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The acquisition of a migratory phenotype is central in processes as diverse as embryo differentiation and tumor metastasis. An early event in this phenomenon is the generation of a nucleus-centrosome-Golgi back-to-front axis. AKAP350 (also known as AKAP9) is a Golgi and centrosome scaffold protein that is involved in microtubule nucleation. AKAP350 interacts with CIP4 (also known as TRIP10), a cdc42 effector that regulates actin dynamics. The present study aimed to characterize the participation of centrosomal AKAP350 in the acquisition of migratory polarity, and the involvement of CIP4 in the pathway. The decrease in total or in centrosomal AKAP350 led to decreased formation of the nucleus-centrosome-Golgi axis and defective cell migration. CIP4 localized at the centrosome, which was enhanced in migratory cells, but inhibited in cells with decreased centrosomal AKAP350. A decrease in the CIP4 expression or inhibition of the CIP4-AKAP350 interaction also led to defective cell polarization. Centrosome positioning, but not nuclear movement, was affected by loss of CIP4 or AKAP350 function. Our results support a model in which AKAP350 recruits CIP4 to the centrosome, providing a centrosomal scaffold to integrate microtubule and actin dynamics, thus enabling centrosome polarization and ensuring cell migration directionality. Fil: Tonucci, Facundo Mauro. Consejo Nacional de Investigaciones Científicas y Técnicas. Centro Científico Tecnológico Conicet - Rosario. Instituto de Fisiología Experimental. Universidad Nacional de Rosario. Facultad de Ciencias Bioquímicas y Farmacéuticas. Instituto de Fisiología Experimental; Argentina Fil: Hidalgo, Florencia. Consejo Nacional de Investigaciones Científicas y Técnicas. Centro Científico Tecnológico Conicet - Rosario. Instituto de Fisiología Experimental. Universidad Nacional de Rosario. Facultad de Ciencias Bioquímicas y Farmacéuticas. Instituto de Fisiología Experimental; Argentina Fil: Ferretti, Anabela. Consejo Nacional de Investigaciones Científicas y Técnicas. Centro Científico Tecnológico Conicet - Rosario. Instituto de Fisiología Experimental. Universidad Nacional de Rosario. Facultad de Ciencias Bioquímicas y Farmacéuticas. Instituto de Fisiología Experimental; Argentina Fil: Almada, Evangelina. Consejo Nacional de Investigaciones Científicas y Técnicas. Centro Científico Tecnológico Conicet - Rosario. Instituto de Fisiología Experimental. Universidad Nacional de Rosario. Facultad de Ciencias Bioquímicas y Farmacéuticas. Instituto de Fisiología Experimental; Argentina Fil: Favre, Cristian. Consejo Nacional de Investigaciones Científicas y Técnicas. Centro Científico Tecnológico Conicet - Rosario. Instituto de Fisiología Experimental. Universidad Nacional de Rosario. Facultad de Ciencias Bioquímicas y Farmacéuticas. Instituto de Fisiología Experimental; Argentina Fil: Goldenring, James R.. Vanderbilt University. Faculty of the Medical School; Estados Unidos Fil: Kaverina, Irina. Vanderbilt University. Faculty of the Medical School; Estados Unidos Fil: Kierbel, Arlinet Verónica. Consejo Nacional de Investigaciones Científicas y Técnicas. Centro Científico Tecnológico Conicet - La Plata. Instituto de Investigaciones Biotecnológicas. Instituto de Investigaciones Biotecnológicas "Dr. Raúl Alfonsín" (sede Chascomús). Universidad Nacional de San Martín. Instituto de Investigaciones Biotecnológicas. Instituto de Investigaciones Biotecnológicas "Dr. Raúl Alfonsín" (sede Chascomús); Argentina Fil: Larocca, Maria Cecilia. Consejo Nacional de Investigaciones Científicas y Técnicas. Centro Científico Tecnológico Conicet - Rosario. Instituto de Fisiología Experimental. Universidad Nacional de Rosario. Facultad de Ciencias Bioquímicas y Farmacéuticas. Instituto de Fisiología Experimental; Argentina

Growing evidence is pointing to the importance of multicellular bacterial structures in the interaction of pathogenic bacteria with their host. Transition from planktonic to host cell-associated multi- cellular structures is an essential infection step that has not been described for the opportunistic human pathogen Pseudomonas aeruginosa. In this study we show that P. aeruginosa interacts with the surface of epithelial cells mainly forming aggregates. Dynamics of aggregate formation typically follow a sigmoidal curve. First, a single bacterium attaches at cell–cell junctions. This is followed by rapid recruitment of free-swimming bacteria and association of bacterial cells result- ing in the formation of an aggregate on the order of minutes. Aggregates are associated with phosphatidylinositol 3,4,5-trisphosphate (PIP3)- enriched host cell membrane protrusions. We further show that aggregates can be rapidly inter- nalized into epithelial cells. Lyn, a member of the Src family tyrosine kinases previously implicated in P. aeruginosa infection, mediates both PIP3- enriched protrusion formation and aggregate internalization. Our results establish the first framework of principles that define P. aeruginosa transition to multicellular structures during inter- action with host cells. Agencia Nacional de Investigación e Innovación (ANII) Fogarty International Center, National Institutes of Health (NIH)

