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International audience; FeFe hydrogenases are the most efficient H$_2$-producing enzymes. However, inactivation by O$_2$ remains an obstacle that prevents them being used in many biotechnological devices. Here, we combine electrochemistry, site-directed mutagenesis, molecular dynamics and quantum chemical calculations to uncover the molecular mechanism of O$_2$ diffusion within the enzyme and its reactions at the active site. We propose that the partial reversibility of the reaction with O$_2$ results from the four-electron reduction of O$_2$ to water. The third electron/proton transfer step is the bottleneck for water production, competing with formation of a highly reactive OH radical and hydroxylated cysteine. The rapid delivery of electrons and protons to the active site is therefore crucial to prevent the accumulation of these aggressive species during prolonged O$_2$ exposure. These findings should provide important clues for the design of hydrogenase mutants with increased resistance to oxidative damage.

International audience

Photosystem II (PSII) uses light energy to oxidise water and reduce quinone. The water oxidation site is a Mn4Ca cluster located on the luminal side of the membrane protein complex, while the quinone reduction site is made up of two quinones (QA and QB) and a non-heme Fe2+ located on the stromal side of the membrane protein. In this thesis I worked on both oxidation and reduction functions of the enzyme. QA•- and QB•- are magnetically couple to the Fe2+ giving weak and complex EPR signals. The distorted octahedral Fe2+ has four histidines ligands and an exchangeable (bi)carbonate ligand. Formate can displace the exchangeable (bi)carbonate ligand, slowing electron transfer out of the PSII reaction centre. Here I report the formate-modified QB•- Fe2+ EPR signal, and this shows marked spectral changes and has a greatly enhanced intensity. I also discovered a second new EPR signal from formate-treated PSII that is attributed to formate-modified QA•- Fe2+ in the presence of a 2-electron reduced form of QB. In addition, I found that the native QA•- Fe2+ and QB•- Fe2+ EPR signals have a strong feature that had been previously missed because of overlapping signals (mainly the stable tyrosyl radical TyrD•). These previously unreported EPR signals should allow for the redox potential of this cofactor to be directly determined for the first time. I also observed that when QB•-Fe was formed; it was able to oxidise the iron slowly in the dark. This occurred in samples pumped to remove O2. This observation implies that at least in some centres, the QB•-/QBH2 couple has a higher potential then is often assumed and thus that the protein-bound semiquinone is thermodynamically less stable expected. It has yet to be determined if this represents a situation occurring in the majority of centres. Treatment of the system with dithionite generated a modified form of QA•-Fe2+ state and a change in the association of the proteins on gels. This indicates a redox induced modification of the protein, possibly structurally important cysteine bridge in PSII.On the water oxidation side of the enzyme, I studied the first step in the assembly of the Mn4Ca cluster looking at Mn2+ oxidation using kinetic EPR and high field EPR. Conditions were found for stabilising the first oxidised state and some discrepancies with the literature were observed. I also found that dithionite could be used to reduce the Mn4Ca, forming states that are formally equivalent to those that exist during the assembly of the enzyme.; Le photosystème II (PSII) est un complexe multi-protéique qui utilise l'énergie solaire pour oxyder l'eau et réduire des quinones. Le site catalytique d'oxydation de l'eau est localisé coté lumen du complexe, alors, que le site de réduction comprenant deux quinones (QA et QB) et un fer non-hémique est localisé sur le coté stromal du complexe membranaire. Dans cette thèse j'ai étudié les deux cotés accepteur et donneur d'électrons du PSII.QA•- et QB•- sont couplés magnétiquement au fer non-hémique donnant de faibles signaux RPE. Le fer non-hémique possède quatre ligands histidines et un ligand (bi)carbonate échangeable. Le formate peut échanger le ligand (bi)carbonate induisant un ralentissement dans le transfert d'électrons. Ici, je décris une modification du signal RPE de QB•- Fe2+ lorsque le formate est substitué au (bi)carbonate. J'ai aussi découvert un second signal RPE dû à la présence du formate à la place du (bi)carbonate lorsque QB est doublement réduit. De plus, j'ai trouvé que les signaux RPE natifs de QA•- Fe2+ et QB•- Fe2+ possèdent une signature intense encore jamais détectée. Tous les signaux RPE rapportés dans cette thèse devraient faciliter le titrage redox de QB par RPE. J'ai aussi observé que QB•- peut oxyder le fer non-hémique à l'obscurité en anaérobie. Cette observation implique qu'au moins dans une fraction des centres, le couple QB•-/QBH2 possède un potentiel redox plus haut que supposé. La quantification du nombre de centres où cette oxydation du fer se produit par le couple QB•-/QBH2 reste à faire. La réduction du PSII par le dithionite génère un signal modifié de QA•-Fe2+, un changement structural du PSII observé par électrophorèse. Cela peut indiquer la réduction d'un pont disulfure à l'intérieur du PSII. Concernant le site d’oxydation de l'eau, j'ai étudié la première étape de l'assemblage du site catalytique (Mn4Ca), en suivant l'oxydation du Mn2+ par RPE en bande X et haut champ. J'ai mis au point des conditions expérimentales permettant le piégeage du premier intermédiaire et j'ai aussi trouvé une incohérence avec des travaux publiés dans la littérature. J'ai aussi trouvé que le dithionite pouvait réduire le site catalytique Mn4Ca, en formant des états sur-réduits qui peuvent correspondre aux intermédiaires de l'assemblage du cluster Mn4Ca.

