Search

mTORC2 promotes cell survival by phosphorylating AKT and enhancing its activity. Inactivation of mTORC2 reduces viability through down-regulation of E2F1 caused by up-regulation of c-MYC. An additional target of mTORC2 is IGF2BP1, an oncofetal RNA binding protein expressed de novo in a wide array of malignancies. IGF2BP1 enhances c-MYC expression by protecting the coding region instability sequence (CRD) of its mRNA from endonucleolytic cleavage. Here we show that repression of mTORC2 signalling and prevention of Ser181 phosphorylation of IGF2BP1 enhanced translation and destabilization of the endogenous c-myc mRNA as well as the mRNA of reporter transcripts carrying the CRD sequence in frame. The consequent increase in c-MYC protein was accompanied by the emergence of an apoptotic c-MYC overexpressing population. On the other hand, preventing phosphorylation of IGF2BP1 on Tyr396 by Src kinase caused the accumulation of translationally silent transcripts through sequestration by IGF2BP1 into cytoplasmic granules. The apoptotic effect of mTORC2 signalling deprivation was augmented when preceded by inhibition of IGF2BP1 phosphorylation by the Src kinase in concert with further increase of c-MYC levels because of enhanced translation of the previously stored mRNA only in the presence of IGF2BP1. Furthermore, the combined administration of mTORC2 and Src inhibitors exhibited synergism in delaying xenograft growth in female NOD.CB17-Prkdcscid/J mice. The above in vitro and in vivo findings may be applied for the induction of targeted apoptosis of cells expressing de novo the oncofetal protein IGF2BP1, a feature of aggressive malignancies resulting in a more focused anticancer therapeutic approach.

The kinase Haspin phosphorylates histone H3 at threonine-3 (H3T3ph), creating a docking site for the Chromosomal Passenger Complex (CPC). CPC plays a pivotal role in preventing chromosome misalignment. Here, we have examined the effects of 5-Iodotubercidin (5-ITu), a commonly used Haspin inhibitor, on self-renewal and differentiation of mouse embryonic stem cells (ESCs). Treatment with low concentrations of 5-ITu eliminates the H3T3ph mark during mitosis, but does not affect the mode or the outcome of self-renewal divisions. Interestingly, 5-ITu causes sustained accumulation of p53, increases markedly the expression of histone genes and results in reversible upregulation of the pluripotency factor Klf4. However, the properties of 5-ITu treated cells are distinct from those observed in Haspin-knockout cells generated by CRISPR/Cas9 genome editing, suggesting “off-target” effects. Continuous exposure to 5-ITu allows modest expansion of the ESC population and growth of embryoid bodies, but release from the drug after an initial treatment aborts embryoid body or teratoma formation. The data reveal an unusual robustness of ESCs against mitotic perturbants and suggest that the lack of H3T3ph and the “off-target” effects of 5-ITu can be partially compensated by changes in expression program or accumulation of suppressor mutations.

The oncoprotein SET/I2PP2A (protein phosphatase 2A inhibitor 2) participates in various cellular mechanisms such as transcription, cell cycle regulation and cell migration. SET is also an inhibitor of the serine/threonine phosphatase PP2A, which is involved in the regulation of cell homeostasis. In zebrafish, there are two paralogous set genes that encode Seta (269 amino acids) and Setb (275 amino acids) proteins which share 94% identity. We show here that seta and setb are similarly expressed in the eye, the otic vesicle, the brain and the lateral line system, as indicated by in situ hybridization labeling. Whole-mount immunofluorescence analysis revealed the expression of Seta/b proteins in the eye retina, the olfactory pit and the lateral line neuromasts. Loss-of-function studies using antisense morpholino oligonucleotides targeting both seta and setb genes (MOab) resulted in increased apoptosis, reduced cell proliferation and morphological defects. The morphant phenotypes were partially rescued when MOab was co-injected with human SET mRNA. Knockdown of setb with a transcription-blocking morpholino oligonucleotide (MOb) resulted in phenotypic defects comparable with those induced by setb gRNA (guide RNA)/Cas9 [CRISPR (clustered regularly interspaced short palindromic repeats)-associated 9] injections. In vivo labeling of hair cells showed a significantly decreased number of neuromasts in MOab-, MOb- and gRNA/Cas9-injected embryos. Microarray analysis of MOab morphant transcriptome revealed differential expression in gene networks controlling transcription in the sensory organs, including the eye retina, the ear and the lateral line. Collectively, our results suggest that seta and setb are required during embryogenesis and play roles in the zebrafish sensory system development.