Tesis de Doctorado en Biología Molecular y Biotecnología Pseudomonas aeruginosa es una bacteria ambiental de amplia distribución, pero también es un patógeno oportunista que puede causar infecciones agudas de gran severidad en heridos y quemados, e infecciones crónicas en pacientes con fibrosis quística, lo que conlleva a altos índices de mortalidad. En estos pacientes, un factor determinante de la cronicidad de la infección es la formación de biofilms. En las etapas iniciales de la formación de un biofilm, bacterias que se encuentran nadando libremente son reclutadas sobre una superficie, donde son capaces de formar estructuras multicelulares. Anteriormente reportamos que P. aeruginosa se adhiere a células epiteliales polarizadas formando agregados. Demostramos que la formación de estas estructuras bacterianas multicelulares ocurre de novo y en el orden de minutos sobre la superficie epitelial por el reclutamiento de bacterias planctónicas. También vimos que estos agregados se forman sobre células apoptóticas extruidas de la monocapa. Basándonos en su morfología, clasificamos a dichas células como apoptóticas tardías. En este trabajo de tesis caracterizamos en más detalle las células apoptóticas a las que se une P. aeruginosa. Mediante estudios de microscopía confocal observamos que estas células poseen bajo contenido intracelular de especies reactivas de oxígeno y de ADN, lo cual es característico de etapas avanzadas del proceso de apoptosis. También estudiamos la formación de los agregados durante los primeros minutos de infección utilizando videomicroscopía confocal, técnica que nos permite seguir el comportamiento de bacterias individuales. Vimos que las bacterias se adhieren a las células apoptóticas por un polo y que su distribución sobre la célula es heterogénea, habiendo zonas donde las bacterias se adhieren en mayor densidad. Encontramos que esta distribución está determinada, en parte, por las características de la membrana plasmática de la célula apoptótica. Mediante microscopía electrónica de barrido vimos que las células apoptóticas a las que se unen las bacterias presentan, en su membrana plasmática, un gran número de cuerpos apoptóticos, lo que les otorga una morfología intrincada. En la segunda parte de este trabajo mostramos que P. aeruginosa, luego de unirse a la célula apoptótica, es internalizada por las células adyacentes de la monocapa mediante eferocitosis (el proceso por el cual fagocitos profesionales y no profesionales internalizan y degradan células apoptóticas), ya que puede ser encontrada dentro de células que además contienen material apoptótico internalizado y, al modular la eferocitosis, aumentándola o disminuyéndola, la internalización de la bacteria se ve afectada en el mismo sentido. Por último, vimos que, dentro de la célula, P. aeruginosa se encuentra en vesículas que poseen características lisosomales donde, finalmente, es eliminada. Este trabajo es relevante en el contexto de la fibrosis quística, ya que los individuos que tienen esta enfermedad poseen un número exacerbado de células apoptóticas, debido a un aumento en la apoptosis y a una deficiente eferocitosis, lo que puede favorecer la colonización por P. aeruginosa, así como limitar su eliminación. Estos hallazgos también son importantes en casos de infecciones en individuos heridos o quemados ya que las heridas presentan un gran número de células apoptóticas. Comprender el modo de colonización, mediante el estudio de la interacción de la bacteria con el sustrato, así como los mecanismos de eliminación por parte de las células hospedadoras ofrece información relevante para indagar tanto acerca de la prevención de infecciones por esta bacteria, como en posibles tratamientos. Teniendo en cuenta esto, la modulación positiva de la eferocitosis podría ser un enfoque terapéutico atractivo ya que no solo contribuiría a disminuir la colonización, sino también a la eliminación de la bacteria. Fil: Pepe, María Victoria. Universidad Nacional de San Martín. Escuela de Bio y Nanotecnologías. Instituto de Investigaciones Biotecnológicas; Buenos Aires, Argentina.

