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A inflamação inespecífica do reservatório ileal (RI) após retocolectomia total é a complicação pós-operatória mais comum nos doentes operados por retocolite ulcerativa inespecífica (RCUI). Os mecanismos imunológicos envolvidos na etiologia não são totalmente conhecidos. OBJETIVO: Avaliar a ativação de STAT-1 e a expressão da citocina INF-γ em mucosa de RI endoscópica e histologicamente normal, de doentes operados por RCUI e PAF, assintomáticos. CASUISTICA E MÉTODOS: Estudou-se 18 doentes submetidos à retocolectomia total com RI em "J", sendo nove com RCUI e nove com polipose adenomatosa familiar (PAF). Realizou-se biópsias da mucosa dos RI e de íleo terminal. As expressões de INF-γ e a ativação de STAT-1 foram avaliadas por meio de imunoblot de extrato protéico total. RESULTADOS: A ativação de STAT-1 foi maior em mucosa de RI de doentes operados por RCUI, quando comparada aos grupos PAF e Controle (p0.05). CONCLUSÃO: Estes achados podem justificar a maior susceptibilidade dos doentes com RCUI à inflamação inespecífica do RI quando comparados aos portadores de PAF, sendo a principal via inflamatória similar à verificada na RCUI.Pouchitis after total retocolectomy is the most common complication in ulcerative colitis (UC). The immunological mechanisms involved in the genesis of pouchitis are unclear. PURPOSE: To evaluate STAT-1 activation and IFN-ã expression in normal ileal pouch mucosa. METHODS: Eighteen asymptomatic patients submitted to total retocolectomy and J pouch, were evaluated, being nine with UC and nine with FAP. The activation of STAT-1 and expressions of the cytokine were determined by immunoblot of total protein extracts from pouch mucosal biopsies. RESULTS: STAT-1 activation was increased in UC, when compared to FAP and controls. Higher levels of IFN-γ expression were observed in UC when compared to control group, but was similar to FAP. CONCLUSIONS: These findings could explain a higher susceptibility to this inflammatory complication in UC when compared to FAP, which may be similar to UC disease.

A ileíte do reservatório pós retocolectomia total constitui uma das complicações mais comuns nos doentes com RCUI, apresentando pequena freqüência nos doentes com PAF. OBJETIVO: Avaliar a atividade inflamatória em mucosa de reservatórios ileais endoscopicamente normais, através da expressão de TNF-alfa, NF-kapaB e IL-1beta. CASUÍSTICA E MÉTODOS: Selecionaram-se 20 doentes submetidos à retocolectomia total com reservatório ileal em "J" pelo Grupo de Coloproctologia da UNICAMP, sendo 10 doentes com RCUI e 10 com PAF. O grupo controle foi constituído por íleo terminal de intestino normal. Realizadas biópsias da mucosa do reservatório ileal e do íleo terminal normal, e congeladas em nitrogênio líquido. A expressão de TNF-alfa e IL-1beta foi analisada por extrato total e de NF-kB por meio de imunoprecipitado. A separação protéica foi feita por eletroforese em gel de poliacrilamida. RESULTADOS: Expressão de TNF-alfa e IL-1beta apresentaram níveis maiores nos doentes com RCUI, quando comparados àqueles com PAF (p0.1) e IL-1beta (p > 0.05) sem diferença estatística em relação aos demais grupos. CONCLUSÃO: Os doentes com RCUI apresentaram maiores níveis de expressão das citocinas estudadas, mesmo sem evidência clínica e endoscópica de ileíte do reservatório, podendo justificar maior suscetibilidade dos doentes com RCUI a esta complicação.Pouchitis after total retocolectomy is one of the most common complication of patients with ulcerative colitis (UC), while its frequency is quite rare in familial adenomatous polyposis (FAP). PURPOSE: To evaluate the inflammatory activity in endoscopicaly normal mucosa of the ileal pouch, by determining the expression of TNF-alpha and IL-1beta, and the activation of NF-kappaB. METHODS AND PATIENTS: Twenty patients with "J" pouch after total retocolectomy were studied, being 10 patients with UC and 10 with FAP. The control group was constituted by biopsies from terminal ileum take during normal colonoscopy examination. Biopsies from mucosa of the pouch and from normal ileum were done, and they were snap-frozen in liquid nitrogen. The expression of TNF-alpha and IL-1beta were analyzed by total extract, and NF-kappaB was evaluated by immunoprecipitation and immunoblot. RESULTS: Expression of TNF-alpha and IL-1beta was increased in patients with UC, when it was compared with FAP (p0.1) and the expression of IL-1beta (p>0.05) were similar, when comparing UC and FAP with control group. CONCLUSION: The patients with UC presented increased levels of the studied cytokines, even without clinic and endoscope evidence of pouchitis. These findings could be a suggestion of higher susceptibility to this complication among patients with UC.

O magnésio é um cátion essencial o qual age como co-fator para adenosina trifosfatases em inúmeras reações enzimáticas. Vários estudos mostram seu envolvimento na ação e secreção de insulina e os efeitos deste hormônio sobre o metabolismo e transporte do magnésio. Entretanto, os resultados são conflitantes. Sugerem que a deficiência de magnésio está implicada direta ou indiretamente com a resistência à insulina no diabetes mellitus, enquanto outros descrevem uma relação inversa ou, ainda, um aumento da captação de glicose decorrente da falta de magnésio. A interação deste cátion com outros íons, os mecanismos hormonais e neuro-hormonais compensadores e possivelmente a duração da deficiência são alguns dos fatores descritos como responsáveis pelas variações na regulação glicêmica observadas durante a deficiência de magnésio.Magnesium is an essential cation involved in many enzymatic reactions as a cofactor for adenosine triphosphatases. Several studies have documented its role in the insulin action and secretion and the effects of this hormone on magnesium metabolism and transport. These results, however, are unclear. Magnesium deficiency could be one of the causes of insulin resistance in diabetes mellitus or, inversely, could be one of the consequences of it. Moreover, an increased glucose disposal is suggested. The interaction between magnesium and other ions, the hormonal and neurohormonal compensating mechanisms and probably the duration of the deficiency are some factors responsible for the changings in glucose homeostasis during the magnesium deficiency.

Nonalcoholic steatohepatitis (NASH) is a fatty liver disorder that could be improved with extra virgin olive oil (EVOO) supplementation in diet. We propose the monitoring, in whole mouse liver extracts and in isolated mitochondria, of the absorption of compounds from three different diets: standard (CT), high-fat (HFD) and high-fat supplemented with EVOO (HFSO). Male mice were submitted to one of the following three diets: CT or HFD for 16 weeks or HFD for 8 weeks followed by additional 8 weeks with HFSO. Following this period, liver was extracted for histological evaluation, mitochondria isolation and mass spectrometry analyses. Diets, liver extracts and Percoll-purified mitochondria were analyzed using ESI-MS and the lipidomics approach. Morphological, histological and spectrometric results indicated a decrease in NASH severity with EVOO supplementation in comparison with animals maintained with HFD. Spectrometric data also demonstrated that some compounds presented on the diets are absorbed by the mitochondria. EVOO was shown to be a potential therapeutic alternative in food for NASH. Our results are in accordance with the proposition that the major factor that influences different responses to diets is their composition - and not only calories - especially when it comes to studies on obesity.

