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The protein therapeutic and CD95L inhibitor asunercept is currently under clinical investigation for the treatment of glioblastoma and myelodysplastic syndrome. The purpose of this study was to predict the asunercept pharmacokinetics in children and to give dose recommendations for its first use in pediatric glioblastoma patients. A physiologically-based pharmacokinetic (PBPK) model of asunercept in healthy and diseased adults was successfully developed using the available clinical Phase I and Phase II study data. This model was then extrapolated to different pediatric populations, to predict the asunercept exposure in children and to find equivalent starting doses. Simulation of the asunercept serum concentration-time curves in children between 1&ndash, 18 years of age shows that a dosing regimen based on body weight results in a similar asunercept steady-state exposure in all patients (pediatric or adult) above 12 years of age. For children between 1&ndash, 12 years, higher doses per kg body weight are recommended, with the highest dose for the very young patients. Translational PBPK modeling is strongly encouraged by regulatory agencies to help with the initial dose selection for pediatric trials. To our knowledge, this is the first report of pediatric PBPK to support the dose selection of a therapeutic protein before its administration to children.

International audience; CD95, a member of the death receptor family initiates a caspase-dependent apoptosis, when activated by its ligand CD95L, thought to negatively regulate erythrocyte production in the bone marrow. We have previously shown that CD95 is overexpressed in two thirds of patients with a lower risk myelodysplastic syndrome (MDS) and that resistance to erythropoiesis-stimulating agents (ESA) is linked to poor residual erythropoiesis. In the present study, we show that CD95 overexpression and previous transfusion are independent predictive factors of ESA resistance. To investigate an alternative therapeutic strategy of anemia in ESA-resistant patients, we have conducted a preclinical study of the effects of APG101, a fusion protein consisting of the extracellular domain of human CD95 and the Fc region of human IgG1 on MDS erythropoiesis in vitro. APG101 increases the number of burst-forming unit-erythroid (BFU-E) progenitors derived from CD34 + progenitors in liquid culture and improves overall proliferation rate of erythroid precursors by inhibiting apoptosis. APG101 rescues BFU-E growth in MDS patients presenting with attrition of erythroid progenitors at baseline, independently of CD95 or CD95L expression level. Our data show that overexpression of CD95 at diagnosis is a hallmark of ESA resistance and that severe impairment of erythropoiesis is predictive of erythroid response to APG101 in vitro. These data provide a rationale for further clinical investigation of APG101 in an attempt to treat anemia in lower risk MDS patients.

In der vorliegenden Arbeit wurde an einem kleinen Spektrum humaner Xenograft-Tumoren exemplarisch die cAMP-hydrolysierende PDE-Aktivität untersucht. Dabei konnte gezeigt werden, dass sich Tumoren unterschiedlichen Gewebeursprungs stark in ihrer cAMP-hydrolysierenden PDE-Aktivität unterscheiden können, aber dass auch bei verschiedenen Tumoren des gleichen Gewebes die PDE-Aktivität ebenfalls stark variiert. Gleichzeitig wurden große Unterschiede im prozentualen Anteil an PDE4 gefunden. In nahezu der Hälfte der untersuchten Xenografts stellen Isoenzyme der PDE4-Familie weniger als 50% an der Gesamt-PDE-Aktivität dar. Bei Untersuchungen des großzelligen humanen Lungenxenografts LXFL529, der verglichen mit allen anderen untersuchten Tumoren die höchste PDE-Aktivität aufweist, konnte gezeigt werden, dass dieses Tumorgewebe PDE4D3 zu enthalten scheint, die jedoch sehr leicht proteolytisch gespalten wird. Außerdem wurden kurze Formen des PDE4D-Gens detektiert. Dabei könnte es sich um PDE4D1, PDE4D2 oder die von Eyschen (1999) aus LXFL529-Tumorgewebe isolierte trunkierte PDE4D3 handeln. Möglicherweise wird in LXFL529-Xenograftgewebe auch eine kurze Form einer nicht zur PDE4D-Isoenzymfamilie gehörenden PDE exprimiert. Zur genauen Bestimmung müssen noch weitere Untersuchungen durchgeführt werden. Bislang wurden wirkmechanistische Untersuchungen mit PDE4-Hemmstoffen ausschließlich an Permanent-Zelllinien durchgeführt. Um Aussagen über die Übertragbarkeit der Ergebnisse in vitro auf die in vivo-Situation zu ermöglichen, wurde Tumorgewebe zweier unterschiedlicher Lungentumor-Xenografts, LXFL529 und das humane kleinzellige Lungenkarzinom LXFS650, bezüglich seiner cAMP-hydrolysierenden PDE-Aktivität und dem Gehalt an PDE4 mit den entsprechenden Permanent-Zelllinien verglichen. Dabei wiesen beide Zelllinien eine wesentlich