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Recent literature on the differential role of genes within networks, including the omnigenic model, distinguishes core from peripheral genes in the layout underlying phenotypes. Cores are typically few, each of them highly contributes to phenotypic variation, but because they are so few, they altogether only explain a small part of trait heritability. In contrast, peripherals, each of small influence, are so numerous that they finally lead phenotypic variation. We collected and sequenced RNA from 459 European black poplars and built co-expression networks to define core and peripheral genes as the most and least connected ones. We computed the role of each of these gene sets in the prediction of phenotypes and showed that cores contribute additively to phenotypes, consistent with a downstream position in a biological cascade, while peripherals interact to influence phenotypes, consistent with an upstream position. Quantitative and population genetics analyses further revealed that cores are more expressed than peripherals but they tend to vary less and to be more differentiated between populations suggesting that they are more constrained by natural selection. Our work is the first attempt to integrate core and peripheral terminologies from co-expression networks and omnigenic theory. In the end, we showed, that there seems to be a strong overlap between them, with core genes from co-expression networks likely being a mixture of integrative hubs with a direct effect on phenotype in agreement with the omnigenic theory, and master regulators which control the overall metabolic flow towards the phenotype.

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National audience; Le peuplier noir (Populus nigra) est une espèce majeure de la forêt alluviale en Europe occidentale et un support de la biodiversité écosystémique. Pour explorer les composantes de la variabilité génétique au sein de cette espèce parentale de peupliers hybrides commerciaux, nous avons initié une approche intégrative combinant des données génomiques, transcriptomiques et phénotypiques dans une vaste collection d'individus échantillonnés à partir de populations naturelles et évalués dans un même site expérimental. De par leur grande abondance et facilité d’accès par séquençage, les SNPs (Single Nucleotide Polymorphisms) sont des marqueurs moléculaires de choix pour les études de génétique quantitative (incluant les études d’association), de génétique des populations ou de sélection génétique. Chez le peuplier noir, si les premières études de polymorphismes de séquence se sont focalisées sur le reséquençage de quelques gènes candidats [1,2,3] ou sur l’identification de variants rares [4], des travaux plus récents se sont intéressés à une analyse plus globale avec le développement d’une puce de génotypage à partir de SNPs détectés par séquençage de génomes complets [5]. Nous rapportons ici l'analyse de polymorphismes SNPs dans des séquences transcrites produites par RNA-seq. Plus précisément, nous présentons un pipeline de détection et de typage de SNPs à partir de données RNA-seq ainsi que sa validation grâce à des données déjà existantes. L'ARN a été extrait à partir de jeune xylème et de cambium recueillis sur 24 arbres correspondant à 2 répétitions de 12 génotypes originaires de 6 populations naturelles représentatives de l’aire de distribution de l'espèce en Europe occidentale. Après quantification de l'ARN par tissu, les ARNs de xylème et de cambium du même arbre ont été mélangés et soumis à un séquençage à haut débit sur un HiSeq2000 d’Illumina (séquences pairées de 100 pb). Nous avons mis en place un pipeline de détection de SNPs à partir de données RNA-seq. Les séquences ont d'abord été nettoyées puis alignées sur le génome de référence (Populus trichocarpa). Ensuite, nous avons effectué un post-traitement des données d’alignement et nous avons lancé la découverte de variants à l’aide 3 outils en plusieurs modes, combinés à plusieurs paramètres de filtration. Les résultats obtenus par ces différentes techniques ont été comparés. Enfin, les SNPs détectés par les différents outils ont été annotés. Pour valider la technique, nous avons comparé les génotypes trouvés à des résultats de génotypage issus d’une puce Illumina Infinium 12k fournissant 7 903 SNPs polymorphes et qui avait été utilisée pour génotyper une collection de peupliers noirs incluant nos 12 génotypes étudiés [5]. Le taux moyen de similarité de génotypage aux positions communes entre les SNPs de la puce et ceux trouvés par RNA-seq (d’un même individu) est supérieur à 98%. Ces résultats démontrent la faisabilité et l’intérêt du RNA-seq pour la découverte et le typage de SNPs dans des populations naturelles.