We have associated functional and molecular studies of insulin and leptin to investigate the effect of TNF-alpha on central insulin and leptin signaling in rats pre-treated with PTP1B-ASO. The icv infusion of TNF-alpha-induced an increase in PTP1B protein expression and activity, and attenuated insulin and leptin sensitivity and signaling in the hypothalamus. However, TNF-alpha was able to completely blunt the leptin and insulin effect in rats treated with PTP1B-ASO, suggesting that TNF-alpha does not require PTP1B to fully attenuate the leptin and insulin effects. In addition, our data also show that other mechanisms of insulin and leptin resistance are activated in the hypothalamus by TNF-alpha.

Insulin (Ins) and angiotensin II (AII) play pivotal roles in the control of two vital and closely related systems: the metabolic and the circulatory, respectively. A failure in the proper action of each of these hormones results, to a variable degree, in the development of two highly prevalent and commonly overlapping diseases--diabetes mellitus (DM) and hypertension (AH). In recent years, a series of studies has revealed a tight connection between the signal transduction pathways that mediate Ins and AII actions in target tissues. This molecular cross-talk occurs at multiple levels and plays an important role in phenomena that range from the action of anti-hypertensive drugs to cardiac hypertrophy and energy acquisition by the heart. At the extracellular level, the angiotensin-converting enzyme controls AII synthesis but also interferes with Ins signaling through the proper regulation of AII and the accumulation of bradykinin. At an early intracellular level, AII, acting through JAK-2/IRS-1/PI3-kinase, JNK and ERK, may induce the serine phosphorylation and inhibition of key elements of the Ins-signaling pathway. Finally, by inducing the expression of the regulatory protein SOCS-3, AII may impose a late control on the Ins signal. This review will focus on the main advances obtained in this field and will discuss the implications of this molecular cross-talk in the common clinical association between DM and AH.

INTRODUÇÃO: Obesidade (OB) e anorexia nervosa (AN) são doenças crônicas de etiologia multifatorial, de difícil tratamento e associadas com aumento do risco de mortalidade em relação à população geral. A identificação de fatores que influenciam essas doenças pode levar à melhor compreensão dos mecanismos fisiopatológicos envolvidos e à descoberta de novos alvos terapêuticos. A magreza constitucional (MC) é caracterizada por baixo peso na ausência de desnutrição, excesso de exercícios ou doenças crônicas que impliquem em perda ponderal, e pela presença de menstruações regulares e resistência natural e fisiológica ao ganho de peso. Estudos revelaram diferenças entre a microbiota intestinal (MI) de pessoas com OB e com peso normal (PN), e mais recentemente, entre indivíduos com AN e com PN. OBJETIVO: Caracterizar e comparar parâmetros antropométricos, metabólicos, de saúde mental e a MI de mulheres com OB, PN, AN e MC. MÉTODOS: Essa tese foi composta pela compilação de dois artigos. No primeiro, avaliamos e comparamos aspectos de saúde mental avaliados por questionários nos quatro grupos, correlacionando- os às variáveis antropométricas e laboratoriais. No segundo, caracterizamos e comparamos a MI (a partir da extração e sequenciamento do DNA bacteriano presente nas amostras fecais), avaliando também as correlações dos resultados da MI com os parâmetros antropométricos, laboratoriais e de saúde mental. Foram avaliadas 77 mulheres de 18 a 40 anos (20 com OB, 19 com PN, 20 com MC e 20 com AN). RESULTADOS: As mulheres com AN apresentaram os maiores escores em ansiedade e checagem corporal (p0,3 e p 0.3 e p

Nas últimas décadas, a obesidade tem se tornado um importante problema mundial de saúde pública, resultando no aumento da prevalência de doenças crônicas, geralmente associadas à obesidade, como a doença coronariana e o diabetes Mellitus do Tipo 2. Muitos estudos são desenvolvidos na tentativa de elaborar intervenções que possam bloquear ou minimizar as doenças metabólicas induzidas pela obesidade, em especial o diabetes Tipo 2. A restrição calórica (RC) reduz a adiposidade e melhora o metabolismo em pacientes com um ou mais sintomas da síndrome metabólica. No entanto, ainda não se sabe se os benefícios da RC em humanos são mediados pela restrição de calorias ou nutrientes. Este estudo foi realizado para identificar se a dieta isocalórica com restrição de proteína (RP) é capaz de conferir os efeitos benéficos da RC em pacientes com síndrome metabólica. Submetemos 21 indivíduos com diagnóstico de síndrome metabólica a restrição calórica de curto prazo (ou seja, 27 dias) (RC; n = 11) ou a dieta isocalórica com restrição de proteínas (RP; n = 10) e comparamos os resultados metabólicos e moleculares das intervenções. Assim como a RC, a RP promoveu perda de peso devido à redução da adiposidade e redução da glicemia, dos níveis lipídicos e da pressão arterial nesses indivíduos. Observamos redução na resistência insulínica, pelo aumento de 62,3% e 93,1% na taxa de infusão de glicose durante o clamp euglicêmico hiperinsulinêmico e redução de 61,1% e 56,6% no HOMA-IR, para RC e RP respectivamente. As assinaturas de expressão gênica no tecido adiposo subcutâneo (SAT) foram significativamente modificadas nas amostras de indivíduos dos grupos RC e RP. Observamos um aumento de expressão de mRNA principalmente em genes relacionados à função metabólica de adipócitos (Adipoq) e presença de nutrientes (AMPK, GCN2 e SIRT1). Não encontramos mudanças significativas na composição do microbioma intestinal após RP, embora 12 espécies, principalmente Firmicutes, tenham mudado consideravelmente. Nossos dados sugerem que a redução na ingestão de proteínas com um leve aumento na ingestão de carboidratos para manter o equilíbrio isocalórico da dieta é suficiente para melhorar o controle metabólico. A característica isocalórica da intervenção de RP torna essa abordagem uma estratégia dietética mais atrativa e menos drástica em ambientes clínicos e tem maior potencial para ser usada como terapia adjuvante no tratamento da síndrome metabólica. In recent decades, obesity has become an important public health problem worldwide, resulting in the increased prevalence of chronic diseases, generally associated with obesity, such as coronary heart disease and Type 2 diabetes mellitus. Many studies are carried out in an attempt to design interventions that can block or minimize obesity-induced metabolic diseases, especially Type 2 diabetes. Caloric restriction (CR) reduces adiposity and improves metabolism in patients with one or more symptoms of the metabolic syndrome. However, it is not known whether the benefits of CR in humans are mediated by caloric or nutrient restriction. This study was carried out to identify whether the isocaloric diet with protein restriction (PR) is able to confer the beneficial effects of CR in patients with metabolic syndrome. We subjected 21 individuals diagnosed with metabolic syndrome to shortterm (ie, 27 days) caloric restriction (CR; n = 11) or isocaloric diet with protein restriction (PR; n = 10) and compared the metabolic and molecular results of the interventions. Like CR, PR promoted weight loss due to reduced adiposity and reduced blood glucose, lipid levels and blood pressure in these individuals. We observed a reduction in insulin resistance, by an increase of 62.3% and 93.1% in the glucose infusion rate during the hyperinsulinemic euglycemic clamp and a reduction of 61.1% and 56.6% in the HOMA-IR, for CR and PR respectively. Gene expression signatures in subcutaneous adipose tissue (SAT) were significantly modified in samples from individuals in the CR and PR groups. We observed an increase in mRNA expression mainly in genes related to adipocyte metabolic function (Adipoq) and presence of nutrients (AMPK, GCN2 and SIRT1). We did not find significant changes in the composition of the gut microbiome after PR, although 12 species, mainly Firmicutes, changed considerably. Our data suggest that reducing protein intake with a slight increase in carbohydrate intake to maintain dietary isocaloric balance is sufficient to improve metabolic control. The isocaloric characteristic of the PR intervention makes this approach a more attractive and less drastic dietary strategy in clinical settings and has greater potential to be used as an adjunctive therapy in the treatment of metabolic syndrome.