niedrigere PDE-Gesamtaktivität als die entsprechenden soliden Xenograft-Tumoren auf. Der Anteil an PDE4 liegt in LXFL529L-Zellen und soliden Tumor in der gleichen Größenordnung. Auch im Cytosol von LXFS650 (Zelllinie und Tumor) wird der gleiche Prozentsatz PDE4 nachgewiesen, während er im Partikular der Zelllinie deutlich höher liegt im entsprechenden Tumor. Ein wesentlicher Bestandteil dieser Arbeit waren Untersuchungen zum Wirkmechanismus des potenten PDE4-Inhibitors DC-TA-46. Dieser Hemmstoff zeigt große Unterschiede in den IC50-Werten der Hemmung isolierter PDE4 aus LXFL529-Tumorgewebe (0,016 microM) bzw. der Wachstumshemmung von LXFL529L-Zellen (2,3 microM). Im Rahmen dieser Arbeit konnte gezeigt werden, dass die subzelluläre Verteilung des Hemmstoffs vermutlich eine wesentliche Rolle spielt. Die PDE-Aktivität von Proteinpräparationen aus LXFL529L-Zellen wird durch DC-TA-46 mit IC50-Werten von 0,22 microM (Cytosol) und 0,5 microM (Partikular) gehemmt und unterscheidet sich in der Sensitivität damit nicht von Proteinpräparationen aus solidem Tumorgewebe. Inkubiert man jedoch LXFL529L-Zellen mit der Substanz, so erreicht man erst bei Konzentrationen > 10 -6 M eine Hemmung der cytosolischen PDE-Aktivität. Im Partikular der Zellen zeigt sich hingegen durch die Anreicherung von DC-TA-46 in Membranstrukturen eine deutliche Erhöhung der Hemmwirkung im Vergleich zur entsprechenden isolierten Proteinpräparation. Die Hemmung der intrazellulären PDE-Aktivität scheint dabei auch zelltyp-spezifisch zu sein. Analoge Versuche mit LXFS650L-Zellen zeigten eine deutlich höhere Hemmung der cytosolischen PDE im Vergleich zu LXFL529L-Zellen. Dies scheint mit der höheren Sensitivität von LXFS650L-Zellen gegenüber der wachstumshemmenden Wirkung von DC-TA-46 im Sulforhodamin B-Test zu korrelieren. Diese Untersuchungen zeigten, dass die Bestimmung der intrazellulären Hemmwirkung eine wesentliche Messgröße zur Untersuchung potentieller PDE-Hemmstoffe darstellt. Deshalb wurde für die bislang in unserem Arbeitskreis zur Verfügung stehenden Pteridinderivate die Hemmung der intrazellulären PDE untersucht. Fluoreszenzmikroskopische Untersuchungen an LXFL529L-Zellen ergaben keine Anhaltspunkte für Unterschiede in der subzellulären Lokalisation der verschiedenen Derivate. Alle Substanzen scheinen sich ebenso wie DC-TA-46 in Membranstrukturen in der perinuklearen Region anzureichern. Die Derivate unterscheiden sich jedoch deutlich in ihrer Hemmung. Durch Variation der Substituenten in 4- und 7-Position bzw. an 6-Position konnte am ehesten eine gute PDE-Hemmung erreicht werden. Zwei an 7-Position substituierte Derivate mit basischem Stickstoff ohne H-Donorfunktion zeigten sogar eine bessere Inhibition der zellulären PDE als DC-TA-46. Durch Variationen der Substituenten in 2-Position des Grundgerüsts kann keine bzw. nur geringe Hemmung zellulärer PDE erreicht werden. Die meisten Veränderungen an 4 -Position konnten keine PDE-Hemmung erzielen. Für die Hemmung zellulärer PDE scheint also ein größerer Rest an 6-Position als Wasserstoff wichtig zu sein bzw. eine Wasserstoffdonorfunktion des basischen Stickstoffs in 4 -Position. Lediglich eine an 4 -Position mit einem Acetylrest substituierte Verbindung war in LXFL529L-Zellen ein potenter PDE-Hemmstoff, nicht jedoch am isolierten Enzym, was auf die Freisetzung der Leitsubstanz DC-TA-46 durch metabolische Prozesse in der Zelle zurückzuführen sein kann. Deshalb sollte bei zukünftigen biologischen Testungen nicht nur am isolierten Enzym, sondern auch in Zellen getestet werden sollte, da nur so pharmakologische Prozesse einbezogen werden. In vitro führt die Behandlung von Tumorzellen mit DC-TA-46 zu einem Zellzyklusarrest in der G1-Phase des und zur Induktion von Apoptose [Wagner, 1998; Marko et al., 1998]. Im Rahmen dieser Arbeit konnte gezeigt werden, dass dieser Zellzyklus-Arrest nicht durch die Wirkung des Pteridinderivats auf die Cyclin-abhängigen Kinase-Inhibitoren p21 cip1 und p27 kip1 zustande kommt. Der cAMP-Gehalt von Zellen kann während des Zellzyklus periodischen Schwankungen unterliegen [Millis et al., 1974]. In LXFL529L-Zellen konnte eine positive Korrelation zwischen der PDE-Aktivität im Cytosol und dem Anteil der Zellen in der G0/G1-Phase des Zellzyklus detektiert werden. Im Partikular hingegen ist ein deutlicher Zusammenhang zwischen der PDE-Aktivität und des Gehalts von G2/M-Phase-Zellen bzw. eine negative Korrelation zwischen partikulärer PDE-Aktivität und dem Anteil der G1-Phase-Zellen zu sehen. Da DC-TA-46 aufgrund seiner subzellulären Lokalisation hauptsächlich im Partikular wirksam ist, scheint v.a. die Hemmung der partikulären Isoenzyme für den G1-Arrest wesentlich zu sein. Im Rahmen dieser Arbeit konnte nun umgekehrt gezeigt werden, dass in LXFL529L-Zellen in der G1-Phase eine geringe partikuläre PDE-Aktivität vorliegt.