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We have previously shown that titers of soluble platelet selectin (s-P-selectin) and soluble vascular cell adhesion molecule-1 (s-VCAM-1) were increased in sera of patients with chronic Trypanosoma cruzi infection. In this study, we analyzed the expression of CD49d-integrins, that bind to VCAM-1, and sialyl Lewis x (SLex), which binds selectins, in peripheral blood lymphocytes of 27 patients with Chagas' disease at different levels of disease severity. Patients with a mild form of Chagas' disease showed a lower number of CD49d+ cells, in comparison with those with severe chronic cardiopathy. Decreased levels of CD49d+ cells were detected in CD3- cell populations. Conversely, SLex expression was found to be decreased in patients with severe Chagas' disease. Levels of soluble platelet endothelial cell adhesion molecule-1 (s-PECAM-1) were significantly increased in the plasma of patients with severe Chagas' disease while unaltered levels of MCP-1 were recorded. These data show that VCAM-1 and P-Selectin ligands are differentially expressed during the chronic phase of the Trypanosoma cruzi infection. These findings also reinforce a role of the P-selectin/SLex adhesion pathway rather than very late antigen-4 (VLA-4)/VCAM-1, in the pathogenesis of Chagas' disease. Fil: Laucella, Susana Adriana. Consejo Nacional de Investigaciones Científicas y Técnicas; Argentina. Dirección Nacional de Instituto de Investigación. Administración Nacional de Laboratorio e Instituto de Salud “Dr. C. G. Malbrán”. Instituto Nacional de Parasitología "Dr. Mario Fatala Chaben”; Argentina Fil: Riarte, A.. Dirección Nacional de Instituto de Investigación. Administración Nacional de Laboratorio e Instituto de Salud “Dr. C. G. Malbrán”. Instituto Nacional de Parasitología "Dr. Mario Fatala Chaben”; Argentina Fil: Prado, Natalia Jorgelina. Consejo Nacional de Investigaciones Científicas y Técnicas; Argentina. Dirección Nacional de Instituto de Investigación. Administración Nacional de Laboratorio e Instituto de Salud “Dr. C. G. Malbrán”. Instituto Nacional de Parasitología "Dr. Mario Fatala Chaben”; Argentina Fil: Zapata, J.. Dirección Nacional de Instituto de Investigación. Administración Nacional de Laboratorio e Instituto de Salud “Dr. C. G. Malbrán”. Instituto Nacional de Parasitología "Dr. Mario Fatala Chaben”; Argentina Fil: Segura, Elsa Leonor. Consejo Nacional de Investigaciones Científicas y Técnicas; Argentina. Dirección Nacional de Instituto de Investigación. Administración Nacional de Laboratorio e Instituto de Salud “Dr. C. G. Malbrán”. Instituto Nacional de Parasitología "Dr. Mario Fatala Chaben”; Argentina

De acuerdo a los objetivos planteados en este trabajo, hemos investigado laasociación entre componentes subcelulares del parásito con el gatillado y/odesarrollo del daño tisular en la forma crónica de la Enfermedad de Chagas. Nuestro primer paso fue investigar los componentes de la fracción CSresponsables de la respuesta inmune humoral en los PChCr y en particular,identificar aquellos que pudieren ser reconocidos exclusivamente por los PChCrcon cardiopatía severa. Para ello CS fue separada empleando geles depoliacrilamida, transferencia a hojas de nitrocelulosa y enfrentada con sueros de PChCr en distintos estadios clínicos. Estos estudios revelaron 32 componentesproteicos con PM entre 88 y 15 kDa, 30 de los cuales junto a 1 no visible por tinciónpara proteinas fueron reconocidos por al menos 1 de los 36 sueros ensayados,cada uno de los cuales reconoció entre 4 y 20 (media=12.6) bandas en CS. Si bienno pudo determinarse un perfil de reconocimiento particular para los PChCr condistinto compromiso clínico, se observó que el 75 % de los sueros reconocía 2polipéptidos con PM aparente de 52 y 42/42 kDa. En un segundo momento intentamos una caracterización química inicial delas estructuras peptídicas antigénicas de CS y Mc. El tratamiento con ácidoperiódico disminuyó significativamente la reactividad de los sueros contra ambasfracciones, indicando el rol central de los carbohidratos en su antigenicidad. Eltratamiento de CS con tripsina eliminó prácticamente toda la reactividad con lossueros de PChCr. El calentamiento y la reducción con 2 ME aunque tambiénredujeron la capacidad total de unión de los anticuerpos hacia CS y Mc, el efectofue más pronunciado para Mc. Sin embargo estos estudios revelaron que elantígeno calentado y reducido se resuelve en un mayor número de polipéptidosque el antígeno nativo, o solamente calentado o reducido. Con el objetivo de purificar antígenos relevantes se produjeron AcMo contra Mc. La reactividad anti-Mc y anti-CS de dichos AcMo fue evaluada empleandotécnicas de ELISA, dot blotting (DB) e inmunoblotting (WB). Se seleccionaron así 45hibridomas reactivos con Mc (28), Mc y CS (14) y CS (3). Entre los hibridomasproductores de anticuerpos capaces de reconocer en Mc al menos un polipéptidocon PM aparente mayor o igual a 50 kDa se seleccionaron 4 para su clonado. Deestos 4 AcMo, todos del tipo IgM, fue posible aislar un total de 24 clones: 3 a partirdel hibridoma 1A10, 12 