Tesis Doctoral Pseudomonas aeruginosa es una bacteria ambiental de amplia distribución. Pero es también un patógeno oportunista que puede causar infecciones agudas de gran severidad en heridos y quemados e infecciones crónicas en pacientes con fibrosis quística que conllevan a altos índices de mortalidad. En estos pacientes, un factor determinante de la cronicidad de la infección es la formación de biofilms. En las etapas iniciales de la formación de un biofilm, bacterias que se encuentran nadando libremente son reclutadas sobre una superficie, lo que implica una transición desde un estado planctónico a un estado multicelular, sésil y adherido. Este tipo de transición ha sido poco estudiada en general y menos aún cuando ocurre sobre superficies bióticas. Anteriormente reportamos que P. aeruginosa se adhiere a células epiteliales polarizadas principalmente en forma de agregados. Demostramos que la formación de estas estructuras bacterianas multicelulares ocurre de novo y en el orden de minutos sobre la superficie epitelial por el reclutamiento de bacterias que nadan impulsadas por el flagelo. En este trabajo de tesis estudiamos este fenómeno en profundidad. Hemos observado que la adhesión y agregación de P. aeruginosa no ocurre en cualquier sitio de la superficie epitelial. Nuestros resultados muestran que los eventos de adhesión/agregación ocurren sobre las uniones célula-célula, particularmente en sitios multi-uniones formadas por cuatro o más células. Estas multi-uniones se pueden formar como consecuencia de la extrusión de células apoptóticas. Indagamos entonces si P. aeruginosa estaría adhiriéndose a la superficie de células apoptóticas extruídas. A partir de distintas aproximaciones experimentales pudimos establecer que, al interaccionar con la barrera epitelial, P. aeruginosa se adhiere y agrega sobre células apoptóticas extruídas, que se encuentran sobre sitios multi-uniones. La afinidad de esta bacteria por células muertas es independiente del tipo de muerte celular, ya que también observamos adhesión y agregación sobre células necróticas. Indagamos también en los mecanismos mediante los cuales esta bacteria localiza las células apoptóticas. Para discernir si este encuentro era estocástico o mediado por quimiotaxis, generamos modelos que emularan uno u otro escenario y realizamos simulaciones. A partir de la data in silico determinamos que tanto la forma como la cinética de formación de los agregados son parámetros sensibles a la presencia de quimiotaxis. Mediante microscopía confocal in vivo registramos la formación de los agregados en 3D y en el tiempo (xyzt). A partir de estos datos estudiamos la cinética de incorporación al agregado en bacterias wt y en bacterias mutantes de quimiotaxis. Determinamos que los agregados formados por bacterias wt6 crecen más rápido que aquellos formados por las mutantes. Nuestros resultados muestran que si bien la quimiotaxis no es imprescindible para la formación de agregados, tiene un rol en la cinética del proceso. Dan cuenta además de un concepto novedoso: la quimiotaxis involucrada en un comportamiento colectivo de las bacterias. Por otro lado, a partir de tratamientos enzimáticos sobre las células apoptóticas determinamos que las moléculas a las que P. aeruginosa se adhiere serían de naturaleza proteica. Nuestros hallazgos son relevantes para el estudio de las infecciones con P. aeruginosa en contextos donde las mismas representan un problema de gravedad, como la fibrosis quística o las heridas y quemaduras, todos ellos caracterizados por la presencia de gran número de células muertas. Pero además, el fenómeno descripto representa un proceso de transición desde un estado planctónico a uno multicelular en el que es posible registrar en tiempo real la incorporación y la localización individual de cada bacteria. Esto posibilitará en el futuro estudiar cómo influye el posicionamiento de las bacterias individuales y su interacción con la célula blanco y con otras bacterias en la emergencia de la estructura multicelular. Fil: Capasso, Dario Nicolás. Universidad Nacional de San Martín. Instituto de Investigaciones Biotecnológicas; Buenos Aires, Argentina.