National audience; Le peuplier noir (Populus nigra) est une espèce majeure de la forêt alluviale en Europe occidentale et un support de la biodiversité écosystémique. Pour explorer les composantes de la variabilité génétique au sein de cette espèce parentale de peupliers hybrides commerciaux, nous avons initié une approche intégrative combinant des données génomiques, transcriptomiques et phénotypiques dans une vaste collection d'individus échantillonnés à partir de populations naturelles et évalués dans un même site expérimental. De par leur grande abondance et facilité d’accès par séquençage, les SNPs (Single Nucleotide Polymorphisms) sont des marqueurs moléculaires de choix pour les études de génétique quantitative (incluant les études d’association), de génétique des populations ou de sélection génétique. Chez le peuplier noir, si les premières études de polymorphismes de séquence se sont focalisées sur le reséquençage de quelques gènes candidats [1,2,3] ou sur l’identification de variants rares [4], des travaux plus récents se sont intéressés à une analyse plus globale avec le développement d’une puce de génotypage à partir de SNPs détectés par séquençage de génomes complets [5]. Nous rapportons ici l'analyse de polymorphismes SNPs dans des séquences transcrites produites par RNA-seq. Plus précisément, nous présentons un pipeline de détection et de typage de SNPs à partir de données RNA-seq ainsi que sa validation grâce à des données déjà existantes. L'ARN a été extrait à partir de jeune xylème et de cambium recueillis sur 24 arbres correspondant à 2 répétitions de 12 génotypes originaires de 6 populations naturelles représentatives de l’aire de distribution de l'espèce en Europe occidentale. Après quantification de l'ARN par tissu, les ARNs de xylème et de cambium du même arbre ont été mélangés et soumis à un séquençage à haut débit sur un HiSeq2000 d’Illumina (séquences pairées de 100 pb). Nous avons mis en place un pipeline de détection de SNPs à partir de données RNA-seq. Les séquences ont d'abord été nettoyées puis alignées sur le génome de référence (Populus trichocarpa). Ensuite, nous avons effectué un post-traitement des données d’alignement et nous avons lancé la découverte de variants à l’aide 3 outils en plusieurs modes, combinés à plusieurs paramètres de filtration. Les résultats obtenus par ces différentes techniques ont été comparés. Enfin, les SNPs détectés par les différents outils ont été annotés. Pour valider la technique, nous avons comparé les génotypes trouvés à des résultats de génotypage issus d’une puce Illumina Infinium 12k fournissant 7 903 SNPs polymorphes et qui avait été utilisée pour génotyper une collection de peupliers noirs incluant nos 12 génotypes étudiés [5]. Le taux moyen de similarité de génotypage aux positions communes entre les SNPs de la puce et ceux trouvés par RNA-seq (d’un même individu) est supérieur à 98%. Ces résultats démontrent la faisabilité et l’intérêt du RNA-seq pour la découverte et le typage de SNPs dans des populations naturelles.

Takeuchi M, Guedes FTP, Laurans F, Lesage-Descauses MC, Boizot N, Lainé-Prade V, Secerovic A, Leplé JC, Déjardin A, Pilate G (2017) Characterization of a poplar GM tree with strong alterations in growth and wood anatomy: transgene expression level vs insertion site effects? IUFRO TREE BIOTECHNOLOGY ‘More Sustainable and Productive Forest’, Concepción (Chile) 4-9 June 2017, communication orale.; Characterization of a poplar GM tree with strong alterations in growth and wood anatomy: transgene expression level vs insertion site effects?. IUFRO Tree Biotech 2017

