Search

CAPES - Coordenação de Aperfeiçoamento de Pessoal de Nível Superior CNPq - Conselho Nacional de Desenvolvimento Científico e Tecnológico FAPEMIG - Fundação de Amparo à Pesquisa do Estado de Minas Gerais O gênero Lippia pertence à família Verbenaceae, inclusa no clado Asteridaee, ordem Lamiales, compreendendo aproximadamente 175 gêneros e 2800 espécies, onde muitos gêneros apresentam plantas com propriedades medicinais e ornamentais. A espécie Lippia alba, originária da América do Sul, também ocorre no Brasil e é uma das mais estudadas do gênero Lippia. Ela floresce durante o ano todo e recebe grande destaque no gênero, devido às suas inúmeras propriedades medicinais. O óleo essencial de Lippia alba é composto basicamente por sesqui e monoterpenos, que são as substâncias responsáveis por suas propriedades medicinais. O objetivo central do presente trabalho foi clonar e analisar a expressão de dois potenciais genes codificadores de terpeno sintases em Lippia alba. Através do alinhamento de genes codificadores de monoterpeno sintases caracterizadas, primers degenerados foram desenhados dentro de regiões conservadas e utilizados para se obter a clonagem de genes codificadores de terpeno sintases em Lippia alba. Dois potenciais genes codificadores de terpeno sintases foram clonados, LaTPS12 e LaTPS23. Após a clonagem, técnicas de RT-PCR semiquantitativo foram empregadas para análises de expressão desses dois genes em diferentes estágios foliares e em três diferentes quimiotipos de Lippia alba. Os resultados mostraram que em folhas situadas no quarto segmento nodal o gene LaTPS12 apresenta maior nível de expressão. A diferença na expressão do gene LaTPS23 foi menos acentuada nos três quimiotipos analisados em relação ao gene LaTPS12, que apresentou uma expressão diferencial. Análises filogenéticas foram realizadas comparando-se as seqüências desses dois genes com outros genes codificadores de terpeno sintases já caracterizadas de diferentes espécies de plantas. De acordo com essas análises, LaTPS12 e LaTPS23 pertencem à classe TPS-b, que é composta principalmente por monoterpeno sintases de angiospermas. The genus Lippia belongs to Verbenaceae family, Asteridaee, order Lamiales. This family comprises about 175 genus and 2800 species, and many of them have medicals and ornamentals proprierties. Lippia alba is native from South America, and is also found in Brazil and is the most studied species of the genus Lippia. This plant blooms throughout the year and has great importance due to its medicinal properties. The Lippia alba essential oils are composed by sesquiterpenes and monoterpenes conferring its medicinal properties. The aim of this work was to clone and to analize gene expression of putative terpene synthases genes (TPS) in Lippia alba. Alignment of TPS genes was used to design degenerate primers into conserved domains for cloning of these genes in Lippia alba. We have cloned two putative TPS genes, LaTPS12 and LaTPS23. After cloning, semiquantitative RT-PCR was employed to expression analysis of these two genes in different leaf stages and among three different chemotypes of Lippia alba. The result of expression level showed that LaTPS12 occurred at higher level in leaves located in fourth nodal segment and showed a marked differential expression among the chemotypes. The difference of expression of the LaTPS23 was less prominent comparing the three studied chemotypes. We performed a phylogenetic analysis in order to compare the LaTPS12 and LaTPS23 to others TPS genes in different plant species. The results showed that these LaTPS12 and LaTPS23 belong to the class TPS-b, which comprises mainly angiosperms monoterpene synthases genes.