a partir de 1D10, 2 a partir de 3C4 y 7 a partir de 2E9, lamayoría de los cuales se mostró reactivo con varios polipéptidos (3 a 9) en el mismogel. Si bien el rendimiento de los procesos de clonado fue diverso, de 2 a 23 clonesproductores de AcMo reactivos con Mc según el hibridoma de partida, la eficacia delclonado fue buena: en 3 de los 4 casos fue posible identificar y aislar clonesproductores de Ac reactivos con polipéptidos del tamaño buscado, y en todos estoscasos con reactividad más restringida que la del hibridoma original. A fin de investigar la presencia de determinantes antigénicos comunes al T. cruzi y a tejidos humanos se estudió la reactividad de los AcMo con muestras detejidos humanos, obtenidas a partir de dadores cadavéricos no chagásicos, libresde enfermedades autoinmunes, coronarias y tumorales. Empleando ensayos de DBse estudió la reactividad anti-miocardio (MIO) y anti-músculo esquelético (MES) de 52 sobrenadantes de hibridomas reactivos con Mc y/o CS y 11 sobrenadantesnegativos con ambas fracciones. En este primer estudio 27 de los 52 sobrenadantesde hibridomas reactivos con Mc y/o CS resultaron reactivos con MIO y/o MES. Conel propósito de establecer el perfil polipeptídico de MIO y MES humano amboshomogenatos fueron separados utilizando geles desnaturalizantes depoliacrilamida y transferidos a nitrocelulosa. Una porción de la misma se coloreócon Negro de Amido para evidenciar proteínas y la otra porción se aplicó a ladeterminación de glicoproteínas con Concanavalina A, para identificar residuoshidrocarbonados ricos en manosa y glucosa. MIO presentó 25 polipéptidos en elrango 79-15 kDa, 6 de los cuales contenían residuos azucarados, mientras MESreveló 24 bandas polipeptídicas, 7 de las cuales contenían hidratos de carbono. Una vez definido el perfil de MIO y MES se realizaron ensayos de WB paraidentificar los polipéptidos reconocidos por los AcMo en ellos. La fracción Mc es obtenida a partir de parásitos cultivados en un medio nodefinido que contiene homogeneizado de corazón bovino (TCM). Es entoncesposible que componentes del medio de cultivo acompañen la purificación y hayan “ensuciado” la producción y selección de los AcMo, que así podrían incluiranticuerpos específicos para corazón bovino capaces de dar reacción cruzada conmiocardio humano. A fin de investigar esta posibilidad se determinó en primer lugarla reactividad de dichos AcMo contra TCM y en aquellos casos donde esta fueencontrada se realizaron experimentos de absorción cuyos resultados demostraronque si bien para algunos AcMo existe reactividad cruzada entre Mc y TCM, lareactividad de los mismos hacia TCM es despreciable frente a la reactividad hacia Mc. Con el propósito de determinar no sólo la presencia sino también lalocalización subcelular de los antígenos de MIO y MES humano reconocidos por los AcMo anti-Mc se realizaron experimentos de inmunohistoquímica. Además seevaluó la especificidad de huésped y tejido empleando tejidos humanos y dehamster. En particular los AcMo ensayados (1A10C11, 1F3G2, 5A9B11 y 5F2)reconocieron estructuras en el MES humano y en MIO humano y de hamster. Entodos los casos los AcMo se unen a antígenos intracitoplasmáticos, y en algunoscasos (5A9B11 y 5F2) también a antígenos de la capa muscular de los vasos. El hecho de haber demostrado reactividad contra M10 de hamster dejóabierta la posibilidad de estudiar la actividad biológica de los mismos en modelosexperimentales y por lo tanto consideramos importante estudiar el grado dehomología entre los componentes del miocardio de distintos mamíferos. El perfilpolipeptídico obtenido por la separación electroforética de homogenatos de MIOmostró un importante grado de homologia entre especies. Por otro lado la realización de ensayos de Inmunoiluorescencia sobreparásitos fijados mostró que los epitopos reconocidos por los AcMo, a pesar depertenecer originalmente a una fracción interna del parásito, están tambiénrepresentados en la superficie y/o el flagelo del mismo. Otros estudios decaracterización de los AcMo anti-Mc revelaron que gran parte de los epitoposreconocidos por los mismos son al menos parcialmente de naturaleza glucídica. Enparticular entre los AcMo con reactividad cruzada dos (1A10C11 y 1F3G2)reconocen parcialmente epitopos de naturaleza glucídica mientras en los dosrestantes (5A9B11 y 5F2) los residuos hidrocarbonados no forman parte del sitio reconocido. Para determinar si los epitopos con reactividad cruzada eran reconocidos porlos PChCr y evaluar se ello tiene alguna importancia desde el punto de vistabiológico, se realizaron ensayos de inhibición. La capacidad para inmunoinhibir lareacción del AcMo 5F2 con Mc fue significativamente mayor entre los sueros de PChCr que en los controles. Más aún, 5F2 fue capaz de diferenciar a la poblaciónde PChCr sin compromiso cardíaco, o con grado mínimo, de la de PChCr concompromiso cardiaco. Es también interesante destacar que la capacidad parainmunoinhibir la reacción de 5F2 resultó entre sueros de PChCr sin compromisocardíaco directamente proporcional a la edad de los pacientes. El AcMo 5A9B11también fue capaz de