Ćosić M, Laurans F, Grand-Perret C, Lainé-Prade V, Lesage-Descauses M-C, Pilate G, Déjardin A (2017) Development of an innovative in planta transformation method in poplar. IUFRO TREE BIOTECHNOLOGY ‘More Sustainable and Productive Forest’, Concepción (Chile) 4-9 June 2017, communication orale; Development of an innovative in planta transformation method in poplar. IUFRO Tree Biotech 2017

Lignocellulosic biomass from cultivated poplars is a renewable resource of interest for the production of bio-energy. To improve this complex trait, it is essential to better understand the genetic factors that affect its variation. Within this context, to explore the components of genetic variability within a parental species of commercial hybrid poplars, we have initiated an integrative approach combining genomic, transcriptomic and phenotypic information in a large collection of individuals sampled from natural populations and raised in a clonal field trial.Here, we report the analysis of polymorphism within transcriptomic sequences produced by RNA-seq. RNA was extracted from young differentiating xylem and cambium collected on 24 3-years old trees corresponding to 2 replicates of 12 genotypes from 6 natural populations representative of the geographical distribution of the species in Western Europe. After RNA quantification, the RNA from xylem and cambium from the same tree were pooled and subjected to high-throughput sequencing on an Illumina HiSeq 2000 using 100 bp paired-end indexing runs. All the samples were sequenced on one Illumina flow-cell, yielding around 18 million of pairedend reads per sample.The sequences were first trimmed (quality and length) and aligned to the Populus trichocarpa v3 assembly using BWA-MEM. Around 99.7% of the reads mapped against the reference genome and 93.3% properly mapped despite the fact that the genome is from a different species. Then, we performed a mapping filtering for duplicated sequence reads after alignment to the genome with Picard tools to mitigate biases introduced by data generation steps such as PCR amplification. We also performed local realignment around indels and recalibrated the base quality scores with GATK. The variant discovery process was based on several variant callers (GATK, VarScan, FreeBayes) with several filtering parameters (VCF tools). We compared the genotype calls to those previously obtained with a SNP array (Faivre-Rampant et al, 2016) in order to choose the optimal variant caller and the SNP filtering parameters (depth, quality).The usefulness and relevance of the resulting SNPs for population genomic studies was further assessed by analyzing: (i) genomewide patterns of nucleotide diversity, (ii) population structure, and (iii) linkage disequilibrium. The SNPs have also been annotated in order to estimate Ka/Ks ratio, with a particular focus on candidate genes involved in the control of lignocellulosic biomass production and quality.This promising approach is currently being extended to 240 genotypes in order to validate the genomics patterns identified in the present study.

Lignocellulosic biomass is a renewable resource of interest for biorefinery. However, current poplar varieties have not been selected for this specific purpose. The factors affecting biomass yield and chemical properties need thus to be studied. With this objective, we have initiated a systems biology approach, integrating genomic, transcriptomic and phenotypic data in natural populations of black poplar (Populus nigra). Up to now, we have focused on a subset of 12 genotypes from 6 populations and trialled in a randomized complete block design located at INRA Orléans, France. The transcriptome of 2 biological replicates of each genotype has been explored through RNA sequencing (RNAseq) of pools of young differentiating xylem and cambium. Additionally, biomass yield was evaluated through measurements of height and diameter on 6 replicates of each genotype across several years and rotations, while biomass propertieswere assessed through chemical analyses of lignin, cellulose and hemicellulose concentrations as well as saccharification potential on 3 replicates of each genotype. The resulting data were used to build a weighted gene co-expression network and identify gene modules whose expression was correlated with biomass yield and/or quality at the genotypic level. Remarkably, the largest module (1,460 transcripts) was significantly associated with klason lignin content and displayed an enrichment in genes involved in secondary cell wall formation. Four candidate genes from this module were further selected to validate the detected quantitative trait transcripts (QTTs) on 2 new replicates of the 12 genotypes using RT-qPCR. The resulting expression levels were significantly correlated to those previously quantified by RNAseq and to the klason lignin content in the wood samples. These results demonstrate the interest of our approach, and thus open some prospects towards the identification of new candidate genes whose functions remain to be elucidated.

