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Regulatorische Peptide, zu denen Neuropeptide und Peptidhormone zählen, sind Signalmoleküle, die der Zell-Zell-Kommunikation dienen und an der Kontrolle vielfältiger biologischer Prozesse in Insekten und anderen vielzelligen Tieren beteiligt sind. Wie der Verdauungstrakt von Säugetieren enthält auch der Mitteldarm der Insekten zahlreiche peptidbildende endokrine Zellen, wobei die Diversität der enteroendokrinen Insekten-Peptide deren Bedeutung für den Stoffwechsel, die Energiebalance und die Nahrungsaufnahme erahnen lässt. In der ersten Studie haben wir das Mitteldarm-Peptidom von adulten und larvalen Drosophila melanogaster charakterisiert. Dafür wurden die Peptide aus dem Mitteldarmgewebe extrahiert und anschließend ihre Strukturen mittels LC-MS/MS analysiert. Auf diese Weise konnten wir 24 Peptide identifizieren, die von 9 verschiedenen Peptid-Vorläufermolekülen abstammen. Alle Darmpeptide konnten in identischer Form im ZNS nachgewiesen werden und stellen somit „brain-gut“-Peptide dar. Es wurde bereits gezeigt, dass für die Prozessierung von Neuropeptidhormonen in Drosophila die Subtilisin-ähnliche Proprotein-Konvertase 2 (dPC2, AMON) erforderlich ist. Unsere Ergebnisse legen nahe, dass AMON generell auch für die Bildung von Darmpeptiden benötigt wird. Mit der zweiten Studie konnten wir die Kenntnis von Peptidstrukturen in wichtigen Insekten weiter ausbauen. Wir haben das Peptidom der Kohlmade (d.h. der Larve der Kleinen Kohlfliege Delia radicum) untersucht, welche durch Wurzelfraß bedeutenden landwirtschaftlichen Schaden verursacht. Durch die massenspektrometrische Analyse von ZNS, Neurohämalorganen und Därmen konnten wir 38 Peptide aus diversen Insektenpeptidfamilien charakterisieren. Zudem konnten wir ein neues Peptid identifizieren, das Sequenzähnlichkeit zum Eclosionshormon-Vorläufermolekül bei einigen Drosophila-Arten aufweist. Die immuncytochemische Untersuchung von peptidbildenden Neuronen und enteroendokrinen Zellen zeigte, dass die Verteilung der Peptide in larvalen Drosophila und Delia sehr ähnlich ist. Die gefundenen Übereinstimmungen bei beiden Arten sprechen dafür, dass Drosophila im Hinblick auf die peptiderge Regulation z. B. des Stoffwechsels als genetisch zugängliches Modell für Schadinsekten dienen kann. In Zukunft könnten unsere Ergebnisse für die Entwicklung einer peptidbasierten Strategie zum zielgerichteten Management der Kohlfliege genutzt werden. In der dritten Studie haben wir die Rolle von Allatostatin A (AstA) untersucht – einer Peptidfamilie, die typischerweise in Insekten (und anderen Arthropoden) vorkommt. In vorangegangenen Studien konnte bereits demonstriert werden, dass AstA eine Rolle für die Regulation des Stoffwechsels und der Nährstoffhomöostase in Drosophila spielt. Wir haben uns der Frage gewidmet, ob sich spezifische Effekte auf die Aktivität bestimmter Subsets der zahlreichen bei adulten Taufliegen vorkommenden AstA-produzierenden Zellen zurückführen lassen. AstA-Neurone finden sich in verschiedenen Regionen des ZNS, außerdem enthält der Thorax mehrere periphere AstA-Neurone. Der Enddarm sowie der posteriore Mitteldarm werden von zentralen AstA-Neuronen innerviert. Zusätzlich existieren zahlreiche AstA-produzierende enteroendokrine Zellen, die im Epithel des posterioren Mitteldarms verstreut liegen. Die thermogenetische Aktivierung bestimmter AstA-Zellen führte dazu, dass die Nahrungsaufnahme der Fliegen signifikant reduziert und die lokomotorische Aktivität beträchtlich vermindert war. Die Kombination unserer Daten mit den Ergebnissen einer vorangegangenen Studie legte nahe, dass zwei Paar AstA-bildende Neurone des posterioren lateralen Protocerebrums das Sättigungsgefühl stimulieren, wohingegen die enteroendokrinen AstA-Zellen die Lokomotion regulieren. Weiterhin deuteten unsere Ergebnisse darauf hin, dass AstA-Zellen die Defäkation direkt und indirekt zu beeinflussen scheinen, wohingegen kein Effekt auf Wasser- und Ionenhomöostase festgestellt werden konnte. Außerdem haben wir mittels in vitro-Versuch die Wirkung von synthetischen AstA-Peptiden auf isolierte Mitteldärme getestet und konnten eine dosisabhängige Inhibition der Mitteldarmmotilität feststellen. Eine Verminderung der AstA-Rezeptor-mRNA in der Darmmuskulatur mittels RNAi zeigte, dass der Rezeptor DAR-2 den myoinhibitorischen Effekt der AstA-Peptide vermittelt. Alles in allem scheinen AstA-Zellen, indem sie das Sättigungsempfinden, die Lokomotion, die Darmperistaltik und möglicherweise auch die Defäkation steuern, verschiedene Ebenen des Stoffwechsels und unterschiedliche Gewebe zu beeinflussen, und dabei mehrere mit der Nahrungsaufnahme sowie auch untereinander in Verbindung stehende Prozesse zu fördern., Regulatory peptides, which comprise neuropeptides and peptide hormones, are cell-cell signaling molecules that control a variety of biological processes in insects and other metazoans. The insect midgut, like the mammalian digestive system, contains numerous peptide-producing endocrine cells, and the diversity of insect enteroendocrine peptides gives a hint at their relevance for metabolism, energy balance and feeding behavior. In the first study, we characterized the midgut peptidome of adult and larval Drosophila melanogaster by extraction of peptides from midgut tissue and subsequent LC-MS/MS analysis of peptide structures. By this means we identified 24 peptides originating from 9 different peptide precursors. All gut peptides were found in identical form within the CNS and thus represent brain-gut peptides. Processing of Drosophila neuropeptide hormones was previously shown to require the subtilisin-like proprotein convertase 2 (dPC2, AMON). Our results suggest a general need of AMON for gut peptide production as well. In the second study, we could expand the knowledge on peptide structures of relevant insects. We investigated the peptidome of the cabbage maggot (i.e., the larva of the cabbage root fly Delia radicum), which causes substantial agricultural damage by feeding on plant roots. By mass spectrometric analysis of CNS, neurohemal organ and gut tissue, we could characterize 38 peptides belonging to diverse insect peptide families. Moreover, we identified a new peptide with sequence similarity to the eclosion hormone precursor of several Drosophila species. Immunocytochemical characterization of peptide-producing neurons and enteroendocrine cells in cabbage maggots showed that peptide distribution was largely similar to Drosophila larvae. The observed similarities in the peptidergic systems of both species suggest that Drosophila can serve as a genetically accessible pest species model in terms of peptidergic regulation of, e.g., metabolism. In the future, our results could be of use for the development of a targeted, peptide-based management of cabbage root flies. In the third study, we analyzed the role of allatostatin A (AstA), a peptide family commonly occurring in insects (and other arthropods). Previous studies had already demonstrated a role for AstA in metabolic regulation and nutritional homeostasis of Drosophila. We addressed the question whether specific effects were connected to the activity of certain subsets of the numerous AstA-producing cells found in adult fruit flies. AstA neurons are located in different regions of the CNS. The thorax also contains a few peripheral AstA neurons. The hindgut and the posteriormost portion of the midgut are innervated by central AstA neurons. In addition, a large number of enteroendocrine AstA cells are scattered across the epithelium of the posterior midgut. Thermogenetic activation of certain AstA cells significantly reduced food intake of flies, and also considerably diminished their locomotor activity. The combination of our results with findings of a previous study suggested that two pairs of AstA-producing posterior lateral protocerebrum neurons function to promote satiety, while enteroendocrine AstA cells seem to regulate locomotor activity. In addition, our findings indicated that AstA cells might directly and indirectly influence defecation behavior, while no effect on water and ion homeostasis could be observed. Furthermore, we tested the effect of synthetic AstA peptides on isolated midguts in vitro and observed a dose-dependent inhibition of midgut motility. Downregulation of AstA receptor mRNA in the gut musculature via RNAi showed that the DAR-2 receptor mediates the myoinhibitory effect of AstA peptides. Altogether, by influencing satiety, locomotion, gut peristalsis and possibly also defecation, AstA cells appear to affect different levels of metabolism and different tissues, seemingly promoting several interrelated processes connected to food intake.