separar la población de PChCr de la de los controles. Másaún, los epitopos del 5A9B11 fueron reconocidos en distinta medida por los PChCrsin compromiso cardiaco, definiendose dos poblaciones con baja y alta capacidadde inmunoinhibición respectivamente. Por último, y atendiendo al rol central que las citoquinas y las moléculas deadhesión celular tienen en la modulación de la respuesta inmune, tanto en su fazprotectora como en su potencial faz autoagresiva, en este trabajo estudiamos lacinética de expresión endógena de genes para citoquinas e ICAM-1 en células debazo (B) y corazón (C) de ratones infectados con las cepas Tulahuén y CA-1 delparásito. Luego de obtener el ARN y ADNc a partir de homogenatos de B y C serealizaron ensayos de PCR cuali y cuantitativo usando "primers" y/o competidoresespecíficos para IFN γ, TNF α, IL α, IL-6 e ICAM-1, encontrándose que la infecciónpor el parásito va acompañada por un claro aumento en los niveles intracelularesde precursores para citoquinas e ICAM-1, aunque la cinética depende del órganoestudiado y de la naturaleza de los parásitos infectantes. Fil: Laucella, Susana Adriana. Universidad de Buenos Aires. Facultad de Ciencias Exactas y Naturales; Argentina.

La enfermedad de Chagas (tripanosomiasis americana) es la enfermedad parasitaria de mayor impacto en América Latina y un problema de salud creciente en países no endémicos debido alos flujos migratorios. Una gran limitación para evaluar la eficacia el tratamiento conbenznidazol es la falta de pruebas diagnósticas que muestren a corto plazo los efectos deltratamiento. Los ensayos de serología convencional requieren un largo tiempo de seguimientopara observar la negativización completa, algo que ocurre en alrededor de un 30% de lospacientes tratados. Se desconoce si los anticuerpos que se detectan en la circulación de los pacientes con infección crónica provienen de células B vírgenes o linfocitos B de memoria que se diferencian continuamente a plasmablastos ante la persistencia del parásito o de linfocitos de larga vida que pueden persistir aún en ausencia del antígeno que le dieron origen. La presencia de linfocitos B de larga vida alojados en médula ósea o ganglios linfáticos podría enmascarar la desaparición de plasmablastos dependientes de la presencia de antígeno luego del tratamiento específico. En este trabajo nos propusimos medir los niveles de linfocitos B secretores de anticuerpos y células B de memoria específicas para T. cruzi y totales en la circulación de pacientes adultos y pediátricos con enfermedad de Chagas crónica mediante el ensayo de ELISPOT previamente a recibir el tratamiento con benznidazol y a distintos tiempos postratamiento. Los cambios en las poblaciones de linfocitos B se correlacionaron con la evolución serológica de los pacientes medida por técnicas de serología convencional y no convencionales. Mediante un método de tinción por citometría de flujo que utiliza proteínas recombinantes de T. cruzi marcadas con fluorocromos como "cebos", analizamos el fenotipo de las células B específicas para T. cruzi. Finalmente, se evaluó la capacidad funcional de las diferentes subpoblaciones de linfocitos B totales en la circulación de pacientes con distinto grado de disfunción cardíaca. La mayoría de los individuos infectados con T. cruzi presentaron CSAs (plasmablastos) específicos para un lisado de T. cruzi en su circulación, y estas células desaparecieron luego del tratamiento con benznidazol sólo en aquellos pacientes que mostraron una disminución de los niveles de anticuerpos indicativos de eficacia (ya sea negativización completa de la serología o caída significativa de títulos), pero no en aquellos pacientes con títulos serológicos inalterados. Con respecto a los niveles de células B de memoria, estos fueron bajos, ya sea antes, así como después del tratamiento. La disminución en los niveles de células secretoras de anticuerpos específicos para T. cruzi se correlación con la disminución en los niveles de anticuerpos medidos por el ensayo de multiplex y precedió la disminución de anticuerpos medidos por serología convencional. Las células B específicas para las proteínas recombinantes de T. cruzi se componen principalmente de células de memoria atípicas, células vírgenes en reposo y plasmablastos. Del análisis del fenotipo B total observamos una distribución anormal de células B en individuos con enfermedad crónica, particularmente un aumento en la frecuencia de células B de memoria atípicas y plasmablastos tanto en adultos como en niños infectados con T. cruzi. El tratamiento con benznidazol logró restaurar un fenotipo similar al observado en personas no infectadas. En el análisis funcional observamos que existe una disfunción en la producción de citocinas inflamatorias en los pacientes con compromiso cardíaco avanzado Particularmente pudimos ver que, luego de la estimulación policlonal, las células B de memoria atípica presentan poca capacidad para secretar IL-6 y TNF-α, mientras que observamos que la mayor producción de citocinas se da por parte de células B vírgenes activadas y células B CD27+CD21+HLADR+ que