A leptina é um hormônio essencial para o controle do balanço energético em adultos, por meio de sua ação em populações específicas de neurônios que expressam o receptor de leptina (Lepr). Atualmente, a obesidade e o sobrepeso constituem a quinta causa de morte no mundo, e no Brasil, pela primeira vez, mais da metade da população tem sobrepeso ou obesidade. A maioria dos obesos apresenta resistência à ação da leptina. Porém, alguns estudos sugerem que no período neonatal e infância a leptina possui funções fisiológicas distintas das observadas em adultos, relacionadas com o desenvolvimento neuronal. Por exemplo, peso excessivo no nascimento ou obesidade infantil está relacionado com alta incidência futura de doenças metabólicas. Nesses casos, é possível que a função da leptina durante o desenvolvimento esteja alterada, representando um dos possíveis mecanismos do chamado fetal programming. O objetivo desse estudo é compreender melhor as funções da leptina durante o desenvolvimento e as consequências no adulto da sua ausência neste período. Geramos e validamos camundongos geneticamente modificados com o sistema Cre-LoxP induzível por tamoxifeno. Para tanto, utilizamos camundongos Ubiquitina-C-CreERT2 que apresentam atividade da enzima Cre Recombinase em todas as células do corpo mediante o tratamento com tamoxifeno. Este camundongo foi acasalado com outro que apresenta um bloqueador de transcrição, flanqueado por sítios LoxP, downstream o gene Lepr. O resultado desse cruzamento é um animal deficiente do Lepr (LepRNull), porém até ser tratado com tamoxifeno. Animais adultos tratados com tamoxifeno recuperaram algumas funções fisiológicas em comparação com os controles magros, mas outras permaneceram total ou parcialmente alteradas. No balanço energético, recuperaram o consumo alimentar e reverteram do fenótipo obeso, porém permaneceram mais pesados que os controles magros e com menor gasto energético basal e atividade locomotora voluntária. A adiposidade diminuiu significativamente, mas não foi completamente restaurada. Apresentaram melhor tolerância à glicose que os controles magros, menor sensibilidade à insulina e maior insulinemia. As projeções hipotalâmicas através das quais a leptina regula o metabolismo energético estão diminuídas no grupo LepRNull e foram completamente restauradas nos animais reativados, os quais também recuperaram a capacidade de responder agudamente à leptina. A falta de leptina no desenvolvimento levou os animais LepRNull a terem menor massa encefálica, sendo este parâmetro parcialmente revertido após a reativação. A reativação do Lepr antes do fenótipo de obesidade preveniu as alterações na homeostase glicêmica, porém os animais Ubi-LepRNull ainda tiveram menor gasto energético basal, menor massa encefálica e maior adiposidade. Esses resultados sugerem que a sinalização de leptina durante o crescimento de camundongos é fundamental para o desenvolvimento normal de parâmetros metabólicos e neurológicos, indicando que esses parâmetros podem estar sujeitos à programação metabólica. Leptin is an essential hormone for energy balance control in adults, through its action on specific neural populations that express its receptor (Lepr). Currently, obesity and overweight constitute the fifth cause of death worldwide and in Brazil, for the first time more than half of its population is overweight. A common feature in obese people is leptin resistance. However, some studies suggest that during neonatal and infancy periods leptin has physiological effects different than those observed in adults, related to neuronal development. For example, excessive weight at birth or childhood obesity is related to higher incidence of metabolic disorders in the future. In these cases, leptins functions in early life might be altered, representing a possible mechanism of fetal programming. The objective of this study is to better understand the functions of leptin during development as well as the long-term consequences of its absence in early life. For this, a LoxP-flanked transcription-blocking cassette was inserted in the Lepr gene to generate mice null for the Lepr. They were bred with animals expressing Cre-ERT2 fusion protein under the human ubiquitin C promoter sequence. Consequently, tamoxifen injections can induce Cre Recombinase activity and restore Lepr gene expression in adult or young Ubi-LepRNull mice. Adult mice treated with tamoxifen recover some physiological functions but others seem to partially recovered or not recovered at all. They recovered food intake and reversed the obese phenotype, but remained heavier, with lower energy expenditure and locomotor activity than lean controls. Adiposity and leptinemia were improved but not restored. Their glycemic control remained altered as well as the reproduction axis in females and males. Brain mass was reduced in obese mice and partially recovered after Lepr reactivation. Reactivation before weaning prevented the obese phenotype and restored glycemic control; however energy expenditure, leptinemia and brain mass remained altered. These results strongly suggest that leptin signaling in early life is fundamental for the development of metabolic and neurological parameters and that metabolic programming might influence those parameters.

A inflamação associada à obesidade é caracterizada por uma ativação crônica e de baixa intensidade do sistema imune. Diversos autores demonstraram mudanças em parâmetros inflamatórios após perda de peso. A cirurgia bariátrica é um método para tratar obesidade com alta eficiência e menor risco de recidiva. Os mononucleares de sangue periférico (MNSP) constituem um material biológico interessante para pesquisa, visto a capacidade de refletir alterações de expressão gênica de diferentes tecidos e o fácil acesso para análise. O presente estudo teve por objetivo avaliar os efeitos da obesidade e da perda de peso induzida por cirurgia bariátrica sobre a atividade imunológica, por meio de cultura primária de MNSP de pacientes com obesidade grau III (IMC >= 40 kg/m2). Foram coletadas amostras de sangue de veia periférica de 10 voluntários com peso normal (grupo controle) e antes e após a cirurgia de 20 voluntários com obesidade grau III. Após a separação dos mononucleares pelo gradiente de Ficoll-HyPaque, as células foram estimuladas por lipopolissacarídeo (LPS) ou concanavalina A (Con-A) e os sobrenadantes das culturas coletados para dosagem de IL-1?, IL-6, TNF-?, IFN-?, IL-10 e IL-17 por teste ELISA. As amostras de sangue também foram utilizadas para exames bioquímicos, dosagens de adiponectina, leptina e citocinas séricas. Os resultados evidenciaram maiores concentrações de IL-6, TNF-?, IL-1? e IL-10 nos sobrenadantes das culturas de MNSP do grupo com obesidade em relação ao grupo controle. Na comparação entre dosagens de citocinas do grupo com obesidade, observamos redução de TNF-?, IL-1? e IL-10 após 6 meses da cirurgia, a qual não foi observada após 1 ano, e aumento de IL-17 após 1 ano de tratamento. Não houve diferença significativa nas concentrações de citocinas séricas na comparação entre os grupos com obesidade e controle ou pré e pós-operatório. Observamos correlações das citocinas de sobrenadante das culturas de MNSP e séricas com resultados laboratoriais relacionados à homeostase glicêmica em pacientes com obesidade antes e após a cirurgia bariátrica, além da correlação entre citocinas do sobrenadante e o estado de adiposidade no pós-operatório. Concluímos que a obesidade grau III está associada a modificações da produção de citocinas por MNSP e a perda de peso induzida por cirurgia bariátrica influencia esta produção no primeiro ano de tratamento. The obesity-associated inflammation is characterized by a chronic and low intensity activation of the immune system. Several authors have shown changes in inflammatory parameters after weight loss. Bariatric surgery is a method for treating obesity with high efficiency and less risk of recurrence. Peripheral blood mononuclear cells (PBMC) are an interesting biological material for research, due to the ability to reflect changes in gene expression in different tissues and easy access to analysis. This study aimed to evaluate the effects of obesity and weight loss induced by bariatric surgery on immune activity through PBMC culture of morbidly obese patients (BMI >= 40 kg/m2). Peripheral vein blood samples were collected from 10 volunteers with normal weight (control group) and before and after the surgery in 20 volunteers with morbid obesity. After separation of the mononuclear cells by Ficoll-Hypaque gradient centrifugation, cells were stimulated with lipopolysaccharide (LPS) and concanavalin A (Con-A) and culture supernatants collected for IL-1?, IL-6, TNF-?, IFN-?, IL-10 and IL-17 dosage by ELISA. Blood samples were also used for biochemical examinations and adiponectin, leptin and serum cytokine dosage. The results showed higher concentrations of IL-6, TNF-?, IL-1? and IL-10 in the supernatants of the MNSP cultures of the obesity group in relation to the control group. In the comparison between cytokine dosages of the obesity group, we observed reduction of TNF-?, IL-1? and IL-10 after 6 months of surgery, which was not observed after 1 year, and IL-17 increased after 1 year of treatment. There was no significant difference in serum cytokine concentrations in the comparison between obesity and control groups or operated group. We observed correlations of cytokines obtained in PBMC culture supernatant and serum with laboratory results related to glucose homeostasis in patients with obesity before and after bariatric surgery, as well as correlation between cytokines of the supernatant and the state of adiposity postoperatively. We conclude that morbid obesity is associated with changes in cytokine production by PMNC and weight loss induced by bariatric surgery influences cytokine production in the first year of treatment.