CAPES - Coordenação de Aperfeiçoamento de Pessoal de Nível Superior O vírus Zika (ZIKV) pertence à família Flaviridae e ao gênero Flavivirus sendo, portanto, similar do ponto de vista evolutivo com outros arbovírus transmitidos por mosquitos. O ciclo natural de transmissão do ZIKV na África envolve majoritariamente vetores silvestres do gênero Aedes e macacos. No fim de 2013, uma epidemia fora da África foi reportada na Polinésia Francesa com mais de 35 mil casos, alertando autoridades de saúde para o potencial de espalhamento pandêmico desta virose que também foi identificada na Nova Caledônia, Ilhas Cook e Ilha de Páscoa. Em 2015 foi confirmada a circulação do vírus no Nordeste do Brasil, a partir de isolamento viral em casos suspeitos de dengue. Recentemente, o Ministério da Saúde do Brasil publicou uma nota afirmando que casos da doença já haviam sido confirmados em mais de oito estados do país, nas regiões Norte, Nordeste e Sudeste. Foi demonstrado a presença do vírus zika (ZIKV) no sangue, sémen, urina e saliva, sugerindo que a detecção poderia ocorrer por estes fluidos corporais. A saliva é um biofluido não-invasivo, indolor, com custo de coleta reduzido em relação ao sangue e pode apresentar alta acurácia utilizando plataformas analíticas adequadas para cada doença. No entanto, as evidências com a infecção de ZIKV nas glândulas salivares e seu potencial efeito no diagnóstico salivar ainda apresentam literatura incipiente. Diante deste contexto o objetivo da tese foi dividido em 3 capítulos: 1) apresentação de um mecanismo patofisiológico da entrada do ZIKV em células de glândulas salivares e seu potencial impacto no diagnóstico salivar; 2) avaliação da composição molecular de glândulas submandibulares em um modelo animal de ZIKV; e 3) avaliação da capacidade de discriminação do ZIKV diluído em diferentes concentrações de saliva utilizando uma plataforma biofotônica sustentável, livre de reagentes, rápida e não invasiva. No primeiro capítulo foi revisitada a expressão de mRNA e proteínas em glândulas salivares relacionadas ao mecanismo molecular da infecção pela entrada do ZIKV em glândulas salivares. Entre eles estão os receptores de lectina tipo C e receptores de fosfatidilserina (PS do tipo TIM1, TIM3, TIM4, TYRO3 e AXL). Em uma perspectiva fisiopatológica relacionada com o diagnóstico, as glândulas salivares podem permitir a entrada do ZIKV pelos transportadores supracitados, permitir a replicação do ZIKV e sua secreção para o lúmen acinar e ductal até atingir a cavidade oral com a saliva, o que é fundamental para desenvolver estratégias adequadas para realizar plataformas diagnósticas para detecção precoce do ZIKV na saliva. No segundo capítulo foi desenvolvido um modelo animal de infecção por ZIKV utilizando camundongos machos C57/BL6 knockout para o gene interferon-gama. A infecção por ZIKV foi realizada por administração intradérmica com ZIKV (50 µL, 1 x 105 PFU), e os camundongos controle receberam apenas veículo (50 µL). Para confirmar a infecção pelo ZIKV neste modelo animal, a replicação do RNA do ZIKV foi confirmada no baço de camundongos. Baseado em uma análise por ATR-FTIR, foi observado que a presença de colágeno reduziu (p < 0,05) e os ácidos nucleicos aumentaram (p < 0,05) nas glândulas submandibulares de camundongos infectados por ZIKV. No terceiro capítulo, identificamos que um algoritmo de aprendizado de máquinas baseado em LDA classificou com 80,5% de acurácia (sensibilidade: 77,7% e especificidade: 83,3%) amostras de saliva infectadas com 10⁴ PFU/mL, o que é similar à concentração encontrada clinicamente na infecção pelo ZIKV. Desta forma, os resultados demonstram uma aplicação potencial desta plataforma biofotônica sustentável sem o uso de reagentes, acoplada com algoritmos de aprendizado de máquina para detectar ZIKV na saliva. Em conjunto, a revisão sobre a expressão dos transportadores para a entrada do ZIKV nas células de glândulas salivares permitiu a compreensão da patofisiologia do ZIKV nas glândulas salivares maiores e menores, e seus efeitos na saúde oral. A detecção de alterações na expressão de colágeno e ácidos nucleicos em um modelo animal de ZIKV reforça a importância da compreensão da patofisiologia do ZIKV em tecidos da cavidade oral, e também que mais estudos devem ser direcionados aos efeitos do ZIKV em glândulas salivares. Além disso, demonstrou-se que uma plataforma biofotônica sustentável