probablemente corresponda a un fenotipo de memoria previo a la activación y perdida de la molécula CD21. Estos hallazgos en conjunto muestran la viabilidad de detectar células B específicas para T. cruzi en la fase crónica de la enfermedad de Chagas. La lenta caída en los niveles de anticuerpos específicos para el parásito luego del tratamiento puede deberse a la presencia de linfocitos B de larga vida confirmando la hipótesis de esta tesis. La infección crónica también induciría alteraciones en la diferenciación y función de células B. El seguimiento de CSAs específicas para el parásito serviría como una herramienta útil para determinar la eficacia de tratamiento en protocolos de ensayos clínicos [fórmula aproximada, revisar la misma en el original]. Chagas disease (American trypanosomiasis) is the parasitic disease with the greatest health impact in Latin America and a growing health problem in non-endemic countries due to migratory flows. A major limitation for the evaluation of the efficacy of treatment with benznidazole in the chronic phase of Trypanosoma cruzi infection is the lack of reliable tools for assessing treatment outcome in the short term. Complete conversion to negative serology using standard tests can take more than 10 years and is achieved in less than 40% of treated subjects. It is unknown whether the antibodies detected in the circulation of chronically infected subjects derive from naïve B cells or memory B lymphocytes that continually differentiate into plasmablasts in the phase of parasite persistence, or from long-lived plasma cells that persist for a long time in the absence of antigen. Because plasmablasts are rarely present in the circulation in the absence of antigen or of viable replicating pathogens, measurement of T. cruzi-specific plasmablasts after anti-parasite treatment could provide a rapid assessment of treatment efficacy relative to the measurement of T. cruzi-specific antibodies, whose decay can be masked by antigen-independent persistence of antibodies derived from long-lived plasma cells. In this work we propose to measure the levels of antibody-secreting B lymphocytes and memory B cells in the circulation of adult and pediatric patients with chronic Chagas disease using the ELISPOT assay prior to receiving treatment with benznidazole and at different post-treatment times. The changes in the B lymphocyte populations were correlated with the serological outcome of treatment measured by conventional and unconventional serologic techniques. Using a flow cytometry staining method and fluorochrome-labeled recombinant T. cruzi proteins as "baits," we analyzed the phenotype of T. cruzi-specific B cells. Finally, the functional capacity of the different subpopulations of B lymphocytes in the circulation of patients with different degrees of cardiac dysfunction was evaluated. Most individuals infected with T. cruzi had antibody-secreting cells (i.e., plasmablasts) specific for a T. cruzi lysate in their circulation, and these cells disappeared after benznidazole treatment only in those patients who showed decreased levels of parasite-specific antibodies (either complete negativization of serology or a significant decay of titers), but not in those patients with unaltered antibody levels. T. cruzi-specific memory B cells generally exhibited lower prevalence prior to treatment in adults and children and these levels did not improve after therapy regardless of treatment outcome. In subjects with declining serology (i.e., regarded as successful treatment outcome), the decay in antibody secreting B cells correlated with the decrease in T. cruzi-specific antibodies using the multiplex technique and preceded the decline in antibody levels by conventional serologic tests. B cells specific for T. cruzi recombinant proteins are mainly comprised of atypical memory cells, resting naïve cells, and plasmablasts. An abnormal distribution of total B cells, particularly an increase in the frequency of atypical memory B cells and plasmablasts in both adults and children infected with T. cruzi was observed prior to treatment and the phenotype returned to a non-infection profile after successful treatment. After polyclonal stimulation, atypical memory B cells had a low capacity to secrete IL-6 and TNF-α, while activated naïve B cells and CD27+CD21+HLADR+ B cells had the highest capacity to produce inflammatory cytokines. Taken together, these findings show the feasibility of detecting T. cruzi-specific B cells in the chronic phase of Chagas disease. The slow decrease in the levels of parasite-specific antibodies after treatment may be due to the presence of long-lived B plasma cells confirming the hypothesis of this thesis. Chronic T. cruzi infection also induced alterations in B-cell differentiation and function. Monitoring of parasite specific antibody-secreting cells would serve as a useful tool to determine treatment efficacy in clinical trial protocols [fórmula aproximada, revisar la misma en el original]. Fil: Cesar, Gonzalo Leandro. Universidad de Buenos Aires. Facultad de Ciencias Exactas y Naturales; Argentina.

