the Gel3p multifunctionality in P. brasiliensis.

Informações de interações de proteínas são fundamentais para a compreensão dos processos celulares. Por esta razão, várias abordagens têm sido propostas para inferir sobre pares de proteínas de redes de todos os tipos de dados biológicos. Nesta tese é proposto um método de bi-clustering, Lbic, baseado num modelo de classificação logística, para analisar dados biológicos binários. O Lbic é comparado com outros dois métodos de bi-clustering apresentados na literatura, mostrando melhores resultados. Seu desempenho também é comparado àqueles de um método supervisionado, análise de correlação canônica com Kernel, aplicado aos mesmos conjuntos de dados. Os resultados mostram que o Lbic alcança desempenho superior aos da aborgadem supervisionada treinada com até 25% do conhecimento da rede alvo

Orientador: Fabio Cesar Gozzo Tese (doutorado) - Universidade Estadual de Campinas, Instituto de Quimica Resumo: A Espectrometria de Massas (MS) é hoje a principal técnica de caracterização de estrutura primária de proteínas devido às vantagens intrínsecas da técnica. As técnicas de cross-linking e footprinting visam desfrutar de tais vantagens para obtenção de informações estruturais de complexos protéicos. Nesse projeto foram realizados estudos de fragmentação de peptídeos contendo como cross-linker o DSS, reagente mais utilizado para esse propósito. Os mecanismos de fragmentação foram propostos baseados na dissociação de peptídeos modelos sintetizados para gerar espécies que mimetizassem experimentos com proteínas. Esses estudos permitiram a identificação de íons marcadores, que foram posteriormente utilizados em experimentos de Varredura de Íons Precursores para auxiliar na detecção de peptídeos modificados. Para realização dos experimentos de footprinting, foi desenvolvida uma linha de luz no LNLS. Posteriormente, foi proposto um novo método de quantificação de cinética de oxidação baseado nos dados de LC-MS, levando em consideração todos os produtos de oxidação formados. Esses métodos foram utilizados no estudo de interação das proteínas Tif34 e Tif35 do fator de iniciação de tradução de Saccharomyces cerevisiae. Os resultados obtidos indicam que Tif34 apresenta dois possíveis sítios de interação para a proteína Tif35 Abstract: Mass Spectrometry (MS) is the most important tool for analyses related to protein primary structure. Cross-Linking and footprinting aim to bring those advantages to gain insights in the spatial structure of protein complexes. In this work the fragmentation of peptides containing DSS, the most used cross-linker, was studied. Fragmentation mechanisms were proposed based on the dissociation of model peptides which were synthesized in order to generate species that would resemble species found in experiments with proteins. Diagnostic ions were identified which allowed the use of Precursor Ion Scan to detect those species. In order to perform footprinting experiments, a new beamline was developed at the LNLS. A new method for quantitation of oxidation kinetics was developed based on LC-MS analysis, which considers every single oxidation product that can be generated. Those methods were thereafter used in the study of the interaction between Tif34 and Tif35, proteins which compose a translation initiation factor of Saccharomyces cerevisiae. The results indicate that Tif34 presents two different sites for the interaction with Tif35 Doutorado Química Orgânica Doutor em Ciências

We propose a novel method for defining patterns of contacts present in protein-protein complexes. A new use of the traditional contact maps (more frequently used for representation of the intra-chain contacts) is presented for analysis of inter-chain contacts. Using an algorithm based on image processing techniques, we can compare protein-protein interaction maps and also obtain a dissimilarity score between them. The same algorithm used to compare the maps can align the contacts of all the complexes and be helpful in the determination of a pattern of conserved interactions at the interfaces. We present an example for the application of this method by analyzing the pattern of interaction of bovine pancreatic trypsin inhibitors and trypsins, chymotrypsins, a thrombin, a matriptase, and a kallikrein - all classified as serine proteases. We found 20 contacts conserved in trypsins and chymotrypsins and 3 specific ones are present in all the serine protease complexes studied. The method was able to identify important contacts for the protein family studied and the results are in agreement with the literature.