utilizando espectros infravermelho da saliva, acoplado com algoritmos de inteligência artificial, pode detectar o ZIKV em concentrações similares às encontradas clinicamente. The Zika virus (ZIKV) belongs to the Flaviviridae family, therefore, it is related from the evolutionary point of view to other arboviruses transmitted by mosquitoes. The natural cycle of ZIKV transmission in Africa mainly involves wild vectors of the genus Aedes and monkeys. In late 2013, an epidemic outside Africa was reported in French Polynesia with more than 35,000 cases. This event alerted health officials to the potential for a pandemic spread of this virus which has also been identified in New Caledonia, the Cook Islands, and Easter Island. In 2015, the circulation of the ZIKV in Northeast Brazil was confirmed. Recently, the Ministry of Health of Brazil published a letter to confirm the presence of ZIKV in eight states, in the Northeast and Southeast regions of Brazil. Recent findings show the presence of ZIKV in blood, semen, urine, and saliva, suggesting that the transmission could also be through these additional fluids. Saliva is a non-invasive, painless biofluid, with a reduced collection cost compared to blood and can be highly accurate using analytical platforms appropriate for each disease. However, evidence of ZIKV infection in salivary glands and its potential effect on salivary diagnosis is still incipient literature. In this context, the objective of the thesis was divided into 3 chapters: 1) present a physiological mechanism of ZIKV entry into salivary gland cells and its potential impact on salivary diagnosis; 2) evaluate the molecular composition of the submandibular glands in an animal model of ZIKV; and 3) assess the discriminatory discrimination ability of ZKV in different saliva products using a sustainable, reagent-free, rapid, and non-invasive biophonic platform. In the first chapter, it was revisited the expression of mRNA and proteins in salivary glands related to the molecular mechanism of ZIKV infection in salivary glands. Among them are type C lectin receptors and phosphatidylserine receptors (PS type TIM1, TIM3, TIM4, TYRO3, and AXL). From a pathophysiological perspective related to diagnosis, the salivary glands can allow the entry of ZIKV through the aforementioned transporters, allow the replication of ZIKV and its secretion to the acinar and duct lumen until it reaches the oral cavity with saliva, which is essential to develop appropriate strategies to perform diagnostic platforms for early detection of ZIKV in saliva. In the second chapter, it was developed an animal model of ZIKV infection using two-month-old male C57/BL6 knockout mice for the interferon-gamma gene. ZIKV infection was performed by intradermal administration with ZIKV (50 µL, 1 x 105 PFU) and the control received vehicle (50 µL). To confirm ZIKV infection in this animal model, ZIKV RNA replication was evaluated in the spleen of mice. It was observed that the presence of collagen reduced (p < 0.05) and nucleic acids increased (p < 0.05) in the submandibular glands of ZIKV-infected mice. In the third chapter, it was identified that a machine learning algorithm based on LDA discriminated infected saliva with 10⁴ PFU/mL, which is similar to that found clinically in ZIKV infection, with 80.5% accuracy (sensitivity: 77.7% and specificity: 83.3%) from non-infected saliva. In this way, the results demonstrate a potential application of this sustainable biophotonic platform without the use of reagents coupled with machine learning algorithms to detect ZIKV in saliva. Together, the review on the expression of transporters for ZIKV entry into salivary gland cells allowed an understanding of the pathophysiology of ZIKV in the major and minor salivary glands and its effects on oral health. The detection of alterations in the expression of collagen and nucleic acids in an animal model of ZIKV reinforces the importance of the pathophysiology of ZIKV in tissues of the oral cavity, and also that further studies should be directed to the effects of ZIKV in salivary glands. Furthermore, we demonstrate that a sustainable biophotonic platform using infrared spectra of saliva coupled with an artificial intelligence algorithm can detect ZIKV at concentrations similar to those found clinically. Tese (Doutorado)