La severidad de la enfermedad cardíaca en pacientes con enfermedad de Chagas crónica se asocia con el proceso de agotamiento de las células T. Las alteraciones en la vía IL-7/IL-7R constituyen uno de los mecanismos intrínsecos de agotamiento inmune, con potenciales consecuencias sobre la proliferación, diferenciación y mantenimiento de los linfocitos T. Luego de la activación del IL-7R se produce una regulación diferencial de sus componentes; mientras que la cadena α específica (CD127) es regulada negativamente, la cadena γc (CD132) aumenta su expresión. A través de la activación del IL-7R se fosforila el factor de transcripción STAT5, induciendo luego distintas vías regulatorias, como la expresión de la molécula de sobrevida Bcl-2 y de la cadena α del receptor de IL-2 (CD25). En este trabajo, evaluamos si la capacidad de las células T para secretar IFN-γ en respuesta a Trypanosoma cruzi está asociada con la expresión y funcionalidad del IL-7R. Las células mononucleares de sangre periférica de pacientes con enfermedad de Chagas crónica y controles no infectados se examinaron para detectar las frecuencias de células productoras de IFN-γ específicas para T. cruzi, medidas por ELISPOT, y la expresión y funcionalidad del IL-7R, utilizando citometría de flujo. También se evaluaron los niveles séricos de IL-7 e IL-7R soluble, así como también de otras citocinas que activan STAT5 (como IL-21 e IL-27) y citocinas inflamatorias, que pueden afectar el funcionamiento del eje IL-7/IL-7R. Los pacientes que presentaban en circulación células productoras de IFN-γ específicas para T. cruzi (denominados pacientes productores de IFN-γ) mostraron niveles más altos de células T de memoria que han modulado la cadena CD127 y una respuesta eficiente a la citocina, comparado con los pacientes que carecían de células T específicas para el parásito (denominados pacientes no productores de IFN-γ). Los pacientes productores de IFN-γ también mostraron bajos niveles de IL-7R soluble, bajos niveles basales de células T CD25+ activadas y niveles basales de expresión de Bcl-2 comparable a los controles no infectados. La modulación del IL-7R se asoció inversamente con los niveles séricos de IL-6 y positivamente con los niveles séricos de IL-8. Los niveles circulantes de IL-21 e IL-27 se encontraron disminuidos en formas clínicas menos severas de la enfermedad. Debido a que se observaron niveles disminuidos de IL-27 principalmente en pacientes productores de IFN-γ en estadios menos severos de la enfermedad y que esta citocina cumple un rol importante en la función de las células T, se evaluó la expresión y función del receptor de IL-27 (IL-27R). En pacientes que mostraban menor grado de disfunción cardíaca, la expresión del IL-27R fue menor en las células T CD4+ y mayor en las células T CD8+ , en comparación con los individuos no infectados. La fosforilación de STAT1, STAT3 y STAT5, y la expresión génica de TBX21, GZMB, EOMES y MIG, en respuesta a la rhIL-27, fueron bajas, especialmente entre los pacientes con disfunción cardíaca. La expresión del IL-27R en las células T de memoria y el nivel de fosforilación de STATs en respuesta a la citocina se asociaron con la magnitud de la respuesta celular T específica para T. cruzi. Cuando se evaluó si era posible aumentar la respuesta T específica para T. cruzi, el tratamiento in vitro con rhIL-7 o rhIL-27 fue solo eficiente entre los pacientes productores de IFN-γ. Las alteraciones de los ejes IL-7/IL-7R e IL27/IL27R se relacionaron con la baja producción de IFN-γ específica para T. cruzi. Estas alteraciones podrían ser responsables del proceso de agotamiento inmune observado en la enfermedad de Chagas crónica, y por lo tanto la pérdida de las células T específicas de T. cruzi durante la infección crónica. Fil: Natale, Maria Ailen. Dirección Nacional de Instituto de Investigación. Administración Nacional de Laboratorio e Instituto de Salud “Dr. C. G. Malbrán”. Instituto Nacional de Parasitología "Dr. Mario Fatala Chaben”; Argentina

Tesis (Doctora en Ciencias Químicas) - - Universidad Nacional de Córdoba. Facultad de Ciencias Químicas, 2019 La enfermedad de Chagas, causada por el parásito Trypanosoma cruzi, es la mayor causa de enfermedad cardíaca y de muertes por problemas cardiovasculares en áreas endémicas localizadas en América Latina. Cada año ocurren aproximadamente 12.000 muertes atribuidas a la severidad de la cardiopatía crónica ocasionada por la enfermedad de Chagas (CCC). Es bien aceptado que tanto la persistencia del parásito como la excesiva respuesta inmune inflamatoria generada por la infección, poseen un rol fundamental en el desarrollo de la CCC. Las vías de señalización Wnt son esenciales para el desarrollo y diversos procesos biológicos. Se ha descripto que las proteínas Wnt son secretadas por macrófagos (Mo) y células dendríticas (CDs) luego de la señalización inducida por receptores TLR y citoquinas pro-inflamatorias. En estas células, la señalización mediada por Wnt / -catenina (canónica) y Wnt / Ca++ está asociada a un perfil tolerogénico, la secreción de citoquinas anti-inflamatorias y la inducción de células T regulatorias (Treg). Además, en los últimos años se ha demostrado