Os ritmos biológicos circadianos garantem a relação temporal entre os seres e o ambiente. A regulação metabólica se relaciona à ritmicidade dos ciclos de claro-escuro, com importância das ações da melatonina e dos glicocorticoides no fígado. Investigamos a participação dos glicocorticoides no ajuste metabólico mediado pela secreção rítmica de melatonina e no contexto inflamatório hepático. Ratos Wistar machos pinealectomizados tratados ou não com RU 486 tiveram o padrão circadiano circulante de corticosterona, insulina e glicose aferido ao longo de 8ZTs e no ZT10. Neste ponto, analisou-se a expressão de RNAm e protéica envolvidas em ações metabólicas e inflamatórias. Testes in vivo de tolerância à glicose e ao piruvato e a fosforilação da Akt hepática no ZT10 em resposta à insulina, em conjunto às alterações de peso e composição corpórea, conteúdo de glicogênio e histologia do fígado, apontam maior influência da corticosterona na gliconeogênese e correlação de ambos os hormônios nas alterações energéticas e na instalação de um quadro pró-inflamatório hepático. Circadian biological rhythms guarantee the temporal relationship between living beings and the environment. Metabolic regulation relates to the rhythm to the light-dark cycle, with importance of the actions of melatonin and glucocorticoids in the liver. We investigated the participation of glucocorticoids in the metabolic adjustment mediated by rhythmic secretion of melatonin on the liver inflammatory context. Male Wistar rats pinealectomized treated or not with RU 486 had the circadian levels of circulating corticosterone, insulin and glucose measured along 8ZTs and on ZT10. At this point, we analyzed mRNA and protein expression related to metabolic and inflammatory actions. In vivo tests to glucose and pyruvate tolerance and rating the phosphorylation of Akt in response to insulin in liver at ZT10, with the changes in weight and body composition, glycogen content and liver histology, indicate influence of corticosterone in gluconeogenesis and correlation of both hormones in energy alterations and on the installation of a hepatic pro-inflammatory process.

A atividade do complexo 1 da proteína alvo mecanístico da rapamicina (mTORC1), importante regulador da adiposidade e do metabolismo de lipídeos, está aumentada no tecido adiposo de camundongos obesos. A inibição completa de mTORC1 reduz a adiposidade, enquanto que sua inibição parcial potencializa a obesidade induzida por dieta. Assim, hipotetizamos que um nível ótimo de ativação de mTORC1 é necessário para promover aumento da adiposidade, de forma que sua superativação é tão inibitória para a deposição de gordura quanto sua inibição completa. Para testar esta hipótese, investigamos os efeitos da ativação constitutiva de mTORC1, induzida pela deleção de Tsc1, especificamente em adipócitos na adiposidade in vivo. A deleção de Tsc1 reduziu a massa do tecido adiposo visceral, mas não do subcutâneo, que foi associado ao aumento da lipólise e browning. Além disso, aumentou em ambos tecidos adiposos a massa e atividade oxidativa mitocondrial. Esses dados apoiam nossa hipótese de que é necessário um nível ótimo de ativação de mTORC1 para promover aumento da adiposidade. The activity of mechanistic target of rapamycin complex 1 (mTORC1), an important regulator of adiposity and lipid metabolism, is increased in adipose tissue of obese mice. Complete mTORC1 inhibition reduces adiposity, whereas partial mTORC1 inhibition enhances diet-induced obesity. Therefore, we hypothesized that an optimal level of mTORC1 activity is required to increase adiposity, in such a manner that mTORC1 overactivation is as inhibitory to fat deposition as its complete inhibition. To test this hypothesis, we investigated the effects of constitutive mTORC1 activation, induced by Tsc1 deletion, specifically in adipocytes on adiposity in vivo. Tsc1 deletion reduced visceral, but not subcutaneous, fat mass, which was associated with increased lipolysis and browning. Moreover, it enhanced mitochondrial mass and oxidative activity in both visceral and subcutaneous fat. These data support our hypothesis that an optimal level of mTORC1 activation is necessary to increase adiposity.

A diabetes tipo 1 (DT1) está associada `a inflamação estéril (IE) e maior susceptibilidade a sepse. A sepse induz a síndrome da resposta inflamatória sistêmica (SIRS) e a inflamação pulmonar aguda (ALI). O leucotrieno (LT) B4 produzido condições inflamatórias induz a expressão de MyD88 em macrófagos (MA). Hipotetizamos que a DT1 induz a síntese de LTB4 promovendo a IE e isto contribui para SIRS, susceptibilidade a sepse e ALI. Os diabéticos apresentaram níveis elevados de LTB4 e IL-1b no soro e seu MA expressaram mais MyD88/STAT-1. A expressão de STAT-1 foi induzida por c-Jun de forma dependente de LTB4. O tratamento com insulina restaurou os níveis de LTB4 e STAT-1/MyD88 e a inibição de LTB4 restaurou os níveis de MyD88 e IL-1b. Na sepse, a inibição de 5LO prolongou a sobrevida dos diabéticos e diminuiu a SIRS menos IL-1b e IL-10 no soro e TNF-a e IL-1b na cavidade peritoneal. O pulmão dos diabéticos apresentaram ALI menos intensa que se correlacionou com um altos níveis de SOCS-1, baixos níveis de MyD88 e falha na ativação de NFkB nos macrófagos alveolares. Type 1 diabetes (T1D) is associated with sterile inflammation (SI) and increased sepsis susceptibility. Sepsis induces Systemic Inflammatory Response Syndrome (SIRS) and Acute Lung Injury (ALI). Leukotriene (LT) B4 is produced in inflammatory conditions and induces MyD88 expression in macrophages (MA). We hypothesized that T1D induce LB4 that promotes SI contributing to SIRS, sepsis susceptibility and ALI. Diabetics presented higher levels of LTB4 and e IL-1b in the serum and MA expressed more MyD88/STAT-1. STAT-1 expression was induced by c-Jun on LTB4 dependent manner. Insulin treatment restored LTB4 and STAT-1/MyD88 levels and inhibition of LTB4 restored MyD88 and IL-1b levels. During sepsis, 5LO inhibition increased diabetics survival and inhibited SIRS- lower levels of IL-1b and IL-10 in the serum and TNF-a and IL-1b in the peritoneal cavity. Lungs from diabetics presented milder ALI that correlated with high levels of SOCS-1, low levels of MyD88 and impaired NFkB activation in alveolar macrophages.