International audience; Plant R2R3-MYB transcription factors play an important role in plant secondary cell wall formation, by activating or repressing their target genes in a coordinated manner within a complex regulatory network. They belong to a large gene family - 180 genes in poplar -, with some members already identified as master switches in the regulation network (Zhang et al, 2014). Here, we combined genetic engineering and chromatin immuno-precipitation technique (ChIP-SEQ) in order to elucidate the function of 2 R2R3-MYB transcription factors in poplar, MYB090 and MYB156. MYB090 potentially regulates a high number of target genes in planta through a highly conserved motif, similar to GAMYB. These target genes are involved in the biosynthetic pathways of lignin, cellulose and xylans, which are the major components of secondary cell walls. Overexpression of MYB090 in poplar reduced stem growth and its total lignin content; lignification was severely impacted in wood parenchyma rays. By contrast, overexpression of MYB156 in poplar showed no growth defect, at least for some transgenic lines, while the total lignin content was decreased of 15% in the stem. These plants contained hypolignified fibers while the lignification of vessels seemed unaffected. These different results led to the conclusion that both MYB factors are transcriptional repressors of lignification, but act at different levels of the regulatory network. This work opens new avenues on the building of transcriptional regulatory networks involved in secondary cell wall formation. It also generated new poplar transgenic lines with interesting traits for bioethanol production. This work was carried out in the frame of AMC2B Région Centre Project and TreeForJoules Plant KBBE Project. WL received a PhD fellowship from Région Centre and INRA-EFPA.

Angiosperm trees are able to reorient their axes thanks to their capacities to differentiate tension wood on the upper side of stems and branches. In poplar, tension wood fibres develop an extra cell wall layer, named G-layer, responsible for the peculiar mechanical properties of tension wood. G-layer is composed of highly crystalline cellulose microfibrils embedded in a polysaccharide/glycoprotein matrix devoid of lignin. During the G-layer deposition, cellulose microfibrils get oriented parallel to the fibre axis and placed under the state of high tensile stress. Chitinase-like proteins (CTL) have been proposed to play different roles in plant growth and development. Genes encoding CTL have been associated to cellulose synthesis and their mutation causes ectopic deposition of lignin. Transcripts of CTL2 gene were shown to be highly abundant in differentiating tension wood (Déjardin et al., 2004). Its homologue in Arabidopsis is specifically expressed in stems and co-expressed with the CesA genes involved in cellulose synthesis in secondary cell walls (Persson et al., 2005). In our study, we investigated potential function of CTL2 in the formation and mechanical properties of tension wood. Expression of CTL2 was quantified in different tissues and the effects of CTL2 down-regulation have been characterized in GM poplar trees. CTL2 gene appeared highly expressed in xylem with no difference in expression between tension and opposite wood. Downregulation of CTL2 did not seem to impact growth and development of trees in greenhouse conditions. However, stems appeared to be highly breakable in the transverse direction. Anatomical observations of xylem showed altered formation of Glayers in vessel-surrounding fibres in transgenic poplars. Further analyses indicated a substantial increase in wood lignin content. Cellulose crystallinity, microfibril angle and stem mechanical properties are currently assessed. Results will be presented and discussed in the light of present hypothesis regarding CTL2 function in plant development.