Cell differentiation is associated with progressive immobilization of chromatin proteins, expansion of heterochromatin, decrease of global transcriptional activity and induction of lineage-specific genes. However, how these processes relate to one another remains unknown. We show here that the heterochromatic domains of mouse embryonic stem cells (ESCs) are dynamically distinct and possesses a mosaic sub-structure. Although random spatio-temporal fluctuations reshuffle continuously the chromatin landscape, each heterochromatic territory maintains its dynamic profile, exhibiting robustness and resembling a quasi-steady state. Transitions towards less dynamic states are detected sporadically as ESCs downregulate Nanog and exit the self-renewal phase. These transitions increase in frequency after lineage-commitment, but evolve differently depending on cellular context and transcriptional status. We propose that chromatin remodeling is a step-wise process, which involves stochastic de-stabilization of regional steady states and formation of new dynamic ensembles in coordination to changes in the gene expression program.

Η παρούσα διδακτορική διατριβή εστιάζεται στη μελέτη ποντικών οι οποίοι φέρουν, σε ετερόζυγη ή ομόζυγη μορφή, μία μετάλλαξη στον υποδοχέα της λαμίνης Β (LBR). Οι πειραματικές προσεγγίσεις που χρησιμοποιήθηκαν κατατάσσονται σε τρεις κατηγορίες: α) μορφολογική ανάλυση διαφόρων ιστών και κυττάρων, β) βιοχημική ανάλυση πυρηνικών πρωτεϊνών και γ) ανάλυση του προτύπου έκφρασης σε επίπεδο γονιδιώματος. Αρχικά, μελετήθηκαν οι ακόλουθοι ιστοί σε τομές παραφίνης: δέρμα, σπλήνας, λεπτό έντερο, παχύ έντερο, στόμαχος, ήπαρ, νεφροί, εγκέφαλος, καρδιά και πνεύμονες. Ταυτόχρονα, πραγματοποιήθηκαν ανοσοϊστοχημικές χρώσεις σε τομές παραφίνης, κρυο-τομές, ή επιχρίσματα (απομονωμένα σπληνοκύτταρα) χρησιμοποιώντας αντισώματα που αναγνωρίζουν τις πυρηνικές λαμίνες, τον LBR, ή τις κερατίνες 8 και 19. Τέλος, μελετήθηκε η ικανότητα των Τ-λεμφοκυττάρων να μεταβαίνουν από τη φάση ηρεμίας (G0) σε φάση κυτταρικού πολλαπλασιασμού, μετά από ειδική επαγωγή με PHA. Τα πειράματα αυτά έδειξαν ότι η αρχιτεκτονική των περισσότερων ιστών και η κατανομή των πρωτεϊνών που εξετάστηκαν δεν έχουν επηρεαστεί από τη μετάλλαξη στον LBR. Παρόλα ταύτα, από τη μορφολογική μελέτη προέκυψαν ενδείξεις ότι η αλωπεκία που παρατηρείται στα ομόζυγα ζώα οφείλεται σε εκλεκτική υπερπλασία της κεράτινης στοιβάδας της επιδερμίδας, ενώ η καχεξία που τελικά οδηγεί στον θάνατο μπορεί να συσχετίζεται με βλάβες του εντερικού επιθηλίου. Αυτή η υπόθεση βασίζεται στο γεγονός ότι το επιθήλιο του λεπτού εντέρου στα ομόζυγα ποντίκια χαρακτηρίζεται από την παρουσία συσσωματωμάτων χρωματίνης στον πυρηνικό φάκελο που εμφανίζουν έναν ενδιαφέροντα «μωσαϊκό» φαινότυπο. Η