que las vías Wnt se encuentran involucradas en la regulación de procesos inflamatorios y que componentes de estas vías son modulados en una gran variedad de patologías cardíacas. En este trabajo de tesis se investigó el rol de las vías de señalización Wnt en la modulación de la respuesta inflamatoria / tolerogénica, el control de la replicación del parásito y el desarrollo de CCC. Se demostró que la infección por Trypanosoma cruzi induce la activación de las vías Wnt / β-catenina y Wnt / Ca++ en Mo y que esta activación es crítica para sostener la replicación parasitaria in vitro, ya que el tratamiento con inhibidores de la vía Wnt / β-catenina o de la secreción de proteínas Wnt limitó la replicación intracelular del parásito. La inhibición resultó en la activación de mecanismos que promueven el control de la replicación intracelular del parásito mediante la inducción de la secreción de citoquinas pro-inflamatorias, la activación de la enzima IDO y la inhibición de la enzima arginasa. De manera similar, la inhibición farmacológica in vivo de la secreción de proteínas Wnt con IWP-L6, fue capaz de controlar la replicación del parásito y mejorar la sobrevida de ratones B6 infectados. Además, se demostró que el mismo tratamiento promueve la resistencia a la infección y modula la respuesta específica de tipo Th2, característica de ratones BALB/c, hacia una respuesta protectora de tipo Th1 a la vez que disminuye la función supresora de células Treg. Asimismo, Finalmente, el tratamiento in vivo con IWP-L6 previno el desarrollo de la patología cardíaca en los ratones BALB/c infectados. Los hallazgos de esta tesis contribuyen al entendimiento de mecanismos celulares que pág. 9 orquestan diferentes señales que promueven una respuesta inmune efectiva capaz de restringir la replicación parasitaria y prevenir la inmunopatología cardíaca asociada a la enfermedad de Chagas crónica. Estos hallazgos contribuyen aportes para el diseño de nuevas estrategias terapéuticas para ser utilizadas solas o combinadas con otras drogas para el tratamiento de esta infección. 2022

Tesis (Doctora en Ciencias Químicas) - - Universidad Nacional de Córdoba. Facultad de Ciencias Químicas, 2018. Los linfositos B, además de producir anticuerpos, son capaces de presentar Antigenos T. El Rituximab es un anticuerpo citoquinas, a través de las cuales pueden regular la respuesta deimab" es un anticuerpo anti-CD20 que se utiliza para el tratamiento patologias que efectivamente elimina la población de linfocitos B. En un En respuestas uestro laboratorio reportamos la capacidad que tienen los linfocitos - i erleuquina (IL) 17A durante la infección experimental con i, patógeno causal de la enfermedad de Chagas, así como otras uesta inmune protectora contra T. cruzi depende fuertemente de 8+. Para evaluar si los linfocitos B podrían modular la respuesta de T durante la infección con T. cruzi implementamos un modelo de --=:::,...==-'-.L == estas células, mediante una única inyección del anticuerpo monoclonal I la CD20, 8 días previos a la infección. Pudimos observar a los 20 días ~~:~-: ( pi) que los animales depletados presentaban un aumento significativo isular en diferentes órganos blancos de la infección, en comparación . 01 infectado. Además, los animales depletados de linfocitos B e cresentaron un porcentaje y número significativamente menor de linfocitos -= es y específicos contra el antígeno Tskb20, en comparación al grupo - éado. La respuesta de linfocitos T CD8+ con fenotipo de memoria y = - ontraba significativamente disminuida en el grupo de animales carentes ==-='::=5:' ,en comparación con el grupo control, determinado a los 20 dpi. rte, el estudio de las características fenotípicas y funcionales reflejó que en - ocitos B, los linfocitos T CD8+ proliferaban menos, mostraban un perfil una mayor apoptosis celular y presentaban un aumento de receptores comparación con el grupo control. Posteriormente, observamos que en linfocitos B la funcionalidad de los linfocitos T CD8+ se encontraba _ os mismos resultados fueron observados cuando la depleción de e realizada en animales donde la respuesta de linfocitos T CD8+ ya se liado casi en su totalidad (12 dpi), sugiriendo que los linfocitos B están la respuesta de los linfocitos T CD8+ a través del sostenimiento de su y/o sobrevida. Adicionalmente, encontramos que la frecuencia de icas productoras de IL-17A estuvo significativamente disminuida en los ados depletados de linfocitos B. Finalmente, la inyección de IL-17A '""="--,-- - e rescató la frecuencia, el fenotipo y la función de los linfocitos T CD8+ ~:e::=-.::::- e- la ausencia de linfocitos B. Los resultados indican que la producción de . arte de los linfocitos B o por aquellas células productoras de IL-17A que iadas por los linfocitos B, es clave para el mantenimiento y la función de =:;::;:r:os T CD8 + específicos de T. cruzi. a es: linfocito B, linfocito T CD8+, Trypanosoma cruzi, anti-CD20, IL-17A. 2020-12-31 Fiocca Vernengo, Facundo. Universidad Nacional de Córdoba. Facultad de Ciencias Químicas; Argentina. Gruppi, Adriana. Universidad Nacional de Córdoba. Facultad de Ciencias Químicas. Departamento de Bioquímica Clínica. Consejo Nacional de