Découverte de variants (SNPs) et génotypage à partir de données RNA-seq chez le peuplier noir. Colloque EPGV 2016 "Détection, Gestion et Analyse du Polymorphisme des Génomes Végétaux"

National audience; Maritime pine is a major forest tree in southern Europe for sustainable delivery of bio-based products through advanced plantation forestry of improved varieties. Early selection is needed to reduce breeding cycle and accelerate variety deployment in the context of climate change. Both gene(s) and genome-wide information should provide opportunities for predictive, marker-assisted selection. Reverse genetics, defined as ectopic expression or silencing of candidate genes can be useful for functional dissection of traits of interest. Functional genomics of 9 transcription factor (TF) genes associated to growth and wood formation (MYB1,8,14,20,23, DOF5, MADBOX4, NACx, NACataf) was initiated in maritime pine through genetic transformation of embryogenic tissue. Twelve TF constructs designed for constitutive overexpression (OE) or silencing (RNAi) were studied: 6 constructs (batch 1) from previous projects (MYB1-RNAi, MYB8-OE/RNAi, MYB14-RNAi, DOF5-OE/RNAi) as well as 3 constructs for putative gene targets of MYB (CAD-RNAi) and DOF5 (GS1a-OE, GS2-OE); and 6 constructs (batch 2) obtained during ProCoGen (MYB23-OE, MYB20-OE, MADBOX4-OE, NACx-OE/RNAi, NACataf-OE). Phosphinothricin-resistant lines could be cryopreserved for all but one (MYB20-OE) constructs. Transformation rate was estimated in the range 9.6-22.0 (OE) or 0.4-18.0 (RNAi) transgenic lines per gram embryogenic tissue (batch 1). Somatic embryos were obtained from 1-3 lines per construct (25 lines in total) and successfully converted to plants (batch 1). Acclimatization rates were similar to controls and transgenic plants were confirmed for most lines. Putative adverse effect of MYB14-RNAi, DOF5-RNAi, and MYB8-OE on transformation rate was observed. DOF5-RNAi apparently stimulated germination rate. Plant growth data and morphology are available for constructs from batch 1 after up to 12 (MYB1-RNAi, MYB8-OE/RNAi, DOF5-OE/RNAi, GS2-OE, GS1a-OE) or 42 months (MYB14-RNAi, CAD-RNAi) growth. Both transgene copy number and targeted gene expression data are available from transgenic plants obtained from MYB14-RNAi and CAD-RNAi lines. Transgenics and controls from batch 1 were sampled at age 16 (MYB1-RNAi, MYB8-OE/RNAi, DOF5-OE/RNAi) or 70 months (MYB14-RNAi, CAD-RNAi). Molecular characterization of MYB1,8,14 and DOF5 plant material has been performed by qPCR and transcriptomic analysis using microarray is underway. Wood analyses have been initiated for MYB14- and CAD-RNAi plants (in progress).

International audience; Plants organs are capable of sensing directional environment stimulus such as light, gravity, water availability and touch. Light and gravity are two of the most important environmental factors affecting plant stem growth and development. During the past 10-15 years, advances in our understanding of the molecular sensing and signaling actors in response to these stimuli have been mainly made in model annual plant. The goal of our study was to decipher the early molecular events operating in poplar wood stem submitted to changes in gravi-stimulation and so, prone to tension wood formation. As light and gravity early signaling may modulate each other we tilted plants in specific isotropic lightening devices enabling to ensure growth but triggering no directional phototropic signal (Fig. 1; Coutand et al., unpublished). Through RNAseq transcriptome profiling, proteomic and phosophoproteomic we identified candidates of the early signaling pathway of tension wood formation in poplar. Prominently, one receptor-like kinase is identified by the different approaches and appears as a good candidate for gravi and/or mechanical signaling. Moreover, several MAP kinases are also identified and could participate to this signaling network. Predicted gene network signaling models will be presented and discussed