μορφολογική ανάλυση που πραγματοποιήσαμε συμπληρώθηκε με βιοχημική ανάλυση των μετα-μεταφραστικών τροποποιήσεων στις ιστόνες Η3 και Η2Α με φασματοσκοπίας μάζας. Επίσης, πραγματοποιήθηκαν πειράματα συγκατακρήμνισης χρωματίνης χρησιμοποιώντας ως «δόλωμα» τις τρεις ισομορφές της ετεροχρωματινικής πρωτεΐνης HP1 και τον LBR. Τα παραπάνω πειράματα δεν αποκάλυψαν σημαντικές διαφορές ανάμεσα στα αγρίου τύπου και τα μεταλλαγμένα ζώα. Τα παραπάνω δεδομένα, σε συνδυασμό με τον καχεκτικό φαινότυπο των ομόζυγων ζώων, έκαναν απαραίτητη τη χρήση της τεχνολογίας μικροσυστοιχιών DNA, ώστε να εξεταστεί η αλλαγή στο πρότυπο έκφρασης των γονιδίων που εκφράζονται στο λεπτό έντερο. Η ανάλυση αυτού του τύπου αποκάλυψε 149 γονίδια-στόχους των οποίων η μεταγραφική δράση είναι σημαντικά διαφορετική στα ομόζυγα ζώα. Πολλά από αυτά τα γονίδια αντιστοιχούν σε μεταγραφικούς παράγοντες, ενώ άλλα σχετίζονται (άμεσα ή έμμεσα) με την πρόσληψη και απορρόφηση θρεπτικών υλών. Τα γονίδια Smad3 και Banf1 παρουσίασαν αύξηση των επιπέδων του RNA τους και αυτό επιβεβαιώθηκε με τη χρήση ποσοτικής PCR. Με τον ίδιο τρόπο μελετήθηκαν τα επίπεδα μεταγραφής των γονιδίων Areg, Reg3b/Pap, Vimentin και I-FABP2. Από τη μελέτη μας συμπεραίνεται ότι ο LBR διαδραματίζει σημαντικό ρόλο στο μεταγραφικό έλεγχο συγκεκριμένων γονιδίων, άποψη που συμφωνεί με αποτελέσματα που έχουν δημοσιευθεί στην πρόσφατη βιβλιογραφία.

Lamin B receptor (LBR) is a polytopic protein of the nuclear envelope thought to connect the inner nuclear membrane with the underlying nuclear lamina and peripheral heterochromatin. To better understand the function of this protein, we have examined in detail its nucleoplasmic region, which is predicted to harbor a Tudor domain (LBR-TD). Structural analysis by multidimensional NMR spectroscopy establishes that LBR-TD indeed adopts a classical β-barrel Tudor fold in solution, which, however, features an incomplete aromatic cage. Removal of LBR-TD renders LBR more mobile at the plane of the nuclear envelope, but the isolated module does not bind to nuclear lamins, heterochromatin proteins (MeCP2), and nucleosomes, nor does it associate with methylated Arg/Lys residues through its aromatic cage. Instead, LBR-TD exhibits tight and stoichiometric binding to the "histone-fold" region of unassembled, free histone H3, suggesting an interesting role in histone assembly. Consistent with such a role, robust binding to native nucleosomes is observed when LBR-TD is extended toward its carboxyl terminus, to include an area rich in Ser-Arg residues. The Ser-Arg region, alone or in combination with LBR-TD, binds both unassembled and assembled H3/H4 histones, suggesting that the TD/RS interface may operate as a "histone chaperone-like platform."