A influência da obesidade induzida por glutamato monossódico em ratos sobre o desenvolvimento do tumor de Walker-256 e os efeitos da metformina (300mg/kg, v.o., 15 dias) foram investigados. Na 16ª semana de vida, inocularam-se as células tumorais e iniciou-se o tratamento. Após 15 dias, analisou-se o crescimento tumoral. A viabilidade de células tumorais, MCF-7, tratadas com meformina foi avaliada. A obesidade contribuiu para maior desenvolvimento tumoral e reduziu a sobrevida dos ratos. A metformina foi eficaz em impedir o aumento do tumor e aumentou a sobrevida dos ratos. Teve efeito antiproliferativo sobre as células MCF-7, efeito esse relacionado ao bloqueio do ciclo celular, estresse oxidativo, aumento na apoptose e necrose celulares, e aumento na atividade da AMPK e do FOXO3a. Conclui-se que a obesidade contribui de maneira significativa para o desenvolvimento tumoral e que a metformina é eficaz em diminuí-lo. The influence of obesity induced by monossodium glutamate in rats on Walker-256 tumor development and the metformin (300/kg, b.w., 15 days) effect were analyzed. At the 16th week, 1x107 Walker-256 tumor cells were inoculated and the treatment with metformin was started. Following this treatment, the tumor growth was analyzed. The cell viability of MCF-7 cells treated with metformin was analyzed. Obesity positively contributed for tumor development and it reduced life span of the rats. Metformin reduced the tumor development and increased the life span of the rats. It presented an antiproliferative effect in MCF-7 cells. Effect associated with an increase in oxidative stress, apoptosis, necrosis and cell cycle arrest in G0-G1 phase. Furthermore, its effect is associated with an increased in AMPK and FOXO3a activities. In conclusion, obesity contributed significantly to tumor development and metformin is effective in reduced it.

O transplante de ilhotas microencapsuladas constitui uma alternativa terapêutica interessante para o Diabetes Mellitus tipo 1, permitindo um melhor controle glicêmico e eliminando a necessidade de imunossupressão. Entretanto, a manutenção a longo prazo da viabilidade das células-β ainda é um desafio. No isolamento, a perda da matriz extracelular e as condições hipóxicas subsequentes afetam decisivamente a sobrevivência e funcionalidade das ilhotas. Objetivo Para diminuir o estresse sobre o enxerto, levando a um sucesso prolongado do transplante, propôs-se a adição de perfluorocarbono (PFC) ou laminina (LN), moléculas associadas respectivamente à oxigenação e interações célula-célula, ao biomaterial baseado em alginato, Biodritina, adequado ao encapsulamento celular. Metodologia Para testar a estabilidade das formulações PFC-Biodritina e LN-Biodritina, microcápsulas foram submetidas a diferentes estresses (rotacional, osmótico, temperatura e cultura) por 7 e 30 dias. A pureza do biomaterial foi avaliada pela coincubação com macrófagos murinos RAW264.7, por 3, 9 e 24h, quando a ativação dos macrófagos foi observada pela expressão gênica de IL- 1β e TNFα. Microcápsulas implantadas i.p. em camundongos foram recuperadas após 7 ou 30 dias, para análises de biocompatibilidade. A expressão de níveis de mRNA (bax, bad, bcl-2, bcl-XL, xiap, caspase 3, mcp1/ccl2, hsp70, ldh, insulina 1 e 2), proteínas (Bax, Bcl-XL e Xiap) e a atividade de Caspase3 foram avaliadas em ilhotas microencapsuladas com PFC- e LN-Biodritina, após cultura de 48h em condições de normóxia e hipóxia (

Não é claro como o receptor de glicocorticóide (GR) contrarregula a atividade do STAT5 na transição da gestação para a lactação. Dexras1 é uma pequena proteína G ativada por dexametasona (DEX), que regula morfologia celular, crescimento, etc. Neste estudo detectamos a expressão de Dexras1 em células beta de ilhotas pancreáticas. DEX induz a expressão de Dexras1 em células RINm5F, que está aumentada na gestação e diminuída na lactação. A expressão protéica de 11&#946HSD1, enzima ativadora de glicocorticóides (GCs), segue esse perfil. A ligação tanto do GR como do STAT5, analisada por ChIP assay, ao promotor do gene da Dexras1 aumentada por DEX é revertida por prolactina (PRL), e está diminuída e aumentada na gestação e lactação, respectivamente. DEX induz a associação ao GR, fosforilação e translocação nuclear do STAT5b. O silenciamento gênico de Dexras1 promoveu aumento da secreção de insulina, e aumentou os níveis de pERK1/2, pCREB, pPKC&#948 e PKA. Sendo assim, a regulação de Dexras1 por PRL e GCs contribui para a secreção de insulina característica do periparto. It is not clear how glucocorticoid receptor (GR) counteracts STAT5 activity during the transition of pregnancy to lactation. Dexras1 is a small G protein activated by dexamethasone (DEX) that controls cell morphology, growth, etc. In the present study we detected Dexras1 expression in pancreatic beta cell. DEX induces Dexras1 expression in RINm5F cells, which is increased in pregnancy and decreased in lactation. The expression of 11&#946HSD1, the glucocorticoids (GCs) activating enzyme, followed Dexras1 profile in pancreatic islet. Both GR and STAT5b bindings to Dexras1 gene promoter, analyzed by ChIP assay, are increased by DEX and PRL counteracts this effect. Both bindings are decreased in pregnancy and increased in lactation. DEX induces STAT5b association to GR, phosphorylation and nuclear translocation. Dexras1 knockdown using small interference RNA (si-RNA) promoted an increase in insulin secretion, as well as increased levels of pERK1/2, pCREB, pPKC&#948 and PKA. Thus, Dexras1 regulation by PRL and GCs contributes to insulin secretion during peripartum.

Na gravidez, o aumento da resistência à insulina é compensado por alterações morfo-funcionais na ilhota pancreática, como o aumento da proliferação e da secreção de insulina. Após o parto ocorre retorno do pâncreas às condições basais e aumento simultâneo da sensibilidade periférica à insulina. Neste trabalho estudamos os mecanismos moleculares responsáveis pelo remodelamento da ilhota no período perinatal. Os resultados mostram que a fosforilação em serina do STAT3 regula a expressão de SERCA2 e assim, modula a primeira fase da secreção de insulina. A fosforilação do STAT3 é dependente da ativação da ERK1/2. No início da lactação, ocorre redução da fosforilação das ERK1/2 devido ao aumento da expressão da fosfatase MKP1. A ação dos glicocorticóides é essencial para este fenômeno, e depende da expressão diferencial de 11b-HSD1 e 11b-HSD2. O aumento da sensibilidade periférica à insulina ocorre especificamente em músculos oxidativos no início da lactação, e depende do aumento da expressão de Glut4, IR, da via IRS2-PI3K-AKT e da diminuição da PTP1B. During pregnancy, the increase in insulin resistance is compensated by morfofunctional adaptations of the pancreatic islets, as seen by an increase in cell proliferation and insulin secretion. After delivery, the endocrine pancreas returns to basal conditions, simultaneously to an increase in peripheral insulin sensitivity. In this work we studied the molecular mechanisms involved in islets remodeling during the peripartum period. Our results show that STAT3 serine phosphorylation regulates SERCA2 expression, thus modulating first phase of insulin secretion. STAT3 serine phosphorylation is dependent on ERK1/2 activation. At the beginning of lactation, ERK1/2 phosphorylation is downregulated by the overexpression of the phosphatase MKP1. The action of glucocorticoids is essential in this mechanism, which depends on the differential expression of 11b-HSD1 and 11b-HSD2. The increase in peripheral insulin sensitivity occurs specifically on oxidative skeletal muscles, which involves an increase in Glut4 and IR expression, IRS2-PI3K-AKT pathway, and a decrease in PTP1B.