Photosystem II uses solar energy to drive water oxidation and atmospheric O2 production. Its catalytic center comprises a cluster of four manganese and one calcium ions. The Mn4Ca cluster goes through five sequential oxidation states (S0 to S4) before O2 is evolved during the S4 to S0 transition. Although the Ca2+ ion is detected in the actual crystallographic structures, its role still needs to be clarified. A second cofactor is involved: the chloride, whose localization and role in the O2 evolution are unclear. To study both cofactors, we replaced biosynthetically the Ca2+ and the Cl- by Sr2+ and Br- in the thermophilic cyanobacteria Thermosynechococcus elongatus. In the substituted PSII, the O2 evolution under continuous illumination is decreased. It varies in the following order: Ca/Cl>Ca/Br>Sr/Cl>Sr/Br. In chapter III, we explain this activity decrease by a kinetic limitation of some of the electron transfer steps, in particular the S3 to S0 transition during which a lag phase is put in evidence. We demonstrate that this lag phase corresponds to a modification of the electrostatic environment of the chlorophyll P680, implying very likely proton movements. The significant slow down of the kinetics goes with a decrease of the free energy level of the S3 state and consequently with a decrease of the redox potential of the S3/S2 couple. In chapter IV, we study the exchangeability of the halide, and chloride is biochemically substituted with iodide. We observe a decrease of the catalytic activity due to the slowing down of the Mn4Ca cluster oxidation kinetics. The thermodynamic properties of PSII are also modified by the iodide, but the question still arises whether this is due to the reduction of the Mn4Ca cluster by I-, or to the increase of the redox potential of the S3/S2 couple. In chapter V, we focus on the structural aspects of the biosynthetically modified PSII samples. On one hand, we highlight the direct implication of Ca2+ in the binding of the substrate water molecules, and protonation/deprotonation phenomena during the S-states cycle. On the other hand, we show that our results support the existence of two halide binding sites., L'oxydation de l'eau et la production du dioxygène atmosphérique sont réalisées par le Photosystème II. Le centre catalytique du PSII est constitué d'un cluster de 4 ions manganèse et de 1 ion calcium. Sous l'action de la lumière, le complexe Mn4Ca passe par 5 états d'oxydation successifs (S0 à S4) avant l'émission d'oxygène au cours de la transition S4 à S0. Bien que l'ion Ca2+ soit détecté dans les structures cristallographiques actuelles, son rôle reste à préciser. Un deuxième cofacteur est mis en jeu : le chlorure, dont la position et le rôle dans le dégagement d'oxygène ne sont pas clairement définis. Pour étudier ces deux cofacteurs, nous avons réalisé le remplacement biosynthétique du Ca2+ et du Cl- par du Sr2+ et/ou du Br- dans la cyanobactérie thermophile Thermosynechococcus elongatus. Le dégagement d'oxygène sous éclairement continu diminue après substitution des cofacteurs. Il varie dans l'ordre suivant : Ca/Cl>Ca/Br>Sr/Cl>Sr/Br. Dans le chapitre III, nous mettons en évidence que cette baisse d'activité est due à un ralentissement de certaines étapes du transfert d'électron, et plus particulièrement de la transition S3 à S0 durant laquelle une phase de délai a été mise en évidence. Nous montrons que cette phase de délai correspond à une modification de l'environnement électrostatique de la chlorophylle P680, impliquant très probablement des mouvements de protons. Nous arrivons ainsi à détecter un intermédiaire réactionnel au cours de la transition, grâce au ralentissement dû à l'échange des cofacteurs Ca2+ et Cl-. Ces cinétiques ralenties accompagnent une baisse du niveau d'énergie libre de l'état S3 et donc du potentiel d'oxydo-réduction du couple S3/S2. Dans le chapitre IV, le chlorure est remplacé biochimiquement par de l'iodure après une étude des conditions d'échangeabilité de l'halogénure. A nouveau, une baisse d'activité sous éclairement continu est expliquée par un ralentissement des cinétiques d'oxydation du cluster de Mn4Ca. Les propriétés thermodynamiques du PSII sont modifiées en présence d'Imais il reste à savoir si cela est dû à la réduction du cluster de Mn4Ca par l'iodure, ou à une augmentation du potentiel redox du couple S3/S2. Dans le chapitre V, nous nous intéressons à différents aspects structuraux des échantillons substitués biosynthétiquement. D'une part, nous mettons en évidence l'implication directe du Ca2+ dans la fixation des molécules d'eau substrat, ainsi que des phénomènes de protonation/déprotonation ayant lieu au cours du cycle des états Si. D'autre part, nous montrons que nos résultats sont en faveur de l'existence de deux sites de fixation aux halogénures.