Orientador: Jorg Kobarg Tese (doutorado) - Universidade Estadual de Campinas, Instituto de Biologia Resumo: A proteína Ki-1/57 que é encontrada tanto no núcleo quanto no citoplasma está associada com atividade de proteína quinase serina/treonina e é fosforilada nestes resíduos após ativação celular. Neste trabalho verificamos que Ki-1/57 interage com a proteína Chromatin-Helicase-DNA-binding domain 3 (CHD3) e com a proteína adaptadora/sinalizadora RACK1 no núcleo. Pelo sistema do duplo híbrido de levedura (SDHL) a proteína arginina metiltransferase 1 (PRMT1) foi selecionada como outra proteína de interação. A PRMT1 integra uma família representada por nove enzimas humanas que catalisam reações de metilação em resíduos de arginina. Em seguida, usando agora a PRMT1 como isca - no SDHL - identificamos as proteínas Ki-1/57 e hnRNPQ, juntamente com outras 13. A maioria delas contêm motivos ¿RGG-box¿ em suas seqüências de aminoácidos, que são conhecidos alvos para metilação. Posteriormente verificamos que Ki-1/57 e seu provável parálogo CGI-55 conservam dois motivos ¿RGG/RXR-box¿ e que são substratos in vitro para a metilação de argininas pela PRMT1. Estudos de mapeamento mostraram que todos os fragmentos contendo o motivo ¿RGG/RXR-box¿ interagem com a PRMT1 e são alvos à metilação in vitro. Ki-1/57 endógena, imunoprecipitada de células L540, mostrou ser metilada in vivo, além de ser um alvo a metilação pela PRMT1 in vitro, somente quando as células são previamente tratadas com o inibidor da metilação Adox. Tratamento das células Hela com o inibidor da metilação (Adox) causa desaparecimento da imuno-marcação citoplasmática de Ki-1/57 e relativa redistribuição do parálogo CGI-55 para o citosol. Assim, pode ser especulado que a metilação destas proteínas deve ser um evento importante para suas localizações subcelulares e conseqüentemente para suas funções. Em resumo, nossos dados sugerem que o SDHL é um método efetivo na identificação de novos substratos celulares para a PRMT1 e poderia ser estendido para a identificação e caracterização de novos substratos para os outros integrantes da família das PRMTs humanas Abstract: The protein Ki-1/57 that is found both in the cytoplasm and nucleus is associated with serine/threonine protein kinase activity and gets phosphorylated on serine and threonine residues upon cellular activation. We demonstrated that Ki-1/57 interacts with the Chromatin-Helicase-DNA-binding domain protein 3 (CHD3) and with the adaptor/signaling protein RACK1 in the nucleus. By utilizing the yeast two-hybrid system (YTHS), we were further able to find the protein arginine-methylatranseferase-1 (PRMT1) as another interacting protein. PRMT1 is a member of the family constituted by 9 human enzymes that catalyze methylation reactions on arginine residues. Afterwards, by using PRMT1 as bait in the YTHS we identified both Ki-1/57 and NSAP1 as interacting proteins, along with 13 other proteins. The majority of them present RGG-box clusters in their amino acid sequences, which are known to be targets for arginine methylation. We further found that Ki-1/57 and its putative paralogue CGI-55 have two RGG/RXR-box clusters conserved between them and that they are substrates for arginine-methylation by PRMT1 in vitro. In mapping studies, we observed that all Ki-1/57 protein fragments containing the RGG/RXRbox clusters interact with PRMT1 and are targets for methylation in vitro. Endogenous cellular Ki-1/57 seems to be methylated in vivo and is a target for methylation by PRMT1 in vitro, only when cells have been previously treated with the methylation inhibitor Adox. Treatment of Hela cells with the inhibitor of methylation (Adox) causes the disappearance of the immuno-staining of Ki-1/57 in the cytoplasm and a relative redistribution of the paralogue CGI-55 to the cytosol. It can therefore be speculated that the methylation of these proteins is important for their sub-cellular localization and in consequence for their function. In summary our data suggest that the YTHS is an effective method for the identification of novel cellular PRMT substrates and could be extended for the identification and characterization of novel substrates to the other components of the human PRMT1 family Doutorado Bioquímica Doutor em Biologia Funcional e Molecular