CNPq - Conselho Nacional de Desenvolvimento Científico e Tecnológico O vírus Chikungunya (CHIKV) é o agente etiológico da febre de Chikungunya, uma doença transmitida globalmente através de mosquitos do gênero Aedes sp. Até o momento, não há tratamento antiviral ou vacina aprovados contra o CHIKV, sendo mandatório o desenvolvimento de novas estratégias terapêuticas. Nesse contexto, as proteínas isoladas dos venenos de serpentes têm demonstrado atividade antiviral contra diversos vírus, incluindo arboviroses relevantes para o sistema público de saúde. A fosfolipase A2CB (PLA2CB), uma proteína isolada da peçonha de Crotalus durissus terrificus, demonstrou possuir atividades anti-inflamatórias, antiparasitárias, antibacterianas e antivirais. Neste estudo, nós investigamos os vários efeitos da PLA2CB no ciclo replicativo do CHIKV in vitro. A atividade antiviral da PLA2CB foi avaliada usando CHIKV-nanoluciferase, uma construção viral inserida de um gene repórter (-nanoluc), para infectar células de rim de hamster bebê (BHK-21) e avaliar a viabilidade celular (ensaio MTT) e as taxas de infectividade (níveis de luminescência). Os resultados demostraram que a PLA2CB possui uma potente atividade antiviral, avaliada pelo índice de seletividade de 128 (razão de citotoxicidade por atividade antiviral). Identificamos que o tratamento com PLA2CB protegeu as células contra a infecção pelo CHIKV em 84%, e reduziu significativamente a entrada do vírus nas células hospedeiras por um efeito virucida maior que 99%, ou reduzindo a adsorção e desnudamento em 98 e 95%, respectivamente. Adicionalmente, a PLA2CB apresentou um efeito moderado, porém significante, inibindo 64% das etapas pós-entrada do ciclo replicativo do CHIKV. Cálculos envolvendo ancoramento molecular foram realizados, e os resultados sugerem interações entre PLA2CB e as glicoproteínas do CHIKV, principalmente com a E1, por meio de interações hidrofóbicas. Adicionalmente, análises de espectroscopia no infravermelho indicou interações da PLA2CB com glicoproteínas do CHIKV, corroborando com os dados das análises in silico. Nossos dados demonstraram os múltiplos efeitos antivirais da PLA2CB no ciclo replicativo do CHIKV, e sugerem as interações da PLA2CB com glicoproteínas do CHIKV como um modo de ação desse composto bloqueando a entrada do vírus nas células hospedeiras. Chikungunya virus (CHIKV) is the etiologic agent of Chikungunya fever, a globally spreading mosquito-borne disease. To date, there is no approved antiviral treatment or vaccine against CHIKV, being mandatory the development of new therapeutic strategies. In this context, proteins isolated from snake venoms have demonstrated antiviral activity against several virus, including arbovirus which are relevant the public health system. The phospholipase A2CB (PLA2CB), a protein isolated from the venom of Crotalus durissus terrificus, demonstrated to possess anti-inflammatory, antiparasitic, antibacterial, and antiviral activities. In this study, we investigated the multiple effects of PLA2CB on the CHIKV replicative cycle in vitro. The antiviral activity of PLA2CB was assessed using CHIKV-nanoluciferase, a viral construct inserted of a reporter gene (-nanoluc), to infect baby hamster kidney cells (BHK-21) cells and evaluate cell viability (MTT assay) and infectivity rates (luminescence levels). The results demonstrated that PLA2CB possess a strong antiviral activity judged by the selective index of 128 (ratio of cytotoxicity to antiviral activity). We identified that the treatment with PLA2CB protected the cells against CHIKV infection in 84% and strongly impaired virus entry to the host cells by a virucidal effect of over 99%, or by reducing adsorption and uncoating in 98 and 95 %, respectively. Moreover, PLA2CB presented a modest yet significant activity inhibiting 64 % of post-entry stages of CHIKV replicative cycle. Molecular docking calculations were performed and results suggested binding interactions between PLA2CB and CHIKV glycoprotein, mainly with E1 through hydrophobic interactions. In addition, infrared spectroscopy spectral analysis indicated interactions of PLA2CB and CHIKV glycoproteins, corroborating with data from in silico analyzes. Our data demonstrated the multiple antiviral effects of PLA2CB on the CHIKV replicative cycle, and suggest the interactions of PLA2CB with CHIKV glycoproteins as a mode of action of this compound on blocking virus entry to the host cells. Dissertação (Mestrado) 2022-07-24