Das koordinierte Verhalten und die Differenzierung von genetisch identischen Zellen in verschiedene Zelltypen konnten bereits in unterschiedlichen Prokayroten beobachtet werden, unter anderem auch in dem Bodenbakterium Myxococcus xanthus. Unter nahrungs-limitierenden Bedingungen, initiiert M. xanthus ein komplexes Entwicklungsprogramm in dem vegetative Zellen zu resistenten Sporen differenzieren. Im Laufe des Entwicklungsprogrammes können die Zellen mindestens drei Schicksale erfahren; die Zellen können durch programmierten Zelltod sterben, sie sporulieren oder sie differenzieren in eine Art Dauerform, welche als „Periphäre Stäbchen“ bezeichnet werden. Die ersten beiden Zellschicksale „Programmierter Zelltod“ und „Sporulation“ wurden in der vorliegenden Arbeit untersucht., Coordinated behavior and the differentiation of genetic identical cells into distinct cell types have been described for several prokaryotic model species among which is Myxococcus xanthus. Upon nutrient starvation, M. xanthus undergoes a complex developmental life cycle, in which vegetative cells differentiate into environmentally resistant spores. During the developmental program the cells enter one of at least three different cell fate paths, namely “programmed cell death”, sporulation and the differentiation into a persister-like state called “peripheral rods”. The first two cell fates, “cell lysis” and “sporulation”, were examined in the current study.

The CRISPR-Cas system is an adaptive immune system found in archaea and bacteria to defend themselves against mobile genetic elements (e.g. phages). The system employs base complementarity of small RNA species (crRNAs) to target the foreign nucleic acids for degradation. The hallmark of the system is the CRISPR array or locus, which is composed of repetitive DNA sequences (repeats) that are interspersed by unique sequences (spacers). Spacer sequences can be derived from earlier encounters with viruses and, as part of the crRNAs, confer the base complementarity during a reoccurring attack. During the ongoing battle between prokaryotes and viruses diverse CRISPR-Cas systems evolved into three main types that are further subdivided. This thesis shows the first characterization of a subtype I-B CRISPR-Cas system. RNA-Seq data proved the in vivo activity of this CRISPR-Cas system in Methanococcus maripaludis C5. The data further revealed that the crRNAs are always composed of a complete spacer sequence flanked by an 8 nt 5' repeat tag and a 2 nt 3' repeat tag. Eigth cas genes were identified for M. maripaludis. Two Cas proteins, Cas8b and an annotated hypothetical protein were characterized in more detail. The hypothetical protein was shown to be the endoribonuclease responsible for the single-turnover catalysis of precursor crRNA into mature crRNA and was termed Cas6b. The reaction performed by Cas6b yields the 8 nt 5' terminal tag of the mature crRNAs. Despite sharing only low sequence identity of 11 %, the two Cas6 proteins of M. maripaludis and Pyrococcus furiosus could be well aligned using a structural model of Cas6b and the crystal structure of P. furiosus Cas6. Cas6b mutant analysis was used to determine four amino acid residues (lysine 30, histidine 38, histidine 40 and tyrosine 47) that comprise the catalytic site of Cas6b. The RNA binding properties of Cas6b were determined and showed a dimerization upon binding to a non-cleavable substrate. Further analyses including RNA crosslinking experiments followed by mass spectrometry identified a methionine residue (M185) that tightly coordinated to a uridine (U15) of the repeat sequence. Cas6b activity assays employing differently structured repeat variants of M. maripaludis and a 37 nt repeat sequence of Clostridium thermocellum could show, that the processing reaction performed by Cas6b does not recognize a secondary structure of the substrate. In addition to the verification to the in vivo activity of the CRISPR-Cas system, the RNA-Seq data also revealed a varying abundance pattern of crRNAs. To assess the crRNA abundance a experimental procedure was designed, which was aimed to analyse the influence of spacer sequences on a) the processing by Cas6 and b) the stability of crRNAs. With the help of this global approach influences of the spacer length and spacer sequence on the crRNA maturation and in vitro stability were recognized. In this context, future experiments will also determine further possible influences on crRNA abundance including i) crRNA loading into the Cas protein interference complex (Cascade) and ii) possible regulatory effects in terms of crRNA utilization dependent regulation. The characterization of the subtype-specific protein Cas8b revealed a splitting of the recombinant protein into two defined fragments. The exact point of cleavage was determined by Edman sequencing and provides evidence for a proteolytic cleavage of the full-length protein (either autocatalytically or by a protease). Other CRISPR-Cas subtypes were reported to contain two proteins serving as small and big subunit of the interference complex Cascade. For subtype I-B on the other hand Cas8b was found to be the only equivalent to these two proteins and it was proposed that the identified cleavage generates the large and small Cascade subunit. A biochemical analysis of Cas8b with respect to its putative roles during CRISPR-Cas immunity showed an unspecific binding to nucleic acids while no nucleolytic cleavage was observed. Possible functions of Cas8b are discussed and future studies will focus on the analysis of the protein functions in the context of a complete Cascade.

Der humanpathogene Pilz Candida glabrata ist ein opportunistischer Erreger, der bevorzugt die Schleimhäute von Säugetieren besiedelt. C. glabrata ist für etwa 15 % der Blutstrominfektionen bei Menschen verantwortlich und verursacht besonders bei immunsupprimierten Patienten schwere Infektionsverläufe. Wichtige Virulenzfaktoren von C. glabrata sind die epithelialen Adhäsine (Epa-Proteine), von denen der Pilz je nach Stamm bis zu 23 verschiedene Mitglieder besitzt und die für die erfolgreiche Kolonisierung des Wirtes entscheidend sind. Die Epa-Proteine sind mit den Flokkulinen der Bäckerhefe Saccharomyces cerevisiae verwandt und gehören zu den Glycosylphosphatidylinositol-verankerten Zellwandproteinen (GPI-CWP). Sie besitzen eine typische, dreigeteilte Domänenstruktur, bei der die N-terminale A-Domäne für die Vermittlung der Adhäsion verantwortlich ist, die anschließende B-Domäne als Träger der A-Domäne fungiert und die C-terminale C-Domäne für die GPI-Verankerung in der Zellwand verantwortlich ist. Bisherige Untersuchungen an einigen Mitgliedern der Epa-Familie haben gezeigt, dass diese Adhäsine als Lektine fungieren und bestimmte Glykane auf der Oberfläche von Epithelzellen spezifisch erkennen und binden. Um die Struktur und Funktion der gesamten Epa-Protein-Familie im Detail zu untersuchen, wurden in dieser Arbeit alle 17 EpaA-Domänen des C. glabrata Stammes CBS138 heterolog hergestellt und aufgereinigt. Anschließend wurden Ligandenbindungsspezifitätsprofile aller 17 EpaA-Domänen über Glycan Array Screening ermittelt, wobei sich ergab, dass etwa 2/3 der Epa-Proteine Galactoside bevorzugen. Weiterhin wurden die exakten Bindungsstärken bestimmter EpaA-Domänen zu ausgewählten Glykan-Liganden ermittelt, die im niedrigen mikromolaren Bereich liegen. Ebenso gelang auch die Strukturlösung von Epa6A und Epa9A mit verschiedenen Liganden. Dadurch konnten sowohl konservierte als auch variable Aminosäurereste identifiziert werden, die für die Affinität und Spezifität wichtig sind und die anschließend über gezielte Mutagenese genauer untersucht wurden.Um die Funktion der EpaA-Domänen auch systematisch in vivo zu untersuchen und mit den biochemische Ergebnissen zu vergleichen, wurden 15 der EpaA-Domänen in einem heterologen Expressionssystem einzeln an die Zelloberfläche von S. cerevisiae gebracht und deren Fähigkeit zur Adhäsionsvermittlung an menschliche Epithelzellen und abiotische Oberflächen bestimmt. Zusammenfassend gibt diese Arbeit einen detaillierten Einblick in die Struktur und Funktion einer kompletten Multiprotein-Familie, wobei die präzise Charakterisierung der Ligandenbindungsstellen von besonderem Interesse ist, da diese für die Pathogenität von C. glabrata entscheidend sind und als mögliche Ziele für die zukünftige Entwicklung dringend benötigter, neuer Antimykotika in Frage kommen.