As dietas intermitentes (IF) compreendem ciclos alternados de 24 horas de jejum e alimentação. Como os efeitos de IF sobre o balanço redox não são bem conhecidos, esse trabalho teve por objetivo avaliar os efeitos desta dieta sobre o estado redox de diferentes tecidos de ratos. Após um mês de tratamento, os fígados dos ratos em IF apresentaram um aumento de capacidade respiratória mitocondrial juntamente com níveis elevados de proteínas carboniladas. Verificou-se ainda um aumento em danos oxidativos no cérebro destes animais. IF promoveu significativa proteção contra danos oxidativos no coração, enquanto que não houve alterações no estado redox do músculo esquelético. Os efeitos metabólicos de IF também foram investigados com o intuito de compreender os mecanismos envolvidos com o menor peso e a hiperfagia promovidos por esta intervenção. Observou-se que o menor peso dos ratos submetidos à IF é consequência de um aumento em taxas metabólicas em dias de alimentação somado à oxidação lipídica aumentada durante o jejum. A hiperfagia, por sua vez, é consequencia de elevação nos níveis de neurotransmissores orexigênicos hipotalâmicos, mesmo quando estes animais estão alimentados. Os níveis do neutransmissor TRH também foram modulados por esta dieta, o que pode estar relacionado com as alterações de taxas metabólicas observadas no modelo. Concluímos, portanto, que as dietas intermitentes promovem modificações funcionais no hipotálamo que estão associadas com diferenças no peso corpóreo e no apetite. Além disso, IF afeta o balanço redox de forma tecido específica, levando a um desbalanço oxidativo no fígado e no cérebro e à proteção contra danos oxidativos no coração. Intermittent fasting (IF) is a dietary intervention that comprises 24 hour cycles alternating ad libitum feeding and fasting. We address here the effects of IF on redox state in different tissues, which are still poorly understood. After one month on the diet, IF rats livers presented increased mitochondrial respiratory capacity along with increased levels of protein carbonyls. Surprisingly, IF animals also presented an increase in oxidative damage in the brain. Conversely, IF promoted a substantial protection against oxidative damage in the heart. No difference in redox homeostasis was observed in the skeletal muscle. We also assessed metabolic effects of IF to uncover the mechanisms involved in the lower body mass and loss of feeding control in IF rats. As measured calorimetrically, IF animals presented high metabolic rates during feeding days and increased lipid oxidation on fasting days, which explains the lower body weight. IF-induced overeating was a consequence of increased expression of hypothalamic orexigenic neurotransmitters, even on feeding days. THR levels also were changed, in parallel with the feeding-dependent alterations on metabolic rates. Overall, we find that intermittent fasting promotes functional hypothalamic alterations associated with differences in body weight and appetite. In addition, IF affects redox balance in a tissue-specific manner, leading to redox imbalance in the liver and brain, as well as protection against oxidative damage in the heart

Chronic low-grade endotoxemia is an important player in obesity and insulin resistance associated to a high-fat diet (HFD). On the other hand, although it is known that intense endotoxemia and infection reduce appetite and induce intense catabolism, leading to weight loss during the acute inflammatory phase, the late effects of an intense endotoxemia were previously unexplored. Here we report that, besides the concurrent effects, multiple and intense endotoxemia causes long lasting biochemical alterations in the adipose tissue that intensify the harmful effects of a HFD. Mice submitted to multiple and severe endotoxemia had increased the adipose tissue expression of TLR-4, CD14 and SAA3, remaining altered after one week in recovery. When associated to a HFD, mice previously submitted to acute endotoxemia showed a more severe weight gain and impaired insulin sensitivity. Adopting the HFD as an obesogenic stimulus, we evaluated the participation of the protein serum amyloid A (SAA) in obesity development. Using a SAA-targeted antisense oligonucleotide, we observed that the depletion of SAA prevented metabolic alterations, endotoxin elevation, weight gain and insulin resistance in a diet-induced obesity protocol. Inadequate sleep is another important factor to be considered in the obesity epidemic. We found that sleep restriction (SR) causes biochemical and morphological alterations in mice adipose tissue. The levels of serum resistin and the adipose tissue mRNA expression of resistin, TNF-α and IL-6 were increased after SR. When associated to a HFD, mice previously submitted to SR gained more weight with increased macrophage infiltration in the epididymal adipose tissue, and insulin resistance. SAA is also part of the initial biochemical alterations caused by SR. It was observed that the expression of SAA in liver and adipose tissue is upregulated, with return to baseline when sleep is restored. Furthermore, 48 hours of total sleep restriction in healthy human volunteers also caused a serum elevation in SAA concentrations. Considering that SAA induces cell proliferation, we suggest that situations with an increase in SAA production and the consecutive preadipocyte proliferation would prime the adipose tissue to further adipocyte differentiation and hypertrophy. Furthermore, we suggest that SAA alter LPS signaling, possibly inhibiting its clearance. The mechanism associating inflammation and obesity is complex and encompass a diversity of factors; the inflammatory protein SAA may be one of them. In conclusion, our data describes the relationship between SAA, acute inflammation, sleep restriction and obesity. Endotoxemia crônica de baixo grau tem um importante papel na obesidade e resistência à insulina associada a uma ração hiperlipídica. Por outro lado, embora se saiba que a endotoxemia intensa e infecção reduzam o apetite e induzam a um intenso catabolismo, conduzindo a perda de peso durante a fase aguda da inflamação, os efeitos tardios da endotoxemia intensa nunca foram explorados. Aqui mostramos que, além dos efeitos correntes, a endotoxemia aguda provoca alterações bioquímicas prolongadas no tecido adiposo que intensificam os efeitos deletérios de uma ração hiperlipídica. Camundongos submetidos à endotoxemia aguda apresentaram aumento na expressão de TLR-4, CD14 e SAA3 no tecido adiposo, permanecendo alteradas após uma semana em recuperação. Quando associado a uma ração hiperlipídica, os camundongos previamente submetidos à endotoxemia aguda mostraram um ganho de peso mais pronunciado e uma maior resistência à insulina. Adotando a ração hiperlipídica como um estímulo obesogênico, foi avaliada a participação da proteína amilóide sérica A (SAA) no desenvolvimento da obesidade. Usando um oligonucleotídeo antisense anti-SAA, observamos que a depleção da SAA previne as alterações metabólicas, elevação de endotoxina, ganho de peso e resistência à insulina associadas a ração rica em gordura. O sono inadequado é outro fator importante a ser considerado na epidemia de obesidade. Descobrimos que a restrição do sono (SR) provoca alterações bioquímicas e morfológicas no tecido adiposo de camundongos. A concentração de resistina no soro e a expressão de mRNA no tecido adiposo de resistina, TNF-α e IL- 6 foram aumentadas após SR. Quando associado a uma ração hiperlipídica, os camundongos submetidos previamente à SR ganharam mais massa com aumento da infiltração de macrófagos no tecido adiposo epididimal, e resistência à insulina. SAA também faz parte das alterações bioquímicas iniciais provocadas pelo SR. Observou-se que a expressão de SAA no fígado e tecido adiposo é regulada positivamente, com retorno ao basal quando o sono é restaurado. Além disso, 48 horas de restrição de sono total em voluntários humanos saudáveis também causou uma elevação nas concentrações séricas de SAA. Considerando que SAA induz proliferação, sugerimos que situações onde ocorra aumento na produção de SAA e a consecutiva proliferação celular, o tecido adiposo se tornaria predisposto a futura diferenciação e hipertrofia. Além disso, sugerimos que SAA altera a sinalização de LPS, possivelmente inibindo sua depuração. O mecanismo de associação entre a inflamação e a obesidade é complexo e inclui uma diversidade de fatores; a proteína inflamatória SAA pode ser um deles. Em conclusão, nossos dados descrevem a relação entre SAA, inflamação aguda, restrição do sono e obesidade.

Avaliamos o efeito da RCIU induzida por glicocorticoides sobre a regulação da expressão de miRNAs no fígado de ratos albinos. Animais expostos intrauterinamente à dexametasona apresentaram menor peso ao nascer, fígados relativamente menores dos que os observados em animais controle e menores concentrações hepáticas de PCNA. Em longo prazo, os animais DEX desenvolveram distúrbios metabólicos caracterizados por intolerância à glicose e maior potencial gliconeogênico no desmame e na vida adulta. Ao avaliarmos o perfil de miRNAs no fígado, detectamos aumento da expressão de todo o cluster do miR-322 no período perinatal, com menor conteúdo de alvos preditos desses transcritos (AKT3, CCND1 e INSR). A superexposição ao miR-322-5P reduz a taxa de proliferação em linhagens celulares de hepatocarcinoma e a expressão dos alvos observados no fígado dos animais estudados. Propomos um link entre a expressão aberrante do miR-322-5P e a reduzida taxa de proliferação detectada no tecido hepático em desenvolvimento, contribuindo para o estabelecimento do fenótipo em longo prazo. We evaluated the effects of glucocorticoid induced IUGR on the expression of miRNA on Wistar rat livers. Dexamethasone (DEX) treated animals were lighter and had smaller liver weight:body weight ratio when compared to control animals. Furthermore, liver PCNA expression was downregulated, sugesting a reduction on cell proliferation rate. In the long term, DEX animals developed metabolic disturbances such as glucose intolerance e increased gluconeogenesis rate in a fast state. The analysis of miRNA expression profile showed an upregulation of miR-322 cluster on perinatal period, together with a downregulation of three putative targets: Akt3, CCND1 and INSR. Later, we used in vitro studies to prove that overexpression of miR-322-5P arrests cell cycle and impairs proliferation of HEPG2 cells as well as it downregulates the predicted targets. Based on this data, we suggest a link between overexpression of miR-322-5P and impaired proliferation rate on the developing liver, which affects the phenotype in the long term.

Fontes alternativas de células β têm sido estudadas para o tratamento de Diabetes mellitus tipo 1, dentre as quais a mais promissora consiste das células-tronco diferenciadas em células produtoras de insulina (IPCs). Alguns trabalhos demonstram a capacidade de células-tronco embrionárias murinas (mESCs) de formarem estruturas semelhantes a ilhotas pancreáticas, porém, os níveis de produção de insulina são insuficientes para a reversão do diabetes em camundongos diabetizados. Este trabalho visa desenvolver um protocolo adequado para geração de IPCs e contribuir para a identificação e caracterização funcional de novos genes associados à organogênese pancreática. Logo no início da diferenciação das mESCs em IPCs, foi possível verificar o surgimento de células progenitoras, evidenciado pela expressão de marcadores importantes da diferenciação beta-pancreática. Ao final do processo de diferenciação in vitro, ocorreu a formação de agrupamentos (clusters) semelhantes a ilhotas, corando positivamente por ditizona, que é específica para células β-pancreáticas. Para avaliar seu potencial in vivo, estes clusters foram microencapsulados em Biodritina® e transplantados em camundongos diabetizados. Apesar dos níveis de insulina produzidos não serem suficientes para estabelecer a normoglicemia, os animais tratados com IPCs apresentaram melhores condições, quando comparados ao grupo controle, tendo melhor controle glicêmico, ganho de massa corpórea e melhor aparência da pelagem, na ausência de apatia. Além disso, análise dos clusters transplantados nestes animais indicou aumento da expressão de genes relacionados à maturação das células β. Porém, quando estes clusters foram microencapsuladas em Bioprotect® e submetidos à maturação in vivo em animais normais, ocorreu um aumento drástico na expressão de todos os genes analisados, indicando sua maturação completa em células beta. O transplante destas células completamente maturadas em animais diabetizados, tornou-os normoglicêmicos e capazes de responder ao teste de tolerância à glicose (OGTT) de forma semelhante aos animais normais. A segunda parte do trabalho visou analisar genes diferencialmente expressos identificados em estudo anterior do nosso grupo, comparando, através de DNA microarray, mESCs indiferenciadas e diferenciadas em IPCs. Um dos genes diferencialmente expressos é aquele que codifica para a Purkinge cell protein 4 (Pcp4), sendo 3.700 vezes mais expresso em IPCs. Para investigar o possível papel do gene Pcp4 em células β e no processo de diferenciação β-pancreática, adotou-se o enfoque de genômica funcional, superexpressando e inibindo sua expressão em células MIN-6 e mESCs. Apesar da alteração na expressão de Pcp4 em células MIN-6 não ter interferido de forma expressiva na expressão dos genes analisados, quando inibido, modificou o perfil da curva de crescimento celular, aumentando seu tempo de dobramento de forma significativa e diminuindo da viabilidade celular em ensaios de indução de apoptose. Já na diferenciação de mESCs em IPCs, a superexpressão de Pcp4 interferiu de forma positiva apresentando uma tendência a aumentar a expressão dos genes relacionado à diferenciaçãoβ-pancreática. Concluindo, desenvolvemos um novo protocolo de diferenciação de mESCs em IPCs as quais foram capazes de reverter o diabetes em camundongos diabetizados e descrevemos, pela primeira vez, o gene Pcp4 como sendo expresso em células β-pancreáticas, podendo estar relacionado à manutenção da viabilidade celular e maturação destas células. New cellular sources for type 1 Diabetes mellitus treatment have been previously investigated, the most promising of which seems to be the insulin producing cells (IPCs), obtained by stem cells differentiation. Some reports show that murine embryonic stem cells (mESCs) are able to form islet-like structures, however, their insulin production is insufficient to render diabetic mice normoglycemic. This work aims at developing an adequate protocol for generation of IPCs and searching for new genes which could be involved in the pancreatic organogenesis process. Early on during mESCs differentiation into IPCs, we observed the presence of progenitor cells, which were able to express pancreatic β-cell markers. At the end of the differentiation process, the islet-like clusters positively stained for the insulin-specific dithizone. These clusters were microencapsulated in Biodritin® microcapsules, and then transplanted into diabetized mice. Although the levels of insulin production were insufficient for the animals to achieve normoglycemia, those which received IPCs displayed improved conditions, when compared to the control group, as judged by a better glycemic control, body weight gain and healthy fur appearance, in the absence of apathy. In addition, when these transplantated clusters were retrieved, high levels of expression of the genes related to β-cell maturation were detected. IPCs were also microencapsulated in Bioprotect® and subjected to in vivo maturation in normal animals. A dramatic increase of the analyzed genes expression was observed, indicating complete maturation of the differentiated cells. When these cells were transplanted into diabetized mice, these animals achieved normoglycemia and were able to display glucose tolerance test (OGTT) response very similar to that of normal mice. In the second part of this work, we analyzed upregulated genes described in previous work from our group, comparing undifferentiated mESCs to IPCs using a microarray platform. One of these genes is that coding for the Purkinje cell protein 4 (Pcp4), which is 3,700 more expressed than in undifferentiated mESC cells. We adopted a functional genomics approach to investigate the role played by the Pcp4 gene in β-cells and in β-cell differentiation, by inducing overexpression and knocking down this gene in MIN-6 and mESC cells. Although the differential expression of Pcp4 in MIN-6 was not able to interfere with the expression of the genes analyzed, we observed different cell growth rates, with increased doubling time and decreased cell viability when its expression was knocked down. In addition, overexpression of Pcp4 in mESCs subjected to differentiation into IPCs apparently increases the expression of genes related to β-cell differentiation. In conclusion, we developed a new protocol for ESCs differentiation into IPCs, which is able to revert diabetes in diabetized mice, and we also describe here, for the first time, the Pcp4 gene as being expressed in pancreatic β-cells and possibly being related to maintenance of cell viability and β-cell maturation.

Nosso objetivo foi verificar a participação do TLR4 na pressão arterial e reatividade vascular em ratos SHR. O TLR4 está mais expresso em artérias mesentéricas de resistência de SHR com 15 semanas do que em Wistar com 15 e SHR com 5 semanas. SHR e Wistar com 15 semanas foram tratados com anti-TLR4 (1mg/dia) ou IgG (controle) por 15 dias via i.p. A expressão do TLR4, MyD88, a fosforilação da P38 e NF-kB p65, e a secreção de IL-6 foi menor nos SHR anti-TLR4 do que nos SHR IgG. Os SHR tratados com anti-TLR4 apresentaram redução na pressão arterial versus SHR IgG. A resposta máxima ao KCl e à noradrenalina (NA) foram normalizadas após o uso do anti-TLR4 no SHR, por vias dependentes de COX-1, COX-2 e do NF-kB. O uso do L-NAME diminuiu a resposta contrátil à NA no SHR IgG sendo que o anti-TLR4 melhorou essa resposta em SHR. O anti-TLR4 aumentou a expressão da eNOS e preveniu a geração de espécies reativas de oxigênio em SHR. Sugerimos que o TLR4 está associado com o aumento da pressão arterial e com a disfunção vascular presente na hipertensão arterial. Our objective was to investigate the role of TLR4 in blood pressure and vascular reactivity in SHR. TLR4 is more expressed in mesenteric resistance arteries from SHR 15 week than in Wistar with 15 and SHR 5 weeks. Wistar and SHR with 15 weeks were treated with anti-TLR4 (1mg/dia) or IgG (control) for 15 days via ip. The expression of TLR4, MyD88, phosphorylation of p38 and NF-kB p65, and IL-6 secretion was lower in SHR TLR4 than in SHR IgG. SHR treated with anti-TLR4 had reduced blood pressure versus SHR IgG. The maximal response to KCl and noradrenaline (NA) were normalized after anti-TLR4 treatment in SHR by mechanisms dependent on COX-1, COX-2 and NF-kB. The use of L-NAME decreased the contractile response to NA in SHR IgG and anti-TLR4 improved this response in SHR. The anti-TLR4 increased eNOS expression and prevented the generation of reactive oxygen species in SHR. We suggest that the TLR4 is associated with increased blood pressure and vascular dysfunction in hypertension.

Durante a gravidez, o pâncreas endócrino materno sofre alterações morfológicas e funcionais que resultam no aumento da massa de células beta e da secreção de insulina. Nos estágios finais da gestação ocorre aumento dos níveis plasmáticos de glicocorticóides que resulta na diminuição da secreção e da proliferação das células beta. Este fenômeno, que ocorre no período compreendido entre o final da gravidez e o inicio da lactação, promove a reversão fisiológica da adaptação funcional que se fez necessária durante a gravidez. Assim, estudamos mecanismos moleculares envolvidos na redução de proliferação destas células. As proteínas cinases reguladas por sinais extracelulares (ERK) estão envolvidas no crescimento e sobrevida celular. Os resultados mostram que o glicocorticóide sintético, dexametasona, diminui a proliferação de células beta e, para isto, induz diminuição da fosforilação das ERK-1/2 por meio do aumento da expressão de uma fosfatase de MAPK (MKP-1). Este mecanismo deve estar envolvido no remodelamento pancreático pós-natal induzido pelos glicocorticóides. During pregnancy, maternal pancreatic islets undergo morphofunctional changes that increase beta cell mass and insulin secretion. At late stages of pregnancy there is an increase in plasma glucocorticoid levels that inhibit beta cell proliferation and beta cell function. This situation, which occurs in a period between late pregnancy and early stages of lactation, counteracts the functional gain established throughout pregnancy. In this work we studied the molecular mechanisms involved in the impaired beta cell proliferation. The extracellular regulated kinases (ERKs) are involved in cellular growth and survival. Our results show that dexametasone, a synthetic glucocorticoid, inhibits proliferation by a mechanism that includes up regulation of a dual specificity phosphatase (MKP1). This, by extension, impairs ERK1/2 activation. This mechanism could take part in the induced-glucocorticoid reestablishment of endocrine pancreatic mass after parturition.

Na gestação há aumento da proliferação e redução da apoptose das células b pancreáticas. Prolactina (PRL) desencadeia estas mudanças, que são revertidas após o parto mesmo na presença de PRL. In vitro, dexametasona (DEX) se contrapõe a PRL. Avaliamos se o estresse do retículo endoplasmático (ERE) está envolvido na apoptose do pós-parto e se os glicocorticóides (GC) participam deste mecanismo. A fragmentação do DNA aumenta no 3° dia pós-parto (L3), em paralelo com a diminuição de pAKT e aumento do TRB3, indutor da apoptose por ERE. BiP, ATF4, CHOP, e a ligação de CHOP e CHOP-ATF4 no promotor do TRB3 aumentam em L3. O inibidor do ERE PBA restaurou os níveis de pAKT e CHOP e inibiu a apoptose. Células RINm5F tratadas com DEX (24h) têm aumento de BiP e ATF4, de p-eIF2 e do XBP-1 ativo. DEX também induz TRB3, mas inibe a ligação de CHOP ao TRB3. O tratamento por 72h não altera p-eIF2a, diminui XBP-1 ativo e promove apoptose, único evento revertido pela PRL. Concluímos que a apoptose das ilhotas em L3 é desencadeada por ERE, mas os GC não induzem este mecanismo. During gestation occurs increase on the proliferation and apoptosis reduction of pancreatic b cells. Prolactin (PRL) promotes these changes which are reverted after delivery. Dexametasone (DEX) in vitro opposed to PRL. We evaluate whether endoplasmatic reticulum stress (ERS) was involved on post-delivery apoptosis and glycocorticoids (GC) participate on this mechanism. DNA fragmentation increased on the 3rd day post-delivery (L3), in parallel with pAKT diminution and inductor of apoptosis-TRB3 augment by ERS. BiP, ATF4, CHOP along with binding of CHOP and CHOP-ATF4 to the TRB3 promoter increased in L3. ERS inhibitor-PBA restored pAKT, CHOP levels and inhibited apoptosis. RINm5F cells with DEX (24h) showed increase in BiP, ATF4, p-eIF2 and in active XBP-1. DEX induced TRB3, but inhibited the binding of CHOP to TRB3. The 72h treatment did not alter p-eIF2a, diminished active XBP-1 and promoted apoptosis; the unique event reverted by PRL. We concluded that apoptosis of islets in L3 is generated by ERS; nevertheless this mechanism is not induced by GC.