Investigaciones Científicas y Técnicas. Centro de Investigaciones en Bioquímica Clínica e Inmunología; Argentina. Caputto, Beatriz Leonor. Universidad Nacional de Córdoba. Facultad de Ciencias Químicas. Departamento de Química Biológica. Consejo Nacional de Investigaciones Científicas y Técnicas. Centro de Investigaciones en Química Biológica de Córdoba; Argentina. Ropolo, Andrea Silvana. Universidad Nacional de Córdoba. Facultad de Ciencias Químicas. Consejo Nacional de Investigaciones Científicas y Técnicas. Instituto de Investigación Médica Mercedes y Martín Ferreyra; Argentina. Stempin, Cinthia Carolina. Universidad Nacional de Córdoba. Faculta de Ciencias Químicas. Consejo Nacional de Investigaciones Científicas y Técnicas. Centro de Investigaciones en Bioquímica Clínica e Inmunología; Argentina. Laucella, Susana Adriana. Consejo Nacional de Investigaciones Científicas y Técnicas. Instituto Nacional de Parasitología Dr. M. Fatala Chaben; Argentina.

La enfermedad de Chagas, causada por el parasito protozoario intracelular Trypanosoma cruzi, afecta alrededor de 8 a 10 millones de personas desde el Sur de California hasta Sudamérica y Europa occidental. A pesar de ser la causa más frecuente de cardiomiopatía infecciosa del mundo, pocas personas infectadas reciben tratamiento. La mayor limitación para desarrollar nuevas drogas y evaluar su eficacia reside en la falta de ensayos que permitan determinar de manera confiable la carga parasitaria y la eliminación definitiva del parásito. Diversos estudios de nuestro laboratorio, incluyendo el presente trabajo, han demostrado que los linfocitos T periféricos específicos de T. cruzi en pacientes con enfermedad de Chagas crónica muestran características funcionales y fenotípicas de células efectoras o de memoria efectora con baja capacidad de proliferación homeostática y requieren, por lo tanto, del estímulo antigénico para permanecer en circulación. De esta forma, es de esperar que los cambios en la carga parasitaria inducidos por el tratamiento etiológico se vean reflejados en alteraciones en la respuesta celular T. En el presente trabajo, se determinó en forma periódica la frecuencia de linfocitos T periféricos específicos de T. cruzi, los títulos de anticuerpos específicos de T. cruzi y el estado clínico en 43 voluntarios adultos con infección crónica por T. cruzi bajo tratamiento con benznidazol durante un período de seguimiento de tres años. Estas mediciones fueron comparadas con valores previos al tratamiento y con valores obtenidos a partir de un grupo control no tratado. La frecuencia de linfocitos T periféricos específicos de T. cruzi productores de IFN-γ disminuyó significativamente luego del transcurso de un año de inicio del tratamiento con benznidazol en la mayoría de los pacientes estudiados, alcanzando posteriormente valores por debajo del límite de detección en gran parte de los pacientes tratados. Llamativamente, esta disminución fue en muchos casos precedida por un incremento significativo en la frecuencia de linfocitos T específicos de T. cruzi productores de IFN-γ con fenotipo efector o de memoria efectora entre dos y seis meses luego del tratamiento. Por el contrario, la frecuencia de linfocitos T periféricos específicos de T cruzi permaneció relativamente estable en ausencia de tratamiento. A pesar de las alteraciones significativas en la respuesta celular T, solo 6 de 43 pacientes tratados con benznidazol mostraron seroconversiones a valores negativos de los títulos de anticuerpos específicos de T. cruzi y solo 3 pacientes mostraron progresión hacia estadios clínicos mas avanzados de la enfermedad. Sin embargo, estos últimos son resultados esperables, teniendo en cuenta que el período de seguimiento fue relativamente corto. Un seguimiento similar fue llevado a cabo en un grupo de 15 voluntarios adultos con infección crónica por T. cruzi sometidos a un esquema novedoso de tratamiento combinado secuencial con alopurinol seguido de benznidazol. La frecuencia de linfocitos T periféricos específicos de T. cruzi productores de IFN-γ se vio también significativamente afectada por el tratamiento combinado; observándose una disminución inmediatamente después de la administración de alopurinol, así como luego de la finalización del tratamiento combinado con la administración de benznidazol. Más aún, el tratamiento con alopurinol promovió un aumento significativo en el porcentaje de linfocitos T vírgenes totales en periferia, acompañado de una disminución significativa en los niveles de activación de la población total de linfocitos T determinada por la expresión del marcador de activación HLA-DR. Este fenómeno se mantuvo luego del tratamiento con benznidazol. Si bien ninguno de los pacientes estudiados mostró seroconversión completa a valores negativos durante el período de seguimiento, un análisis más exhaustivo de los datos mostró que los títulos de anticuerpos específicos de T. cruzi disminuyeron significativamente luego de finalizado el tratamiento combinado. Estudios in vitro con una variedad de antígenos y el mitógeno PMA mostraron que el alopurinol ejerce un efecto directo en la activación de linfocitos T humanos. De esta forma, el aumento en el