Species interactions are an integral part of ecological communities. Collectively, these interactions form complex and highly dynamic networks. The structure of these networks varies due to geographic and temporal variation in the abundance and co-occurrence of interacting species and due to species gains and losses after anthropogenic perturbation. In Europe’s last relict of old-growth lowland forest (Białowieża, Poland), I studied the outcomes of these natural and human-induced dynamics in highly diversified mutualistic networks of plants, pollinators and seed dispersers. These mutualistic interactions between plants and free-living animals are of great importance, as the flowers and fruits of many plant species are critical resources for a variety of animal species, which in turn contribute significantly to the regeneration of plant communities. As part of my studies, I was able to show that plant–animal mutualistic networks are highly dynamic systems that respond collectively to changing biotic context and human-induced perturbation. Observed shifts in facilitative and competitive interactions among plants sharing mutualistic partners show that biotic context is a strong determinant of the outcome of interspecific interactions. The use of network analyses, thereby, allowed me to identify some of the mechanisms that shape species interactions and their outcomes. For example, my studies show that a change in the population density of one species suffices to trigger cascading effects on the interactions and populations of other species. This finding highlights that species interactions may have a pervasive effect on the assembly and disassembly of ecological communities. Even more importantly, I could show that these community-wide dynamics were in all cases linked to consumer-resource relationships, which are key determinants of plant–animal mutualisms. Thus, changes in the foraging behaviour of animals in response to variation in the density of plant resources and competitors affected the structure of mutualistic communities. This underscores that despite the evolutionary conservatism in ecological interactions, biotic context determines to which extent these coevolved interactions are realized. The fact that the sharing of mutualistic partners among plant species was reflected in their co-occurrence demonstrates that the above-mentioned dynamics in ecological networks may also determine community assembly processes and species co-existence. Importantly, the comparison of several types of species interactions revealed how biotic context in its various forms can shape land-use effects on species interactions. I found that the mutualism between plants and seed dispersers was more susceptible to habitat degradation than the mutualism between plants and their pollinators. This finding highlights that a high degree of generalization, such as in the seed dispersal mutualism, does not necessarily buffer ecological communities against the loss of species. This becomes even more important if a few species have a disproportionate effect on a given target function and if species are particularly vulnerable to ecological perturbation, such as habitat specialists or large-bodied frugivores. Furthermore, I observed that shifts in the abundance of plant resources in degraded habitats can amplify land-use effects on plant–animal mutualistic interactions. Importantly, changes in the density of plant resources explained about 40 to 70 percent of the variation in land-use effects on interactions between plants and their pollinators and seed dispersers. This demonstrates that a consideration of biotic context (e.g. in the form of resources) may considerably improve predictions of the magnitude of land-use effects on species interactions. Thereby, the correlated responses of pollinators and seed dispersers to the shifts in plant population densities in degraded habitats highlight that these dynamics are not restricted to single types of interaction, but potentially operate at the level of ecosystems. Studies that only focus on subsets of species or interaction types may be unable to identify the consequences of human land-use that have been shown here. In principle, the results of the presented studies may also be valid for other types of mutualistic and antagonistic interactions that are based on consumer-resource relationships. Altogether, the results of my thesis suggest that natural and human-induced dynamics in plant–animal mutualistic networks follow similar principles. In the worst case these dynamics might have cascading effects on the functioning and integrity of ecosystems through a parallel loss of multiple animal-mediated ecosystem services after habitat degradation.

Säugetiere bevölkern nahezu jede Nische der Erde, weil sie ihre Körpertemperatur unabhängig von der Umgebungstemperatur regulieren können. Diese endotherme Lebensweise ist, besonders für Kleinsäuger, energetisch sehr kostspielig und lässt sich nur durch eine präzise Regulation der Energieausgaben verwirklichen. Regulationsmechanismen, die einer Absenkung des Stoffwechsels, um Energie zu sparen oder einer Stoffwechselsteigerung, um die Körpertemperatur bei Kälteexposition zu verteidigen, zugrunde liegen, sind komplex und in weiten Teilen unverstanden. Messungen von Sauerstoffverbrauch und Körpertemperatur der arid lebenden Goldstachelmaus (Acomys russatus) ergaben, dass A. russatus eine 50%ige Futterreduktion bei hohen Umgebungstemperaturen (32°C und 35°C) energetisch kompensieren kann. Durch eine Reduktion ihres Ruhestoffwechsels um 30% im Vergleich zu ad libitum Bedingungen und täglich mehrstündige torpide Phasen, hielt sie ihr Körpergewicht trotz der verringerten Energiezufuhr nahezu konstant. Im Gegensatz zu Torpor bei Umgebungstemperaturen von 23°C und 27°C, blieb die Körpertemperatur dabei auf einem normothermen Level. Die rapide Absenkung des Metabolismus, ein Charakteristikum von Torpor, kann demnach entkoppelt von einer hypothermen Körpertemperatur stattfinden und ist somit entgegen der landläufigen Meinung nicht nur in kalten, sondern auch in anderen klimatischen Bedingungen eine effiziente Strategie der Energieeinsparung. Als Auslöser für die regulierte Stoffwechselabsenkung im Torpor stehen die Mitochondrien in der Diskussion. Ein aktives Abschalten der Zellatmung könnte zu einer Stoffwechseldepression führen, wie sie bei Eintritt in den Torpor auftritt. Untersuchungen verschiedener Gewebe (z.B. Leber) von torpiden Stachelmäusen ergaben jedoch keine Verringerung der mitochondrialen Succinat-Respiration im Vergleich zu normometabolen Tieren. Auch das Membranpotential der isolierten Mitochondrien und die Effizienz der ATP-Synthase unterschieden sich nicht. Dies galt für torpide Stachelmäuse mit normothermer als auch hypothermer Körpertemperatur. Es weist darauf hin, dass die Absenkung der Stoffwechselrate im Torpor bei A. russatus nicht durch eine Inhibition der Zellatmung induziert wird. Winterakklimatisierte Dsungarische Zwerghamster (Phodopus sungorus) dagegen zeigten im Torpor eine aktive Inhibition der Substratoxidation in den Lebermitochondrien. Die Atmungsraten der Mitochondrien korrelierten mit der Körpertemperatur der Hamster, die bei Umgebungstemperaturen von 15°C sehr tiefe Werte erreichte. Diese Daten lassen die Schlussfolgerung zu, dass eine aktive Inhibition der mitochondrialen Respiration artspezifisch ist und eher eine Anpassung an niedrige Körpertemperaturen im torpiden Zustand als die Ursache des Torporeintritts an sich. Die Mechanismen, die zum Eintritt in den Torpor führen, bleiben somit unklar. Um neue Wege für die Entschlüsselung der Regulationsmechanismen im Torpor zu eröffnen, wurde im nächsten Schritt ein kombinierter Messaufbau aus indirekter Kalorimetrie und Magnetresonanztomographie (MRT) entwickelt, der erlaubte torpide Zwerghamster bildgebend zu untersuchen. Die notwendige Hardware und Software