National audience; Les arbres angiospermes sont capables d’orienter ou de réorienter leurs axes grâce à la formation d’un bois particulier, le bois de tension, présentant de très fortes contraintes de maturation, et qui se caractérise, chez le peuplier, par la mise en place dans la paroi secondaire des fibres, d’une couche surnuméraire, la couche G. Cette couche est très riche en microfibrilles de cellulose (MFC) orientées parallèlement à l’axe de la fibre. Il a été récemment montré que les fortes contraintes du bois de tension sont supportées par les MFC de cette couche ( Clair et al. 2011), mais il reste à déterminer quel(s) acteur(s) moléculaire(s) est/sont responsable(s) de leur mise en tension. Récemment, la présence d’un gel de très grande porosité a été mise en évidence dans la couche G (Clair et al. 2008) tandis que des expériences en immunolocalisation ont détecté des pectines de type RGI dans cette même couche (Guedes et al. submited). La comparaison des marquages obtenus avec des anticorps soit spécifiques du squelette RGI, soit spécifiques des chaines latérales en β 1-4 galactane, suggère que ces chaînes latérales sont hydrolysées au cours de la maturation de la couche G, comme ce qui est observé dans les fibres périphloémiennes de lin ( Roach et al. 2011), des fibres très similaires aux fibres G du bois de tension. Ainsi, notre hypothèse est que les RGI hydrolysés par une galactosidase formeraient le gel observé et que ce gel est à l’origine de la mise en tension des MFC. Dans cette perspective, nous nous sommes intéressés à déterminer le niveau d’expression de l’ensemble des 23 gènes β-GAL présents sur le génome de Populus trichocarpa, dans le bois de tension et le bois opposé de peuplier (Populus tremula x Populus alba). Seul le gène β-GAL 7 montre une expression spécifique dans le bois de tension chez tous les individus évalués; de façon intéressante, la séquence de β-GAL 7 est l’orthologue de la β-GAL (Luβ-GAL40) identifiée dans les fibres de lin. Cette analyse d’expression est actuellement complétée par une étude plus large sur le niveau d’expression des 23 β-GAL dans différents tissus de peupliers (bourgeon apical, feuilles, racines, graines notamment). De même, nous avons introduit une partie spécifique de la séquence de β-GAL 7 dans le vecteur pHellsgate8 afin de créer des peupliers transgéniques sous-exprimant cette β-GAL 7 par stratégie RNAi et de les évaluer finement pour leur capacité à fabriquer un bois de tension efficace.

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National audience; Lorsqu’un arbre feuillu est incliné en raison d’une contrainte gravitationnelle ou mécanique (vent, sol en pente), il met en place sur la partie supérieure des tiges inclinées, un bois de réaction, appelé bois de tension permettant aux tiges de retrouver une position d’équilibre (bien souvent verticale). Au niveau anatomique, le bois de tension se caractérise par la présence de fibres particulières aux parois très épaisses, appelées fibres G. La paroi des fibres G présente une couche surnuméraire, pauvre en lignines, très riche en cellulose dont les microfibrilles sont orientées quasi parallèlement à l’axe de la fibre. Le bois de tension représente un bon système biologique pour décrypter certains mécanismes importants de la formation du bois. Les facteurs de transcription (FT) jouent un rôle central dans la régulation de ces mécanismes. L’objectif de ces travaux est d’identifier les séquences d’ADN cibles de certains FT choisis (Myb1, Myb21, VND7), potentiellement importants pour la formation du bois. Pour cela, la technique ChIP-SEQ (Immunoprécipitation de chromatine suivie par un séquençage à très haut-débit) a été développée afin d’identifier in vivo ces ADN cibles. Cette technique, bien que souvent employée en biologie animal [1] [2], est encore peu utilisée en biologie végétal. Suite à la ChIP, une analyse qPCR permet de mesurer l’enrichissement des cibles connues afin de vérifier l’efficacité de l’immunoprécipitation, avant de séquencer les échantillons. Actuellement les premiers essais de ChIP, analysés en qPCR, ont permis de valider la méthode, et ont mis en évidence l’enrichissement en un promoteur cible connu pour un des FT choisis. L’avancée des résultats sera présentée lors du congrès.

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Caractérisation de souches de Pasteurella d'origine bovine résistantes aux tétracyclines