porcentaje de linfocitos T vírgenes totales en periferia y la disminución de la expresión del marcador de activación HLA-DR luego del tratamiento con alopurinol podría explicarse por un efecto inmunomodulador directo del alopurinol sobre el sistema inmune del huésped, una disminución en la carga parasitaria, o por una combinación de ambos efectos. El efecto antiinflamatorio del alopurinol podría ser beneficioso para prevenir el desarrollo de alteraciones cardiacas, previamente asociadas con el proceso de inflamación crónica en la enfermedad de Chagas. En conclusión, tanto el tratamiento clásico con benznidazol así como el esquema novedoso de tratamiento combinado secuencial con alopurinol seguido de benznidazol generaron un marcado impacto sobre el sistema inmune específico de T. cruzi en pacientes con enfermedad de Chagas crónica. Estos resultados son altamente indicativos de eficacia terapéutica y cura parasitológica en un conjunto sustancial de pacientes. Chagas disease, caused by the intracellular protozoan parasite Trypanosoma cruzi, affects around 8 to 10 million people from Southern California to South America and Western Europe. In spite of being the most common cause of infectious cardiomyopathy in the world, few infected subjects receive any treatment. The major limiting factor in developing and evaluating potential new drugs for their efficacy is the lack of reliable tests to assess parasite burden and elimination. Several studies from our research group, including the present work, have demonstrated that T. cruzi-specific T cells in chronically T.cruzi-infected subjects display phenotypic features of effector/effector memory cells that lack homeostatic proliferation capability and rely on antigenic stimulation to remain in circulation. Therefore, it can be reasoned that changes in parasite-load induced by etiological treatment might be reflected in alterations of T cell responses. T. cruzi-specific T cells and antibodies, as well as the clinical status, were measured periodically over a 3-year follow-up period in 43 adult volunteers with chronic T. cruzi infection under treatment with benznidazole. These measurements were compared with pre-treatment conditions and with values in an untreated control group. The frequency of peripheral IFN-γ-producing T cells specific for T. cruzi declined as early as 12 months after the benznidazole treatment was administered and subsequently became undetectable in a substantial proportion of treated subjects. The shift to negative IFN-γ T cell responses was highly associated with an early increase in IFN-γ-producing T cells with phenotypic features of effector/effector memory cells in a subset of subjects. Conversely, the frequency of peripheral T. cruzi-specific T cells remained relatively stable in the absence of treatment. Not surprisingly, given the relatively short follow-up period, in only 6 out of 43 treated subjects the results of conventional serological tests became negative during the follow-up period. In addition, only 3 subjects exhibited progression in the assessment of disease severity during the follow-up period (2 in the benznidazole-treated group and 1 in the untreated group). A similar follow-up study was also conducted on a group of 15 adult volunteers with chronic T. cruzi infection who submitted to a novel combined sequential treatment with allopurinol followed by benznidazole. The frequency of peripheral IFN-γ-producing T. cruzi-specific T cells was highly affected by the combined treatment; the impact was registered early after allopurinol administration, as well as after the completion of the combined treatment. In addition, the treatment with alopurinol promoted an increase in the frequency of total peripheral naïve T cells and a decrease in the frequency of total T cells expressing the activation marker HLA-DR. These observations were sustained after the completion of the combined treatment with benznidazole administration. Although none of the subjects studied showed complete seronegative conversion during the follow-up period, the levels of T. cruzi- specific antibodies significantly decreased after completion of the combined treatment. In vitro studies using a variety of antigens as well as mitogen showed that allopurinol exerted a direct effect on T cell activation. Thus, the early improvement in total naïve T cells and the decrease in the expression of the activation marker HLA-DR after alopurinol treatment may be explained either as a direct effect of allopurinol on the host immune system or by a decrease in parasite load, or a combination of both effects. The anti-inflammatory effect of alopurinol could be beneficial in preventing the development of cardiac symptoms, previously associated with the process of chronic inflammation in Chagas disease. In summary, benznidazole treatment, as well as a novel combined sequential treatment with allopurinol followed by benznidazole, during chronic Chagas disease have a substantial impact on parasite-specific immune responses that is likely indicative of treatment efficacy and cure. Fil: Pérez Mazliah, Damián Eduardo. Universidad de Buenos Aires. Facultad de Ciencias Exactas y Naturales; Argentina.