wurde soweit optimiert, dass P. sungorus in einem 7 Tesla-Tomographen torpid wurde und erstmalig morphologische, angiographische und spektroskopische Aufnahmen an einem nicht-narkotisierten Tier im Torpor akquiriert werden konnten. Solch funktionelle Messungen mittels MRT bieten das Potential, neue Einblicke in die Abläufe des Torpors zu gewinnen. Eine weitere Stärke der MRT ist ihr hervorragender Weichgewebekontrast, der es zuließ Gewebe von narkotisierten Tieren in vivo zu untersuchen. Selbst Unterschiede zwischen dem weißen Speicherfett und dem thermogenetisch aktiven braunem Fett ließen sich darstellen und mit gaschromatischen Messungen ex vivo validieren. Weißes Fettgewebe wies einen höheren Gehalt an ungesättigten Fettsäuren auf als braunes Fettgewebe. In der Winteranpassung nahm der Gehalt an ungesättigten Fettsäuren in beiden Geweben bei P. sungorus zu. Daraus lässt sich eine bedeutsame Funktion der Fettsäuren für die Vorbereitung auf Torpor und kalte Umgebungstemperaturen ableiten. Im letzten Teil der Arbeit wurde die thermogenetische Funktion des braunen Fettgewebes tiefergehend untersucht. Braunes Fettgewebe spielt eine wichtige Rolle um den Körper aus hypothermen Phasen des Torpors wieder aufzuheizen und um eine normotherme Körpertemperatur bei Kälteexposition zu verteidigen. Hierfür generiert braunes Fett nach noradrenerger Stimulation mittels eines spezifischen Entkopplerproteins (UCP1) zitterfreie Wärme, indem die oxidative Phosphorylierung in den Mitochondrien von der Atmungskette entkoppelt wird. Bei langanhaltender Kälteexposition steigt die Fähigkeit zur zitterfreien Thermogeneses durch Erhöhung der respiratorischen Kapazität des Gewebes, und diese wird hauptsächlich auf UCP1-vermittelte Thermogenese zurückgeführt. Knockout-Mäuse, die kein UCP1 besitzen, zeigten dennoch eine Steigerung der zitterfreien Wärmebildung, was auf eine Kompensation der UCP1-vermittelten Thermogenese hinweist. Spektroskopische und bildgebende MRT-Messungen konnten bei UCP1-KO Mäusen wie bei Wildtypmäusen eine Umstrukturierung des braunen Fettgewebes bei Kälteanpassung visualisieren. Nach noradrenerger Stimulation konnte eine Erhöhung des Lipidmetabolismus nachgewiesen werden. Der gesteigerte Lipidstoffwechsel führte bei beiden Genotypen zu einem immensen Export von Fettsäuren, dem wichtigsten Substrat der Thermogenese, aus dem braunen Fettgewebe. Die Daten sprechen für einen UCP1-unabhängigen Mechanismus zur adaptiven Thermogenese und eine wichtige Funktion des braunen Fettgewebes im Lipidstoffwechsel, die über die Oxidation von Fettsäuren für die UCP1-vermittelte Thermogenese hinausgeht. Die Ergebnisse der vorliegenden Arbeit tragen zu einem weiterführenden Verständnis der Regulationen des Energiehaushalts kleiner Säugetiere bei. Sie decken Zusammenhänge zwischen der aktiven Stoffwechselabsenkung, der Körpertemperatur, der Umgebungstemperatur und der mitochondrialen Respirationsleistung auf. Sie beleuchten den Einsatz der MRT als innovative Methode für die Untersuchung physiologischer Fragestellungen und werfen ein neues Licht auf die Funktion des braunen Fettgewebes bei der UCP1-unabhängigen zitterfreien Thermogenese.

In den vergangenen Jahren konnten Nachweise erbracht werden, dass PPARβ/δ an einer Vielzahl schwerer Erkrankungen wie Krebs, Atherosklerose und Diabetes mellitus beteiligt ist. Eine mögliche therapeutische Option könnte daher eine Modulation dieses Rezeptors mittels spezifischer inhibitorischer Liganden sein. Zu Beginn der vorliegenden Arbeit waren zwar hochaffine PPARβ/δ-Agonisten verfügbar, jedoch waren alle beschriebenen inhibitorischen Liganden entweder nicht selektiv, nicht bioverfügbar oder zeigten eine pharmakologisch ungünstige, irreversible Interaktion mit PPARβ/δ. Zur Untersuchung des therapeutischen Potenzials von PPARβ/δ-Liganden war die Entwicklung neuer bioverfügbarer, selektiver inhibitorischer Liganden daher dringend geboten. Diese beinhalten sowohl Antagonisten, die durch eine Bindung an PPARβ/δ kompetitiv dessen Aktivität hemmen, als auch inverse Agonisten, die durch eine zusätzliche Rekrutierung von Corepressoren aktiv zu dessen Repressorfunktion beitragen.

The development of the fruitfly Drosophila melanogaster is regulated by the steroid hormone ecdysone. Ecdysone is released at the onset of metamorphosis and initiates a cascade of transcriptional events. First, it leads to the heterodimerisation of the Ecdysone receptor (EcR) with its binding partner ultraspiracle. This complex recruits the transcription machinery to ecdysone inducible genes and thereby initiates transcription of genes that contribute to pupariation and metamorphosis. ATP-dependent chromatin remodelers regulate transcription by altering DNA accessibility and often reside in multimeric protein complexes. Mi-2 is a member of the CHD family of ATP-dependent chromatin remodelers and can function both as co-repressor and co-activator in transcription regulation. The results described in this thesis investigate the function of the chromatin remodeler Mi-2 in the regulation of ecdysone dependent genes. Further, they provide a model by which Mi-2 is targeted to and influences transcription of ecdysone dependent genes. In the first part of this thesis, genome-wide Mi-2 binding sites were mapped by chromatin immunoprecipitation followed by DNA-Sequencing (ChIPSeq) in untreated and ecdysone treated Drosophila S2 cells. This led to the identification of 103 Mi-2 binding sites that show increased binding of Mi-2 upon hormonal stimulation. Further analyses showed that a significant proportion of these binding sites resides in the close proximity of ecdysone inducible genes, implicating that Mi-2 functions in the regulation of these loci. Six ecdysone induced Mi-2 binding sites at two ecdysone dependent genes, the vrille and the broad loci were investigated in more detail. Here, depletion of Mi-2 resulted in a strong increase in expression of these genes in untreated and ecdysone treated cells. However, depletion of a different ATP-dependent chromatin remodeler, Iswi, did not result in derepression of broad and vrille, indicating that Mi-2 function is specific at the broad and vrille genes. In the second part of this thesis, interaction studies revealed that Mi-2 can bind to EcR. This interaction was found to be independent of the hormone ecdysone. Further, the interaction between Mi-2 and EcR was mapped to the ATPase domain of Mi-2. These results demonstrated the first described interaction between the catalytic domain of Mi-2 and a nuclear receptor. In addition, the activation function 2 (AF2 domain) of EcR was found to be important for the interaction with Mi-2. The finding that Mi-2 and EcR can physically interact led to the hypothesis that EcR can recruit Mi-2 to specific sites in the genome. Indeed, a significant overlap between EcR and Mi-2 binding sites was found in both untreated and ecdysone treated cells. In agreement with this hypothesis, depletion of EcR led to decreased ecdysone induced Mi-2 recruitment to the vrille and broad genes. These findings established a new recruitment model for Mi-2 by EcR to chromatin. Finally, Micrococcal nuclease (MNase) mapping demonstrated that Mi-2 functions at the vrille gene by maintaining a closed chromatin structure at this locus. Here, depletion of Mi-2 resulted in a more open chromatin structure, which correlated with an increase in expression of vrille., Die Entwicklung der Fruchtfliege Drosophila melanogaster wird durch das Steroidhormon Ecdyson reguliert. Ecdyson wird zu Beginn der Metamorphose sekretiert und initiiert eine Kaskade von transkriptionellen Ereignissen. Zunächst führt es zur Heterodimerisierung des Ecdyson Rezeptors (EcR) mit seinem Bindungspartner ultraspiracle. Dieser Komplex rekrutiert die Transkriptionsmaschinerie an Ecdyson induzierbare Gene und initiiert dadurch die Transkription von Genen, welche direkt zur Verpuppung und Metamorphose beitragen. ATP-abhängige Chromatinremodeler regulieren die Transkription in dem sie die Zugänglichkeit der DNA ändern und befinden sich in multimeren Proteinkomplexen befinden. Mi-2 ist ein Mitglied der CHD Familie der ATP-abhängigen Chromatin Remodeler und fungiert als Korepressor und Koaktivator in der transkriptionellen Regulation. Die in dieser Arbeit beschriebenen Resultate untersuchen die Funktion des Chromatin Remodelers Mi-2 in der Regulation von ecdysonabhängigen Genen. Diese Ergebniss führten zu einem Modell welches beschreibt, wie Mi-2 an hormonregulierte Gene bindet und die Transkription von ecdysonabhängigen Genen beeinflußt. Im ersten Teil dieser Arbeit wurden genomweite Mi-2 Bindungsstellen durch Chromatin-Immunopräzipitation gefolgt von DNA-Sequenzierung (ChIPSeq) in unbehandelten und ecdysonbehandelten Drosophila S2 Zellen kartiert. Dies führte zur Identifizierung von 103 Mi-2 Bindestellen, die verstärkte Bindung von Mi-2 nach hormoneller Stimulation zeigen. Weitere Analysen zeigten, dass ein signifikanter Anteil dieser Bindungsstellen in der Umgebung von ecdysoninduzierbaren Genen liegt, was eine Funktion von Mi-2 in der Regulation dieser Loci impliziert. Sechs ecdysoninduzierte Mi-2 Bindungsstellen an zwei ecdysonabhängigen Genen, broad und vrille, wurden eingehender untersucht. Hier führte Depletierung von Mi-2 zu einem starken Anstieg dieser Gene in unbehandelten und ecdysonbehandelten Zellen. Die Depletierung eines anderen ATP-abhängigen Chromatin Remodelers, Iswi, führte hingegen nicht zu einer Dereprimierung von broad und vrille. Dies deutet darauf hin, dass die Funktion von Mi-2 an den Genen broad und vrille spezifisch ist. Interaktionsstudien im zweiten Teil dieser Arbeit machten deutlich, dass Mi-2 an den EcR binden kann. Es wurde gezeigt, dass diese Interaktion unabhängig von dem Hormon Ecdyson ist. Desweiteren wurde die Interaktion zwischen Mi-2 und EcR auf die ATPase Domäne von Mi-2 kartiert. Diese Ergebnisse weisen zum ersten mal eine Interaktion zwischen der katalytischen Domäne von Mi-2 und einem Kernrezeptor nach. Zusätzlich dazu wurde beobachtet, dass die Aktivierungsfunktion 2 (AF2 Domäne) des EcR wichtig für die Interaktion mit Mi-2 ist. Die Erkenntnis, dass Mi-2 und EcR physisch interagieren können, führte zu der Hypothese, dass EcR Mi-2 an spezifische Stellen im Genom rekrutieren kann. In der Tat wurde ein signifikanter Überlapp zwischen Mi-2 und EcR Bindungsstellen, sowohl in unbehandelten als auch in ecdysonbehandelten Zellen, gefunden. In Übereinstimmung mit dieser Hypothese, führte eine Depletierung von EcR zu einer verminderten, ecdysoninduzierten Rekrutierung von Mi-2 an die Gene broad und vrille. Diese Ergebnisse etablierten ein neues Modell für die Rekrutierung von Mi-2 durch den EcR an das Chromatin. Schließlich zeigten MNase Kartierungsstudien mit Mikrokokkus-Nuklease (MNase), dass Mi-2 durch die Aufrechterhaltung einer geschlossenen Chromatinsstruktur am vrille Gen fungiert. Hier führte eine Depletierung von Mi-2 zu einer geöffneten Chromatinstruktur, welche mit einer verstärkten Expression von vrille korrelierte.

In this thesis, a combination of RNAseq, computational and biochemical methods was applied to analyze processes that use small RNAs (sRNAs) as guide molecules at extreme temperatures. Here, the hyperthermophilic archaeon Methanopyrus kandleri, which grows at temperatures of up to 110°C, was used as a model organism. The genome of M. kandleri harbors two CRISPR-Cas systems that use CRISPR RNA (crRNA) as guide molecules to target foreign nucleic acids. RNAseq analysis revealed a high abundance and processing of crRNAs in M. kandleri that indicated that CRISPR-Cas systems are highly active at extreme temperatures. Furthermore, the crystal structure of the CRISPR-associated protein Csm3 was solved in collaboration with Prof. Dr. Elena Conti (MPI Martinsried). Csm3 was found to bind crRNAs and was shown to function as the crRNA-binding backbone protein in type III-A CRISPR-Cas interference complexes. A recently discovered nucleic acid-guided mechanism uses prokaryotic Argonaute (pAgo) proteins. In M. kandleri, a pAgo protein was found to be encoded within a potential operon of CRISPR-associated genes and the analysis of recombinant pAgo protein production revealed a high toxicity in Escherichia coli that might correlate with its potential defense function against plasmid DNA. Methylation of rRNA is regulated by a different sRNA-guided mechanism that utilizes C/D box sRNAs to target a ribonucleoprotein complex to the rRNA methylation site. In M. kandleri, a record number of 126 C/D box sRNAs were detected by RNAseq analysis and indicate an increased potential for rRNA methylation reactions. Furthermore, most of the C/D box sRNAs were detected as circular molecules. Taken together, the circularization of C/D box sRNAs and the high requirement for rRNA methylation are suggested to be adaptations to the hyperthermophilic lifestyle of M. kandleri. Finally, RNAseq analyses were used to identify tRNA precursors in M. kandleri that feature a unique C-to-U editing reaction of base 8. The occurrence of this editing event was used to deduce the order of tRNA processing steps in a non-compartmentalized cell, indicating that termini truncation precedes intron removal and editing., In der vorliegenden Arbeit wurden RNAseq, sowie bioinformatische und biochemische Methoden angewandt um zelluläre Prozesse zu analysieren die von kleinen RNAs (sRNA) gesteuert werden. Um zu untersuchen, wie diese Prozesse bei extremen Temperaturen funktionieren, wurde das hyperthermophile Archaeon Methanopyrus kandleri, welches bei Temperaturen von bis zu 110°C lebt, als Modellorganismus verwendet. Das Genom von M. kandleri enthält zwei CRISPR-Cas Systeme, welche crRNAs (CRISPR RNAs) als Zielerkennungsmoleküle verwenden, um sich gegen Viren zur Wehr zu setzen. Durch RNAseq Analysen wurden große Mengen an prozessierten crRNAs detektiert. Dies deutet darauf hin, dass CRISPR-Cas Systeme bei extremer Temperatur sehr aktiv sind. Zudem wurde die Kristallstruktur des CRISPR-assoziierten Proteins Csm3 in Zusammenarbeit mit Prof. Dr. Elena Conti (MPI Martinsried) aufgeklärt. Anhand von RNA Bindestudien wurde Csm3 als crRNA-bindendes Protein identifiziert, welches als Gerüstprotein des Typ III-A CRISPR-Cas Interferenzkomplexes fungiert. Erst kürzlich konnte gezeigt werden, dass pAgo (prokaryotic Argonaute) Proteine kurze Nukleinsäuresequenzen verwenden, um Zielmoleküle zu erkennen. In M. kandleri, ist ein solches pAgo Protein in einem potentiellen Operon zusammen mit Proteinen des CRISPR-Cas Systems kodiert. Versuche pAgo rekombinant herzustellen wiesen auf eine hohe Toxizität des Proteins in Escherichia coli hin, was mit einer möglichen Abwehrfunktion gegen Plasmid DNA in Zusammenhang stehen könnte. Die Methylierung von RNA Molekülen wird durch einen anderen Prozess gesteuert, welcher C/D Box sRNAs als Zielerkennungssequenzen verwendet, um Ribonukleoproteinkomplexe an Methylierungsstellen ribosomaler RNAs zu führen. In M. kandleri wurde eine Rekordzahl von 126 C/D Box sRNAs durch RNAseq Analysen detektiert, welche auf eine erhöhte Methylierung von rRNAs hinweist. Zudem wurde ein Großteil der C/D box sRNAs als zirkuläre Moleküle detektiert. Zusammenfassend können die Zirkularisierung von C/D Box sRNAs und der erhöhte Bedarf an RNA Methylierungen als Adaptionen an die hyperthermophile Lebensweise von M. kandleri angesehen werden. Abschließend wurden durch RNAseq Analysen tRNA-Vorläufer Moleküle identifiziert, welche die nur in M. kandleri vorkommende C-zu-U Modifikation der Base 8 aufwiesen. Das Auftreten dieser Modifikation wurde genutzt, um daraus Rückschlüsse auf die Reihenfolge von tRNA Prozessierungsschritten in nicht kompartimentierten Zellen zu schließen. Unsere Analysen ergaben, dass das Beschneiden der Enden dem Entfernen von Introns, sowie der Editierungsreaktion vorrausgeht.

My dissertation supports the observation that land use change is an important form of global pressure affecting biodiversity. Certainly, this dissertation provides answers only to some questions that rise in the context of human forest modification and many more questions still remain to be investigated further regarding the effects of anthropogenic impact on biodiversity. Introduction of non-native plantations is usually regarded as a surrogate for afforestation in Zambia but when this practice is done to replace native forests could lead to biodiversity loss. In fact, it has been established elsewhere that biodiversity is enhanced when plantations are established in previously degraded lands (Pawson et al. 2008; Brockerhoff et al. 2008). This dissertation revealed that replacing native forests with plantations of non-native trees (pine and eucalyptus) decreases richness and changes assemblages of carabid beetles. In order to fully understand the impact of replacing native forests with non-native plantations, further research is required. For example, investigating genetic diversity within and between species will deepen our understanding of biodiversity loss. In this regard, I will carry out genetic analyses using mitochondria and nuclear DNA of common carabid species in native forests and compare with their genetic diversity in nonnative plantations. Changes in species richness or genetic diversity may have far reaching implications at the ecosystem scale and open further ecological questions that may relate to functional diversity. I will examine changes in species functional types by assessing those species sharing similar functioning at the organismic level between forest types. In this context, data on richness of various functional groups such as predators, herbivores and detritivores may provide deeper understanding on species responses when native forests are replaced with non-native plantations and may also provide additional insight on the pros and cons of plantations in the biodiversity conservation framework. My dissertation has further shown that the response of carabid beetles to pollution is not consistent across species in the natural environment. Due to the fact that there could be many environmental variables affecting responses of animals to pollution, further research is required in order to pinpoint specific factors that may influence this inconsistence in carabid species. I will, therefore, carry out laboratory feeding experiments in which carabid species are fed with food contaminated with different quantities of Cu, Pb or other important heavy metals present in the Zambian environment. After feeding carabid beetles for at least one generation, I will then assess changes in body mass, fecundity and sex ratio of species. This will provide additional answers to questions on how species respond to specific contaminations in Zambia., Meine Dissertation unterstützt den Befund, dass veränderte Landnutzung einen wichtigen Einfluss auf die globale Biodiversität hat. Die Arbeit kann aber sicherlich nur Antworten zu einigen der aufgeworfenen Fragen im Kontext der Modifizierung von Wäldern durch den Menschen geben. Es verbleiben daher noch viele offene Fragen die untersucht werden müssen. Die Etablierung von Forsten mit gebietsfremden Arten wird gewöhnlich als Maßnahme zur Wiederbewaldung betrachtet. Wenn dadurch aber gebietstypische Wälder in Forste umgewandelt werden, kann es zu einem Verlust von Biodiversität kommen. Es hat sich gezeigt, dass Aufforstungen auf degradierten Flächen die Biodiversität erhöhen kann (Pawson et al. 2008; Brockerhoff et al. 2008). Diese Dissertation zeigt, dass die Umwandlung von gebietstypischen Wäldern in Forste mit nicht-heimischen Arten (Kiefern und Eukalyptus) die Artenvielfalt von Laufkäfern verringert und die Artenzusammensetzung von Laufkäfern verändert. Um die Zusammenhänge genau zu verstehen sind allerdings noch weitere Studien notwendig. Zum Beispiel können Untersuchungen zur genetischen Diversität innerhalb und zwischen Arten unser Verständnis des Verlusts von Biodiversität verbessern. Ich möchte daher in künftigen Studien mitochondriale und nukleäre DNA häufiger Laufkäfer Arten zwischen gebietstypischen Wäldern und Forsten mit gebietsfremden Bäumen vergleichen. Veränderungen in der Artenvielfalt und der genetischen Vielfalt können zu ökosytemaren Veränderungen führen und neue Fragen in Richtung funktioneller Diversität aufwerfen. Ich möchte daher die Veränderung von funktionellen Typen zwischen verschiedenen Waldtypen vergleichen. In diesem Kontext sollen der Artenreichtum von verschiedenen funktionellen Gruppen wie Räuber, Herbivore und Zersetzter untersucht werden. Dadurch könnte man eventuell zu einer besseren Einschätzung der Auswirkung der Umwandlung von heimischen Wäldern in Forste mit gebietsfremden Arten kommen. Außerdem könnte das Für und Wider von Forsten im Zusammenhang mit den Rahmenbedingungen des Schutzes der Biodiversität besser verstanden werden. Meine Dissertation zeigt zudem, dass Laufkäfer nicht einheitlich auf Umweltverschmutzungen reagieren. Da viele andere Umweltfaktoren den Einfluss von Umweltverschmutzung auf Laufkäfer beeinflussen können, ist zusätzliche Forschungsbedarf der die Bedeutung der einzelnen Faktoren genauer beleuchtet unumgänglich. Ich möchte daher in Laboruntersuchungen Fütterungsexperimente mit unterschiedlichen Mengen von Kupfer und Blei sowie anderen Schwermetallen die in den Lebensräumen in Sambia vorkommen durchführen. Nach einer Generationsfolge möchte ich dann die Veränderungen der Körpergröße, Fertilität und des Geschlechterverhältnis der Laufkäferarten vergleichen. Diese Untersuchen werden dann weitere Antworten auf die Frage wie Laufkäfer auf spezische Kontamination in Sambia reagieren unterbreiten.

Changes in land-use such as agricultural expansion and urbanization lead to landscape fragmentation among the Tropical Andes. This region also has exceptionally high levels of biodiversity and endemism; hence, it has become a priority for conservation efforts. Ecuador is part of Tropical Andes and in the Ecuadorian high-altitude Andes habitat loss is already widespread and persistent. A representative area for Andean avifauna is Cajas National Park. The park is located in the southern Andes of Ecuador and is the only protected area in the south-western Andes. The park is characterized by containing 90% páramo grassland ecosystem which surrounds > 1000 patches of Polylepis woodland. Despite its importance for bird conservation and its protected status, the Cajas National Park suffers from several stressors, which are modifying the natural habitat characteristics of both páramo grassland and Polylepis patches. We tested the effect of roads (as a major stressor), habitat structure and vegetation composition of both the páramo matrix and the Polylepis patches on the bird community. We found the habitat-specialized birds such as shrubby páramo birds had reduced abundance at the roadsides due to habitat modification led by the introduction of non-native plants. This same condition drives further change in community composition with generalist and a few páramo specialists being found within the area influenced by the road. Our findings also confirm the importance of natural heterogeneity of páramo grassland and the quality of small and medium-sized patches of Polylepis forest. For instance, there is a positive relationship of Polylepis specialist movement (between patch and matrix) with an increase in the proportion of woody plants. Furthermore, Polylepis patches located in higher altitude increased the centrality index of Polylepis specialists. The loss of specialized birds in disturbed areas and also the positive effect of Polylepis quality and páramo heterogeneity are crucial to a better understanding of the dynamics in the high-altitude Andes. Here, there is a vital importance to take on a landscape view, where not only large Polylepis patches are considered vital for avian conservation. Furthermore, human activities in the páramo landscape may reduce the natural habitat heterogeneity with a negative influence on biodiversity patterns. Several protected areas in Ecuador include large areas of páramo ecosystem and all of them are highly threatened; to promote effective nature conservation it is imperative to develop conservation plans that take habitat heterogeneity into account both in Ecuador and throughout the Andean region.

Wie die meisten apicomplexen Parasiten besitzt Plasmodium falciparum eine komplexe von vier Membranen umschlossene Plastide sekundär endosymbiotischen Ursprungs, die als Apicoplast bezeichnet wird. Obwohl nicht länger photosynthetisch aktiv, ist der Apicoplast ein Zentrum metabolischer Aktivität und gilt aufgrund seiner für den Parasiten essentiellen Stoffwechselwege als vielversprechende Angriffsfläche neuer anti-Malaria Medikamente. Die meisten Apicoplast Proteine sind jedoch Zellkern-kodiert und müssen daher post-translational in die Plastide importiert werden, was die Etablierung entsprechender Signale und Transportmechanismen voraussetzt. Die Signale, welche die zunächst co-translationale Insertion von Apicoplast Proteinen ins ER und den anschließenden Transport zur Plastide vermitteln, wurden wie die molekularen Komponenten, die an der Translokation über die drei inneren Membranen beteiligt sind, in den letzten Jahren eingehend untersucht. Weitestgehend unbekannt ist, wie Apicoplast Proteine zunächst vom ER zur äußeren Apicoplasten Membran gelangen. In der gegenwärtigen Literatur wir ein Modell favorisiert bei dem Apicoplast Proteine bereits im ER erkannt und in ein spezielles vesikuläres System sortiert werden, über das sie unter Ausschluss des Golgi-Apparates auf direktem Weg vom ER zur äußeren Apicoplasten Membran transportiert werden. Diese Arbeit liefert Hinweise, dass lösliche Apicoplast Proteine über eine Passage durch den Golgi-Apparat zum Apicoplasten transportiert werden. Anhand von ER retrieval Sequenzen, welche im Golgi erkannt werden, kann der Transport eines löslichen Apicoplast-gerichteten Reporterproteins nachhaltig beeinträchtigt werden. Desweiteren wird der Transport löslicher Apicoplast-gerichteter Reporterproteine unter Einfluss von Brefeldin A, einem bekannten Inhibitor des Golgi/ER vesikulären Systems, in einer P. falciparum Wildtyp Parasitenlinie weitestgehend inhibiert, während vor dem Hintergrund einer BFA-resistenten P. falciparum Zelllinie keine Beeinträchtigung des Transports zum Apicoplasten erfolgt. Entgegen der gegenwärtigen Literatur wird ein Modell vorgeschlagen, bei dem lösliche Apicoplast Proteine nach ihrer co-translationalen Insertion ins ER zunächst entlang des sekretorischen Weges transportiert werden. Im Golgi-Apparat werden sie dann, vermutlich von einem Golgi-residenten Transitpeptid Rezeptor, erkannt und über ein vesikuläres Transportsystem zur äußeren Apicoplasten Membran sortiert und transportiert.

To understand the biological diversity of natural products produced by different microorganism, it is very important to elucidate the biosynthesis of these products. In most cases, the biosynthetic genes are located as a cluster on the genome and can be identified by bioinformatic approaches. Based on the structure feature of natural products, it is possible to find the biosynthetic gene cluster in the genome sequence. After successful identification of a cluster in the genome sequence, it is possible to modify the original biosynthesis by chemoenzymatic synthesis or by genetic manipulations. For that purpose, FtmPT1 in the biosynthesis of verruculogen was overproduced in E. coli M15 cells and purified with Ni-NTA-Agarose. In addition, the four stereoisomers of cyclo-Trp-Pro and cyclo-Trp-Ala were synthesised by chemical synthesis. These and further six cyclic dipeptides were subsequently incubated with the overproduced prenyltransferase FtmPT1, resulting in the formation of regularly C2-prenylated derivatives. These chemoenzymatically produced diketopierazines were tested in cooperation with Prof. Kassack from Düsseldorf for their biological activities with their non-prenylated precursors as controls. The results showed that the cytotoxic effects of the prenylated diketopierazines were significant higher than those of the non-prenylated precursors. This seems that the prenyl moiety, rather than the prolin moiety is essential for the biological activity. In addition, all tested stereoisomers of cyclo-Trp-Pro and cyclo-Trp-Ala showed comparable cytotoxic activities towards the tested cell lines. So the stereochemistry at C-11 and C-14 and the corresponding substituents have no significant influence on the cytotoxicity. During the isolation of the C2-prenylated diketopiperazines, detailed analysis of the incubation mixtures of FtmPT1 revealed the presence of additional product peaks in the HPLC chromatograms. Seven regularly C3-prenylated hexahydropyrrolo[2,3-β] indoles and two regularly N1-prenylated diketopiperazines were isolated and identified by HR-ESI-MS and NMR analysis including HMBC, HSQC and NOESY experiments. L-tryptophan-containing cyclic dipeptides were converted to C3β-prenylated diketopiperazines and D-tryptophan containing cyclic dipeptides to C3α-prenylated diketopiperazines, so that in both cases a syn-cis configuration was generated. Based on the given crystal structure of FtmPT1, a putative reaction mechanism was proposed. The independent product formation was confirmed by time dependency assays and elucidation of KM-values. In addition to the chemoenzymatic production of tryprostatin B analoga the natural compound fumigaclavin A was isolated from Penicillium commune NRRL2033. The structure and stereochemistry of (8R,9S)-fumigaclavin A was confirmed by ESI-MS and NMR analysis including HMBC, HSQC and NOESY experiments. Isolation of fumitremorgin A from N. fischeri NRRL181 provided the evidence for its role as end product of the biosynthesis of fumitremorgins in this fungus. Furthermore nine natural products could be isolated from N. fischeri NRRL181 and identified via HR-ESI-MS and NMR analysis. First of all, the known products aszonalenin, acetylaszonalenin and the precursors of fumitremorgin A: 12,13-dihydroxyfumitremrogin C, fumitremorgin B and verruculogen. Four additional substances of the fumitremorgin-type with unknown biosynthetic pathways could be isolated from N. fischeri NRRL181. Via HR-ES-MS and NMR analysis, these compounds could be identified as verruculogen TR-2, spirotryprostatin A, 6-methoxyspirotryprostain B and compound 15. Spirotryprostatin A and 6-methoxyspirotryprostain B were first isolated from N. fischeri NRRL181 in this study and compound 15 has not been reported previously. The prenyltransferase gene ftmPT3 is not located in the known verruculogen-cluster at chromosome 8, but at a different chromosome. It was therefore speculated that the genes around ftmPT3 could be responsible for the biosynthesis of verruculogen TR-2, spirotryprostatin A, 6-methoxyspirotryprostain B or compound 15. Three genes were therefore amplified by PCR from gDNA or cDNA and were cloned into expression vectors (pQE60, pQE70, pHis8, pYES2/NT C). After heterologous gene expression in E. coli or S. cerevisiae and purification of the recombinant proteins, enzyme assays with different substrates and cofactors were carried out; unfortunately, no additional product peak could be detected in the HPLC chromatograms of the enzyme assays. Transformation of the prenyltransferase gene brePT into A. nidulans TN02A7 containing the NRPS gene ftmPS, was used as a strategy for in vivo production of deoxybrevianamid E. Unfortunately, no expected product could be detected with HPLC., Zum besseren Verständnis der biologischen Diversität von Naturstoffen aus verschiedenen Mikroorganismen ist es wichtig, deren Biosynthese aufzuklären. Durch bioinformatische Analysen weiß man, dass in den meisten Fällen die Biosynthesegene aus Mikroorganismen in einem Cluster im Genom liegen. Aufgrund der Strukturen der Naturstoffe ist es demnach möglich, deren Biosynthesegene aufzudecken und zu identifizieren. Nach gelungener Identifikation der Cluster ist es nun möglich die Biosynthese gezielt zu modifizieren und somit neue Substanzen mit vorher festgelegter Struktur mittels chemoenzymatischer Synthese mit rekombinanten Enzymen oder aber auch durch genetische Manipulation in Modelorgansimen zu erhalten. Im Zuge dieser Arbeit wurde hierfür zunächst das rekombinante Protein FtmPT1 aus der bekannten Biosynthese von Verruculogen in E. coli-M15-Zelle überproduziert und mittels Ni-NTA-Agarose aufgereinigt. Zusätzlich wurden die vier Stereoisomere von cyclo Trp-Pro und cyclo Trp Ala synthetisiert, um sie später zusammen mit sechs weiteren zyklischen Dipeptiden mittels chemoenzymatischer Synthese mit FtmPT1 und DMAPP an Position C-2 zu prenylieren. In Kooperation mit Prof. Kassack aus Düsseldorf wurden die 14 chemoenzymatisch hergestellten Tryprostatin B-Analoga auf ihre Zytotoxizität gegenüber verschiedenen Zelllinien untersucht. Dabei ließ sich feststellen, dass die prenylierten Substanzen, bis auf ein paar Ausnahmen, eine ähnliche zytotoxische Aktivität gegenüber einer Zelllinie aufwiesen, wobei alle prenylierten Diketopiperazine eine deutlich höhere zytotoxische Aktivität als ihre unprenylierten Substrate aufwiesen. Dies deutet darauf hin, dass die Prenyl-Einheit essentiell für die biologische Aktivität ist, die Prolin-Einheit in Tryprostatin B dagegen nicht. Des Weiteren wiesen in den von Prof. Kassack durchgeführten Assays alle vier getesteten Stereoisomere von cyclo-Trp-Pro und cyclo-Trp-Ala ähnliche IC50-Werte gegenüber den getesteten Zelllinien auf. Dies spricht nun dafür, dass die Stereochemie an C-11 und C-14 der Diketopiperazine sowie deren Substituenten ebenfalls keinen großen Einfluss auf die Zytotoxizität nehmen. Im Zuge der Isolierung der C2-prenylierten Diketopiperazine wurden in den HPLC-Chromatogrammen zusätzliche Produktpeaks entdeckt, welche ebenfalls mittels semipräperativer HPLC isoliert wurden. Die Strukturen wurden anschließend mittels ESI-MS- und NMR-Spektroskopie als reguläre C3- und reguläre N1-prenylierte Produkte identifiziert, wobei L tryptophanhaltige zyklische Dipeptide mit FtmPT1 zu C3β-prenylierten Diketopiperazinen umgesetzt wurden und D-tryptophanhaltige zyklische Dipeptide zu C3α-prenylierten Diketopiperazinen, so dass in beiden Fällen eine syn-cis Konfiguration vorlag. Basierend auf der bekannten FtmPT1 Struktur wurden daraufhin Reaktionsmechanismen postuliert und mittels Zeitabhängigkeitsassays sowie durch Bestimmung von KM-Werten eine voneinander unabhängige Produktbildung bestätigt. Neben der chemoenzymatischen Produktion der Tryprostatin B-Analoga wurde, ebenfalls mittels semipräperativer HPLC, Fumigaclavin A aus P. commune NRRL2033 isoliert. Durch Aufklärung der Stereochemie mittels NOESY-Spektroskopie als (8R,9S)-Fumigaclavin A konnte Pyroclavin, ebenfalls mit 8R-Konfiguration, als Vorstufe der Biosynthese von Fumigaclavin A identifiziert werden. Durch die Isolierung von Fumitremorgin A aus N. fischeri NRRL181 konnte der letzte Schritt in der Biosynthese von Fumitremorgin A in N. fischeri NRRL181 identifiziert werden. Zusätzlich zu Fumitremorgin A konnten neun weitere Naturstoffe aus N. fischeri NRRL181 isoliert und deren Struktur mittels ESI-MS-und NMR-Spektroskopie aufgeklärt werden. Hierbei handelt es sich unter anderem um Aszonalenin und Acetylaszonalenin, welche von einem bekannten Cluster aus N. fischeri NRRL181 synthetisiert werden. Die Vorstufen 12,13 Dihydroxyfumitremogin C, Fumitremorgin B und Verruculogen in der Biosynthese von Fumitremorgin A wurden ebenfalls isoliert. Neben diesen sechs Indolalkaloiden mit bekannter Biosynthese wurden vier weitere Alkaloide des Fumitremorgin-Typs aus N. fischeri NRRL181 isoliert, deren Biosynthese zu Beginn dieser Arbeit noch nicht aufgeklärt werden konnte. Hierbei handelt es sich um Verruculogen TR-2, Spirotryprostatin A, 6 Methoxyspirotryprostain B und Substanz 15, wobei Spirotryprostatin A und 6 Methoxyspirotryprostain B zum ersten Mal aus N. fischeri NRRL181 isoliert werden konnten und es sich bei Substanz 15 um einen neuen Naturstoff handelt. Da die Prenyltransferase FtmPT3, anders als erwartet, nicht im Biosynthesecluster von Verruculogen identifiziert wurde, sondern auf einem anderen Chromosom, wurde vermutet, dass die benachbarten Gene von FtmPT3 für die Biosynthese der im Rahmen dieser Arbeit isolierten Verbindungen aus N. fischeri NRRL181 verantwortlich sein könnten. Deswegen wurden drei Gene ausgesucht, welche mittels PCR aus gDNA bzw. cDNA amplifiziert und anschließend in verschiedene Expressionsvektoren (pQE60, pQE70, pHis8, pYES2/NT C) kloniert wurden. Durch heterologe Genexpression in E. coli- bzw. S. cerevisiae-Zellen und Aufreinigung der überproduzierten Proteine konnten verschiedene Enzymassays mit unterschiedlichen Cofaktoren und Substraten durchgeführt werden. Jedoch konnte in keinem der getesteten Assays ein Produktpeak mittels analytischer HPLC detektiert werden. Zusätzlich sollte durch Transformation des Prenyltransferasegenes brePT in den Modelorganismus A. nidulans CaW03, in welchen bereits die NRPS FtmPS ektopisch integriert wurde, eine in vivo Produktion von Deoxybrevianamid E mittels HPLC detektiert werden. Dieser letzte Schritt der biologischen in vivo Synthese von Deoxybrevianamid E konnte jedoch nicht erfolgreich durchgeführt werden.

Der anaerobe Abbau von Phenylalanin führt über das Zwischenprodukt Phenylacetat zu Benzoyl-CoA, dem häufigsten Intermediat im anaeroben Abbau von aromatischen Verbindungen. Das Zwischenprodukt Phenylacetat entsteht durch die Oxidation von Phenylacetaldehyd. Vor Beginn dieser Arbeit war bekannt, dass Aromatoleum aromaticum sowohl eine Aldehyd:Ferredoxin-Oxidoreduktase (AOR) besitzt, die den Schritt katalysieren könnte, als auch ein oder mehrere Enzyme, die diese Oxidation mit NAD und NADP als Elektronenakzeptoren durchführen könnten. Folglich stellte sich die Frage, welches dieser Enzyme das Schlüsselenzym für den anaeroben Phenylalanin-Stoffwechsel darstellt. Außerdem ist die Entdeckung einer AOR in einem fakultativ anaeroben Bakterium ungewöhnlich, da AORs bisher ausschließlich aus obligat anaeroben, häufig hyperthermophilen Prokaryonten bekannt sind. A. aromaticum braucht ein Molybdän-Enzym zum denitrifizierenden Wachstum, nämlich die Nitrat-Reduktase. Alle bisher beschriebenen AORs enthalten das dem Molybdän sehr ähnliche Metall Wolfram. Vor diesem Hintergrund sollte untersucht werden, welches Metall die AOR aus A. aromaticum enthält. Für beide Fragestellungen war es wichtig, die Phenylacetaldehyd-oxidierenden Enzyme aus A. aromaticum-Zellen anzureichern und im Idealfall aufzureinigen. Durch vielfältige chromatographische Verfahren gelang es, alle Enzymaktivitäten in einem für die Bearbeitung der Fragestellungen ausreichenden Maße anzureichern. Metallanalysen der angereicherten AOR-Fraktionen und begleitende Wachstumsversuche mit verschiedenen Molybdat- und Wolframat-Konzentrationen zeigten, dass die AOR tatsächlich einen Wolfram-Cofaktor enthält und dieser nicht wirksam durch einen Molybdän-Cofaktor ersetzt werden kann. