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The invention consists of a new generation of self-assembling nanoparticles (NPs) able to deliver drugs into tumors. The efficacy of these NP has been demonstrated with zoledronic acid (ZOL), a powerful bisphosphonate today largely used in clinical practice to avoid bone resorption in different diseases (osteoporosis, Paget's disease and bone metastases). ZOL is very efficient in vitro to reduce cell growth on different cancer cells. However, any anticancer effect has been observed in vivo following administration of free ZOL, due to its accumulation into the bone (low ZOL levels in solid tumors).

Zoledronic acid (ZOL), a third generation aminobisphosphonate (A-BP), is a drug whose potent anticancer activity is limited by its short plasma half-life and rapid uptake and accumulation within bone. We have recently proposed new delivery systems to avoid ZOL accumulation into the bone, thus improving extra-skeletal bioavailability. In this work, we have developed selfassembly PEGylated nanoparticles (NPs) containing ZOL. ZOL-containing NPs showed good technological characteristics and the possibility to be prepared before use. These NPs showed a higher anti-cancer activity, evaluated in nude mice xenografted with prostate cancer PC3 cells, compared with that induced by free ZOL. In addition, NPs induced, in a significant number of animals, the complete remission of tumour xenografts and an increase of survival time.

L???acido zoledronico (ZOL), un aminobisfosfonato (ABF) di terza generazione, è a tutt???oggi il più potente inibitore del riassorbimento osseo per la sua capacità di inibire l???attività degli osteoclasti a concentrazioni nanomolari. E??? impiegato in clinica per il trattamento delle metastasi ossee ed in patologie come l???osteoporosi e il morbo di Paget. Numerosi studi pre-clinici hanno dimostrato un potente effetto pro-apoptotico di ZOL in numerose linee cellulari tumorali; ciò ne suggerisce un??? impiego come farmaco antitumorali vero e proprio. Tuttavia, la breve emivita plasmatica ed il rapido accumulo di ZOL nel tessuto osseo, impediscono il raggiungimento di livelli di farmaco efficaci in tumori localizzati al di fuori del compartimento osseo. Lo scopo del lavoro è stato lo sviluppo di nanosistemi che consentano l???impiego di ZOL nel trattamento di differenti tumori extra-ossei, riducendo l???accumulo del farmaco nel tessuto osseo ed aumentandone la concentrazione in tessuti periferici, ad es. in siti tumorali. In particolare, sono state sviluppate nanoparticelle (NP) auto-assemblanti PEGhilate composte da NP di calcio fosfato contenenti ZOL (CaPZ NP) ricoperte con liposomi. Brevemente, due soluzioni acquose, rispettivamente di CaCl2 e Na2HPO4, sono state mescolate sotto agitazione magnetica e la risultate dispersione è stata filtrata mediante filtri da 0,22 microm (CaP NP). La dispersione è stata poi mescolata con una soluzione acquosa di ZOL, ottenendo Ca2+/PO43- NP contenenti ZOL (CaPZ NP). In una seconda fase, CaPZ NP sono state mescolate con liposomi cationici PEGhilati per 10 min a temperatura ambiente, ottenendo le cosi denominate PLCaPZ NP. Le NP sono state caratterizzate al fine di valutarne le dimensioni e la distribuzione dimensionale, la morfologia e l???efficienza di complessazione di ZOL. E??? stata poi valutata l???attività in vitro e la citotossicità delle NP contenenti ZOL in diverse linee cellulari tumorali. Studi di proliferazione cellulare in presenza di ZOL sono stati determinati mediante il saggio MTT. L???attività antitumorale delle PLCaPZ NP è stata infine valutata in modelli animali di cancro. Sono state preparate PLCaPZ NP con un diametro medio di 147 nm ed un indice di polidispersità di 0,1. Dall???analisi morfologica, determinata mediante cFEG SEM, le particelle di PLCaPZ NP appaiono di forma sferica ed omogeneamente disperse. Il contenuto reale di ZOL, determinato mediante HPLC, è di 65 microg di ZOL/mg lipidi, corrispondente ad un???efficienza di complessazione di circa il 70%. In tutte le linee cellulari tumorali, le PLCaPZ NP potenziano l???inibizione della crescita cellulare rispetto a ZOL libero; il massimo effetto è stato osservato nella linea cellulare MCF7 di carcinoma mammario con fattore di potenziamento (PF) 12. In virtù delle ottime caratteristiche tecnologiche e dell???effetto di potenziamento dell???attività di ZOL in vitro, la formulazione sviluppata è stata testata in vivo. In particolare, in un modello di carcinoma prostatico, è stata osservata una significativa riduzione della crescita del tumore ed un??? aumento della sopravvivenza. Inoltre, una remissione completa del tumore è stata osservata in una percentuale significativa di animali. Nello stesso modello animale, non è stato rilevato alcun effetto significativo in seguito a trattamento con ZOL in soluzione. In conclusione, l???impiego delle nanotecnologie ha dimostrato un???attività antitumorale di ZOL in vivo. Le PLCaPZ NP presentano una distribuzione dimensionale omogenea, un???elevate efficienza di complessazione di ZOL e la possibilità di essere preparata facilmente prima dell???uso. A tali caratteristiche tecnologiche si associa una significativa riduzione della crescita tumorale osservata in un modello animale di adenocarcinoma prostatico.

Introduction: The trans-resveratrol (t-res) is a non flavonoid polyphenol with promising properties for the treatment or prevention of different diseases. In particular, topical application of resveratrol could be advantageous in the prevention of skin cancer or in the treatment of inflammation-based diseases such as psoriasis. However, different studies demonstrated the importance of the formulation to enhance t-res delivery into or trough the skin. Nanocarriers, such as ethosomes and transferosomes, have been successfully used to deliver drugs with different characteristics into or through the skin. Purpose: The aim of the present work was to develop a nanocarrier-based formulations for skin delivery of t-res. Methods: Ethosomes or transferosomes containing t-res were prepared by a modified hand-shaking method followed by extrusion or sonication. All the formulations were characterised in terms of mean diameter, size distribution (I.P.), t-res loading, t-res stability upon encapsulation during storage at 4°C. The inhibition of reactive oxygen species (ROS) and lipids peroxidation in human keratinocyte (HaCaT) cell line stimulated with H2O2 for 24 h and then incubated with the t-res containing nanocarriers was investigated. Moreover, for all the formulations, ex vivo permeation studies on porcine skin was carried out by means of Franz diffusion cells. At appropriate intervals (0.5, 1, 2, 4, 6, 24 h), an aliquots of the receptor medium were withdrawn and the t-res concentration was determined by HPLC. Results: All the t-res containing carriers were characterised by a very high (between 70 to 100%) encapsulation efficiency, a limited t-res release at 4°C during the storage and stability of resveratrol in its trans form. Nanocarriers encapsulating t-res reduced, in a concentration-dependent manner, ROS production induced by H2O2, with the higher effect observed in the case of ethosomes. Permeation studies showed that only ethosomes were able to promote t-res permeation through porcine skin and this effect was affected by lipid composition of the carrier. Conclusions: In this work, transferosomes showed the highest encapsulation efficiency and the lowest t-res release. On the other hand, only ethosomes were able to promote t-res permeation through the skin.

Introduzione. L???acido zoledronico (ZOL), un aminobisfosfonato di terza generazione, è a tutt???oggi il più potente inibitore del riassorbimento osseo per la sua capacità di inibire l???attività degli osteoclasti a concentrazioni nanomolari. E??? impiegato per il trattamento delle metastasi ossee ed in patologie come l???osteoporosi ed il morbo di Paget. Numerosi studi hanno dimostrato un potente effetto pro-apoptotico di ZOL in numerose linee cellulari tumorali (Caraglia M. et al. 2006); ciò ne suggerisce un impiego, oltre che come agente anti-riassorbimento osseo, come farmaco antitumorali vero e proprio. Tuttavia, la breve emivita plasmatica ed il rapido accumulo di ZOL nel tessuto osseo, impediscono il raggiungimento di livelli di farmaco efficaci in tumori localizzati al di fuori del compartimento osseo (Caraglia M. et al. 2006). Scopo del lavoro. Lo scopo del lavoro è stato lo sviluppo di nanosistemi che consentano l???impiego di ZOL nel trattamento di differenti tumori extra-ossei, riducendo l???accumulo del farmaco nel tessuto osseo ed aumentandone la concentrazione in tessuti periferici, ad es. in siti tumorali. Metodi. Sono state sviluppate nanoparticelle (NP) auto-assemblanti PEGhilate (Salzano G. et al. 2011) composte da NP di calcio fosfato contenenti ZOL (CaPZ NP) ricoperte con liposomi. Brevemente, due soluzioni acquose, rispettivamente di CaCl2 e Na2HPO4, sono state mescolate sotto agitazione magnetica e la risultate dispersione è stata filtrata mediante filtri da 0,22 mm (CaP NP). La dispersione è stata poi mescolata con una soluzione acquosa di ZOL, ottenendo Ca2+/PO43- NP contenenti ZOL (CaPZ NP). In una seconda fase, CaPZ NP sono state mescolate con liposomi cationici PEGhilati per 10 min a temperatura ambiente, ottenendo NP denominate PLCaPZ NP. Le NP sono state caratterizzate e sono state valutate le dimensioni e la distribuzione dimensionale, la morfologia e l???efficienza di complessazione di ZOL. E??? stata poi valutata l???attività in vitro e la citotossicità delle NP contenenti ZOL in diverse linee cellulari tumorali. Studi di proliferazione cellulare in presenza di ZOL sono stati determinati mediante il saggio MTT. L???attività antitumorale delle PLCaPZ NP è stata infine valutata in modelli animali di cancro. Risultati. Sono state ottenute PLCaPZ NP con un diametro medio di 147 nm ed un indice di polidispersità di 0,1. Dall???analisi morfologica, effettuata mediante cFEG SEM, le particelle di PLCaPZ NP appaiono omogenee e di forma sferica. Il contenuto reale di ZOL, determinato mediante HPLC, è di 65 ???g di ZOL/mg lipidi, corrispondente ad un???efficienza di complessazione di circa il 70%. In tutte le linee cellulari tumorali studiate, l???impiego di PLCaPZ NP ha dimostrato un forte potenziamento (fino a 12 volte su cellule di carcinoma mammario) dell???inibizione della crescita cellulare rispetto a quella ottenuta con ZOL libero. Infine, in studi in vivo, in un modello di carcinoma prostatico, è stata osservata una significativa riduzione della crescita del tumore ed un aumento della sopravvivenza in seguito a somministrazione di PLCaPZ NP. Inoltre, è stata osservata una remissione completa del tumore in una percentuale significativa di animali. Nello stesso modello animale, non è stato rilevato alcun effetto significativo in seguito a trattamento con ZOL in soluzione. Conclusioni. In conclusione, è stata sviluppata una potenziale formulazione di nanoparticelle auto-assemblanti contenenti ZOL. Solo mediante l???impiego di tali NP, è stata dimostrato un potente effetto antitumorale di ZOL in un modello animale di carcinoma prostatico.

Introduction: Zoledronic acid (ZOL), a third generation amino-bisphosphonate (A-BP), is actually, the most potent inhibitor of the bone resorption, largely used in clinic for the treatment of bone diseases (i.e. bone metastases, osteoporosis and Paget's disease). Numerous pre-clinical studies have demonstrated a powerful pro-apoptotic effect of ZOL in several tumor cell lines, suggesting an use of ZOL as anticancer drug. However, their short plasma half-life and the rapid accumulation of ZOL in bone, hamper the achievement of effective drug levels in tumors located outside the bone compartment. Purpose: To develop a nanosystem to use ZOL in the treatment of different extra-skeletal tumors, reducing the accumulation of drug in bone and increasing its concentration in peripheral tissues, e.g. in tumor sites. Methods: We developed pegylated self-assembly nanoparticles (NPs) composed of calcium phosphate NPs containing ZOL (NP CaPZ) coated with liposomes. Briefly, two aqueous solutions of CaCl2 and Na2HPO4, respectively, were mixed under magnetic stirring and the resulting dispersion was filtered through 0.22??????m pore filters (CaP NPs). The dispersion was then mixed with an aqueous solution of ZOL, resulting in Ca2+ / PO43- NPs containing ZOL (CaPZ NPs). In the following step, CaPZ NPs were mixed with pegylated cationic liposomes for 10 min at room temperature, obtaining the so-called PLCaPZ NPs. The NPs were characterized in terms of mean diameters and size distribution, morphology and ZOL complexation efficiency. The in vitro activity and cytotoxicity of NPs containing ZOL were evaluated in different tumor cell lines. Cellular proliferation studies in the presence of ZOL was investigated by MTT assay. Finally, the antitumor activity of PLCaPZ NP was evaluated in animal model of prostate cancer. Results: PLCaPZ NPs with a mean diameter of about 147 nm and a polydispersity index of about 0.1 were obtained. Morphological analysis, performed by cFEG SEM, showed that the PLCaPZ NPs preparation consisted in an homogeneous and spherical particle dispersion. HPLC analysis of non-complexed ZOL showed an actual loading of 65 ???g of ZOL/mg lipids, corresponding to a complexation efficiency of about 70%. In all cell lines, the NPs strengthened the growth inhibition induced by free ZOL, reaching a potentiation factor of 12 in breast carcinoma cell lines. Finally, a significant reduction in tumor growth and an increased survival following administration of PLCaPZ NP was observed in a model of prostate cancer. In addition, a complete remission of the tumor, after treatment of the animals with PLCaPZ NPs, was observed in a significant percentage of animals. In the same animal model, the administration of free ZOL was not effective in reducing significantly the growth of the tumors. Conclusions: New self-assembly NPs containing ZOL were successfully developed in our lab. The use of PLCaPZ NPs allowed to achieve a potent anti-tumor effect of ZOL, demonstrated in an animal model of prostate cancer. In the same animal model, tumor growth was unaffected when using free ZOL.

Introduzione. I bisfosfonati (BF) sono farmaci d’elezione nel trattamento delle metastasi ossee o in patologie come l’osteoporosi e il morbo di Paget, grazie al loro effetto inibitorio sull’attività degli osteoclasti. Il potente effetto pro-apoptotico dei BF osservato in numerose linee cellulari tumorali, ne suggerisce un impiego come farmaci antitumorali veri e propri. Tuttavia, la breve emivita ed il rapido accumulo dei BF nel tessuto osseo, impediscono il raggiungimento di livelli di farmaco efficaci in tumori localizzati al di fuori del compartimento osseo1. Scopo del lavoro. Sviluppare liposomi a lunga circolazione che consentano l’impiego di BF nel trattamento di differenti tumori extra-ossei. Tra i BF è stato scelto l’acido zoledronico (ZOL), un amminobifosfonato di terza generazione. Materiali e Metodi. Liposomi PEGhilati contenenti ZOL (lipoZ) sono stati preparati mediante la tecnica di evaporazione in fase inversa seguita da estrusione. I risultanti liposomi sono stati purificati e liofilizzati in presenza di lattosio come crioprotettore. I lipoZ sono stati testati su diverse linee cellulari tumorali ed in modelli animali di tumore. Risultati. Sono stati preparati lipoZ a differente composizione lipidica con dimensioni comprese tra 203 e 241 nm ed un contenuto di ZOL compreso tra circa 77 e 101 g/mg di lipidi. In tutte le linee cellulari, i lipoZ potenziano l’inibizione della crescita cellulare rispetto a ZOL libero, raggiungendo un massimo effetto nella linea cellulare 769P di adenocarcinoma renale, con fattore di potenziamento (PF) di 20. Successivamente, sono stati condotti studi in vivo in modelli animali di cancro della prostata e di mieloma multiplo. Negli animali trattati con lipoZ, è stata osservata una significativa inibizione della crescita tumorale ed un incremento della sopravvivenza degli animali trattati, in entrambi i modelli sperimentali. Tali effetti non sono invece stati osservati negli animali trattati con ZOL libero. Conclusione. In conclusione, i liposomi stealth sono capaci di trasformare ZOL in un potente farmaco antitumorale.

Zoledronic acid (ZOL), a third-generation amino-bisphosphonate, has been approved in the US, the EU and many other countries worldwide for the prevention of skeletal-related events in patients with bone metastases of malignancy. Recently, evidence suggested that ZOL is also potent inducers of apoptosis in several cancer cell types such as myeloma and breast, prostate and pancreatic cancer as well as in macrophage and intestinal epithelial cell lines. These data indicate that the beneficial effect of ZOL on metastatic bone disease may result also from direct anti-cancer activity that may affect a broad range of tumours1. However, both the rapid elimination from plasma and the rapid uptake and accumulation within bone hamper the direct anti-cancer activity of ZOL in vivo. Liposomes have been extensively used to change drug biodistribution. In particular, liposomes with stealth properties allow to address the encapsulated drug toward tissues characterised by vessel with an enhanced permeability of the endothelium, such as tumors. In this study, a strategy to change ZOL biodistribution upon i.v. administration is proposed. In particular, we used stealth liposomes encapsulating ZOL to avoid the accumulation of the drug into the bone and increase its concentration in non-calcified tissues, e.g. in tumour tissues. ZOL-containing liposomes were prepared at different lipid composition. The in vitro activity and the cytotoxicity of ZOL-containing liposomes were investigated on different cell lines. Moreover, the selected formulation was tested in two in vivo model of multiple myeloma and prostate cancer, respectively.

Il trans-resveratrolo è un polifenolo non flavonoide di origine naturale particolarmente abbondante nella buccia degli acini d’uva. Esistono due isoforme del resveratrolo, il cis ed il trans resveratrolo. Studi recenti hanno dimostrato che la maggior parte dell’attività farmacologica è da attribuire all’isoforma trans. Numerosi sono gli effetti farmacologici attribuiti al resveratrolo, quali antitumorale, anti-aggregante piastrinico e fluidificante del sangue, antiinfiammatorio, antivirale ed antibatterico soprattutto a livello cutaneo1. Recentemente il nostro gruppo di ricerca ha evidenziato l’utilità del trans-resveratrolo nel trattamento dell’acne volgare2. Lo scopo di questo lavoro è stato lo sviluppo di nanovettori a base lipidica per la veicolazione topica del resveratrolo, con lo scopo di aumentare l’accumulo di tale molecola nella cute, garantendone però la sua stabilità nella forma trans. A tale scopo è stata studiata la possibilità di preparare transferosomi ed etosomi, nanovettori che hanno mostrato poter migliorare la penetrazione e/o la permeazione di numerosi farmaci nella cute3. I vettori sono stati preparati mediante la tecnica del film lipidico seguita da idratazione del film e successivo dimensionamento tramite estrusione o sonicazione. Per quanto riguarda i transferosomi, essi sono stati preparati con tre diversi attivatori di membarana, ed in particolare con Tween 80, sodio colato e sodio deossicolato. I vettori sono poi stati caratterizzati in base a dimensioni, indice di polidispersità, tassi d’incapsulazione, rilascio del resveratrolo. Le analisi sono state effettuate dopo preparazione e dopo conservazione a 4°C. Inoltre sono stati effettuati saggi in vitro per valutare la tossicità dei carrier e la capacità di tali vettori di ridurre la produzione di radicali dell’ossigeno in cheratinociti umani stimolati con H2O2. Sono state ottenute formulazioni in cui il diametro medio è compreso tra 78 e 120 nm, con un indice di polidispersità (IP) molto basso (< 0,1), con eccezione dei transferosomi contenenti Tween80 (IP di 0,3-0,4). Queste differenze sono state attribuite in parte al tipo di tecnica utilizza per il dimensionamento, ed i parte alla possibile aggregazione indotta dal Tween80. Dopo 30 giorni di conservazione non sono state osservate variazioni nel diametro medio. Tutte le formulazioni sono caratterizzare da un alto tasso d’incapsulazione, che non varia in maniera significativa dopo conservazione a 4°C. In studi su colture cellulari, è stato osservato che, nel caso degli etosomi, si osserva una lieve tossicità dovuta probabilmente dovuto alla presenza di etanolo nella formulazione. Nel caso dei transferosomi, è stata osservata riduzione della vitalità solo con la formulazione contenente il Tween80, tossicità che però viene quasi del tutto annullata in presenza di resveratrolo incapsulato. In saggi sull’attività antiossidante, è stato osservato che il solo resveratrolo è in grado di ridurne in maniera significativa la produzione di radicali dell’ossigeno (ROS) in maniera concentrazione-dipendente. Sia gli etosomi che i transferosomi (ad eccezione della preparazione contente Tween80), sono in grado di ridurre la produzione di ROS in maniera simile al solo resveratrolo. Sono attualmente i corso studi di permeazione attraverso la cute di maiale per valutare l’efficienza di permeazione e l’accumulo di resveratrolo attraverso la cute in presenza di etosomi e dei transferosomi.

Introduzione. L’acido zoledronico (ZOL) è a tutt’oggi il più potente inibitore dell’ attività degli osteoclasti. Numerosi studi pre-clinici hanno dimostrato un potente effetto pro-apoptotico di ZOL in numerose linee cellulari tumorali1. Tuttavia, la breve emivita ed il rapido accumulo di ZOL nel tessuto osseo, ne impediscono l’impiego clinico nel trattamento di tumori extra-ossei2. Scopo del lavoro.Lo sviluppo di nanosistemi auto assemblanti che consentano l’utilizzo di ZOL nel trattamento di differenti tumori. Materiali e metodi. Sono state sviluppate due diverse formulazioni di nanoparticelle (NP) auto-assemblanti. In particolare, sono state allestite NP di calcio fosfato complessate con ZOL (CaPZ NP), che sono poi state ricoperte con liposomi cationici PEGhilati (pre-PLCaPZ NP) o, in alternativa, mescolate con liposomi cationici e poi incubate con micelle di lipidi PEGhilati (post-PLCaPZ NP). Le formulazioni sviluppate sono state caratterizzate per valutarne le dimensioni e l’indice di polidispersità, la morfologia ed il contenuto di ZOL. L’attività antiproliferativa e la citotossicità delle pre e post-PLCaPZ NP sono state valutate in differenti linee cellulari tumorali e successivamente in un modello animale di carcinoma prostatico. Risultati. Le pre e post-PLCaPZ NP presentano un diametro medio rispettivamente di 147 e 309 nm, con indice di polidispersità di 0,1 e 0,3. Con entrambe le formulazioni è stato osservato un potenziamento dell’inibizione della crescita cellulare, non osservata in cellule trattate con ZOL in soluzione. In un modello di carcinoma prostatico, in seguito a trattamento con pre-PLCaPZ NP, è stata osservata una significativa riduzione della crescita del tumore. Nello stesso modello animale, non è stato rilevato alcun effetto in seguito a trattamento con ZOL in soluzione. Conclusioni. La formulazione denominata pre-PLCaPZ NP presenta ottime caratteristiche formulative con possibilità di essere preparata facilmente prima dell’uso. A tali caratteristiche tecnologiche si associa una significativa riduzione della crescita tumorale osservata in un modello animale di adenocarcinoma prostatico.

I bisfosfonati (BF) sono farmaci d’elezione nel trattamento delle metastasi ossee o in patologie come l’osteoporosi e il morbo di Paget, grazie al loro effetto inibitorio sull’attività degli osteoclasti (1). Il potente effetto pro-apoptotico dei BF osservato in numerose linee cellulari tumorali, ne suggerisce un impiego come farmaci antitumorali veri e propri (2). Tuttavia, la breve emivita ed il rapido accumulo dei BF nel tessuto osseo, impedisce il raggiungimento di livelli di farmaco efficaci in tumori localizzati al di fuori del compartimento osseo (3). Lo scopo di questo lavoro è stato lo sviluppo di nanosistemi che consentano l’impiego di BF nel trattamento di differenti tumori extra-ossei. Tra i BF è stato scelto l’acido zoledronico (ZOL), un aminobisfosfonato di ultima generazione. Sono stati sviluppati due diversi sistemi, liposomi a lunga circolazione e nanoparticelle autoassemblanti. In entrambi i casi, sono state ottimizzate le condizioni formulative al fine di ottenere particelle di dimensioni colloidali, stabilità fisica della dispersione ed alta efficienza di incapsulazione. Le formulazioni selezionate sono poi state testate su diverse linee cellulari tumorali e successivamente saggiate in vivo. Sono stati preparati liposomi PEGilati contenenti ZOL (lipoZ) di dimensioni comprese tra 203 e 241 nm ed un contenuto di ZOL compreso tra circa 77 e 101 g/mg di lipidi. In tutte le linee cellulari, i lipoZ potenziano l’inibizione della crescita cellulare rispetto a ZOL libero, raggiungendo un massimo effetto nella linea cellulare 769P di adenocarcinoma renale, con fattore di potenziamento (PF) di 20. Per i successivi studi in vivo, è stata selezionata la formulazione che, in seguito a liofilizzazione e successiva reidratazione, non subisce significative variazioni delle dimensioni e della quantità di ZOL incapsulato. Tali studi sono stati condotti su due modelli animali di cancro della prostata e di mieloma multiplo. Negli animali trattati con lipoZ, è stata osservata una significativa inibizione della crescita tumorale rispetto ed un incremento della sopravvivenza degli animali trattati, in entrambi i modelli sperimentali. Tali effetti non sono invece stati osservati negli animali trattati con ZOL libero. Sono stati poi sviluppati nanocomplessi di natura lipidica contenenti ZOL. In particolare, sono state preparate nanoparticelle (NP) di Ca2+/PO4- (CaP NP) che sono state poi complessate con ZOL (CaPZ NP). Successivamente, le CaPZ NP sono state incubate con liposomi cationici PEGilati (pre-PLCaPZ NP) o, in alternativa, mescolate con liposomi cationici e successivamente con micelle di lipidi coniugati con PEG (post-PLCaPZ NP). Sono state ottenute pre-PLCaPZ NP con un diametro medio di 147 ed indice di polidispersità (IP) di 0,1; le post-PLCaPZ NP presentano invece dimensioni maggiori e distribuzione dimensionale più eterogenea (309 nm, IP=0,3). Con entrambe le formulazioni è stato osservato un potenziamento dell’inibizione della crescita cellulare, non osservata in cellule trattate con ZOL in soluzione (PF di 12 in cellule MCF7di carcinoma mammario). Infine, in un modello di carcinoma prostatico, in seguito a trattamento con pre-PLCaPZ NP, è stata osservata una significativa riduzione della crescita del tumore. Nello stesso modello animale, non è stato rilevato alcun effetto in seguito a trattamento con ZOL in soluzione. In conclusione, sono state sviluppate due diverse formulazioni per la veicolazione di ZOL in tumori. Entrambe le formulazioni sono efficaci nel trasformare ZOL in un potente farmaco antitumorale. La formulazione pre-PLCaPZ NP, se confrontata con lipoZ, assicura un maggiore caricamento di ZOL e la possibilità di essere preparata subito prima dell’uso, cosi da superare i problemi di stabilità dei liposomi durante la conservazione.

Introduzione. L’acido zoledronico (ZOL) è il più potente inibitore dell’attività degli osteoclasti. Studi pre-clinici hanno dimostrato che ZOL, in modelli animali di dolore da metastasi ossee, riduce significativamente l’allodinia e l’iperalgesia meccanica associata con neuropatia periferica, nonché l’infiammazione. Tuttavia, la breve emivita ed il rapido accumulo di ZOL nel tessuto osseo, impediscono al farmaco di raggiungere concentrazioni farmacologicamente attive in alcuni distretti tissutali. Scopo del lavoro. Sviluppare nanosistemi che consentano l’impiego di ZOL nel trattamento dei sintomi associati al dolore neuropatico e valutarne il potenziale effetto antineuropatico ed i potenziali target a livello spinale (neuroni, astrociti, microglia). Materiali e metodi. Liposomi PEGhilati contenenti ZOL (lipoZ) sono stati preparati mediante la tecnica di evaporazione in fase inversa seguita da estrusione, purificazione e liofilizzazione. L’efficacia dei lipoZ è stata valutata in un modello murino di neuropatia periferica, la spared nerve injury (SNI). In particolare, sono stati valutati gli effetti sull’allodinia meccanica e sono state effettuate valutazioni morfologiche a livello delle corna dorsali del midollo spinale (L4-L6) al fine di investigare una potenziale azione di lipoZ nella gliosi reattiva spinale associata a dolore neuropatico. Risultati. Sono stati preparati lipoZ con dimensioni comprese tra 203 e 241 nm ed un contenuto di ZOL compreso tra circa 77 e 101 g/mg di lipidi. Studi in vivo hanno dimostrato una significativa riduzione di allodinia meccanica in seguito a trattamento con lipoZ; il trattamento con ZOL libero e liposomi bianchi non produce alcun effetto. Dall’analisi morfologica del midollo spinale dei topi neuropatici, in seguito a trattamento con liposomi bianchi, è stato osservato un cambiamento della morfologia degli astrociti, in quanto risultano ipertrofici nelle corna dorsali mentre tale ipertrofia non è stata riscontrata nei topi trattati con lipoZ. Inoltre, il trattamento con lipoZ determina un aumento di IL-10, una citochina antinfiammatoria, negli astrociti. Conclusioni. Grazie all’impiego delle nanotecnologie è stata dimostrata un’attività di ZOL nel trattamento dei sintomi del dolore neuropatico in vivo.

Purpose. To design and develop novel self assembled nanoparticles (NPs) for the delivery of zoledronic acid (ZOL) in cancer therapy. Methods. NPs were prepared by two different methods. Briefly, a solution of CaCl2 and Na2HPO4 were mixed under stirring and the resulting dispersion was filtered trough 0.22 m pore filters. The dispersion was mixed with an aqueous solution of ZOL, resulting in ZOL-containing Ca2+/PO43- NPs (CaPZ NPs). In the following step, the CaPZ NPs were incubated under strirring with PEGylated cationic liposomes at room temperature for 10 min (pre-PLCaP NPs). Alternatively, CaPZ NPs were mixed with cationic liposomes and the resulting particles were then incubated with micelles of PEGylated lipid at 50°C for 10 min (post- PLCaP NPs). All formulations were characterised in terms of morphology, mean diameter, polydispersity index, zeta potential and ZOL actual loading. of NPs. The in vitro activity of PLCaPZ NPs were investigated on different cell lines. Cell proliferation studies in presence of ZOL was investigated by MTT assay. Results. The technological characterization of NPs underlined significant differences between pre-PLCaPZ and post-PLCaPZ NPs. In particular, pre-PLCaPZ and post-PLCaPZ NPs had mean diameters of about 147 and 309 nm, respectively. Moreover, in the case of pre-PLCaP NPs, a very narrow size distribution was observed. Morphological analysis showed that the post-PLCaP preparation consisted in an heterogeneous particle dispersion, reasonably due to the coexistence of micelles and NPs. On the contrary, spherical-shaped and homogenously dispersed NPs were found in the case of pre-PLCaPZ. HPLC analyis of non-complexed ZOL showed an actual loading of 65 and 0.09 g of ZOL/mg lipid for post-PLCaP and pre-PLCaP, respectively. In all cell lines, the NPs strengthened the growth inhibition induced by free ZOL, reaching a potentiation factor of 12 in breast carcinoma MCF7 cell line. Conclusions. New ZOL-containing NPs were successfully developed in our lab. In particular, the formulation termed as pre-PLCaPZ consists in NPs with a narrow size distribution and high ZOL encapsulation and can be easily prepared directly before use. In vitro studies showed that the antiproliferative activity of ZOL is strongly improved by using pre-PLCaPZ. The results obtained indicate that pre-PLCaPZ NPs could be a new and powerful tool to deliver ZOL in vivo.

Purpose: To design and develop novel self-assembled nanoparticles (NPs) for the delivery of zoledronic acid (ZOL) in cancer therapy. Methods: NPs were prepared by two different methods. Briefly, a solution of CaCl2 and Na2HPO4 were mixed under stirring and then filtered trough 0.22 m pore filters. The resulting dispersion was mixed with an aqueous solution of ZOL (CaPZ NPs). CaPZ NPs were then incubated under stirring with PEGylated cationic liposomes at room temperature for 10 min (pre-PLCaPZ NPs). Alternatively, CaPZ NPs were mixed with cationic liposomes and the resulting particles were then incubated with micelles of PEGylated lipid at 50°C for 10 min (post-PLCaPZ NPs). The in vitro activity of PLCaPZ NPs were investigated on different cancer cell lines. Results: We prepared pre and post-PLCaPZ NPs with a mean diameters of about 147 and 309 nm and an actual loading of 65 and 15 g of ZOL/mg lipid, respectively. Morphological analysis showed that the post-PLCaP preparation consisted in an heterogeneous particle dispersion. On the contrary, spherical-shaped and homogenously dispersed NPs were found in the case of pre-PLCaPZ. In all cell lines, the NPs strengthened the growth inhibition induced by free ZOL, reaching a potentiation factor of 12 in breast carcinoma MCF7 cell line. Conclusions: New self-assembled NPs formulation for ZOL delivery has been developed in our lab. In particular, the formulation termed as pre-PLCaPZ offers the advantaged such as good technological properties and easy preparation directly before use. In addition pre-PLCaP NPs assured a strong potentiation of the ZOL toxicity in different cancer cell lines. The results obtained indicate that pre-PLCaPZ NPs could be a new and powerful tool to deliver ZOL in tumors.

Purpose: The aim of the present work was to develop a nanocarrier-based formulation for topical delivery of resveratrol. Methods: Trans-resveratrol (t-res) was encapsulated in liposomes, ethosomes or transferosomes, by a modified hand-shaking method followed by extrusion. All the formulations were characterised in terms of mean diameter, size distribution (I.P.), t-res loading, t-res stability upon encapsulation during storage. The nanocarriers containing t-res were then introduced in cellulose-based gel to allow their final administration on the skin and the viscoelastic properties of the resulting formulation were investigated. Finally, we studied the inhibition of reactive oxygen species (ROS) in human keratinocyte (HaCaT) cell line stimulated with H2O2 for 24 h and then incubated with the t-res containing nanocarriers. Results: All the t-res containing carriers were characterised by a very high (close to 100%) encapsulation efficiency, a negligible t-res release at 4°C and stability of resveratrol in its trans form. The carriers only slightly influenced the viscoelastic characteristics of cellulose-based gels. Nanocarriers encapsulating t-res reduced, in a concentration-dependent manner, ROS production induced by H2O2 and this effect was higher when using t-res-encapsulating nanocarrier, with the higher effect observed in the case of ethosomes. Conclusions: In this work nanocarriers with high encapsulation efficiency, high physical stability and negligible t-res release during storage at 4°C were prepared. To allow their final administration on the skin, the nanocarrier can be easilisy loaded in cellulose-based gels without altering its rheological properties. Moreover, the use of t-res-encapsulating ethosomes led to an efficient antioxidant activity. Further ex vivo and in vivo studies will clarify the role of the different carrier when administered on the skin.

Purpose: To develop long circulating liposomes encapsulating ZOL in order to avoid the accumulation of the drug into the bone and increase its concentration in non-calcified tissues, e.g. in tumour tissues. Methods: The liposomes encapsulating ZOL (lipoZ) were prepared by a modified reverse-phase evaporation technique followed by extrusion. The resulting liposomes were then purified and freeze-dried in presence of a cryoprotectant. In vitro and in vivo activity of lipoZ, were investigated in different cancer cell lines and in mice models of prostate cancer and a multiple myeloma, respectively. Results: We prepared lipoZ at different lipid composition with a mean size ranged between 203 and 241 nm and an actual loading from about 77 to 101 g ZOL/mg lipids. The formulation with the higher ZOL retention after freeze-drying/rehydration was selected for further studies on cells and in vivo. In all cell lines, lipoZ strengthened growth inhibition induced by free ZOL. In vivo studies, in both mice cancer models, lipoZ induced a strong tumour growth inhibition with an increased mice overall survival. This effect was significantly higher than that observed with free ZOL. Conclusion: In this study, both anti-cancer activity and tolerability of ZOL-containing liposomes were demonstrated in preclinical animal models. When encapsulated into liposome, ZOL showed a powerful anticancer effect, while the tumors were resistant to free ZOL used at the same doses.

Basi scientifiche e scopo della ricerca. L’Acido Zoledronico (ZOL) è un aminobifosfonato utilizzato nel trattamento delle complicazioni derivate da metastasi ossee. Il principale meccanismo responsabile dell’attività antitumorale dello ZOL è l’induzione di apoptosi negli osteoclasti e nelle cellule tumorali dovuta all’inibizione della farnesil-pirofosfato sintetasi e mediata dalla proteina Ras. Poichè il maggiore limite dello ZOL è la breve emivita nel sangue e il suo accumulo quasi esclusivo nelle ossa (prevalentemente nella nicchia osteoclastica), è necessario sviluppare nuove formulazioni del farmaco che veicolino specificamente il farmaco nella nicchia tumorale. A questo scopo abbiamo incapsulato lo ZOL in liposomi Peghilati (Lipo-ZOL), per cambiarne la farmacodistribuzione ed aumentarne l’attività antitumorale. Risultati. È stata sviluppata una formulazione di liposomi PEGhilati contenenti ZOL. Esperimenti di immunofluorescenza in vitro sulla linea cellulare di tumore alla prostata (PC3) hanno dimostrato che Lipo-ZOL viene internalizzato dalle cellule localizzandosi nel citoplasma. Inoltre Lipo-ZOL induce una maggiore inibizione della crescita cellulare in vitro rispetto allo ZOL libero in un pannello di linee cellulari tumorali. Esperimenti in vivo condotti su topi immunodepressi impiantati con cellule PC3 o cellule di mieloma multiplo (OPM2) hanno dimostrato che il trattamento con Lipo-ZOL rispetto al trattamento con lo ZOL libero, è più efficace nell’’inibire la neoangiogenesi in vivo, ridurre la crescita tumorale e aumentare la sopravvivenza dei topi trattati. Conclusioni. I risultati ottenuti hanno dimostrato la maggiore efficacia terapeutica di Lipo-ZOL in confronto con lo ZOL libero. Questo suggerisce che l’uso dei liposomi come sistema di veicolazione dello ZOL è una strategia promettente per il trattamento di tumori di diversa istogenesi.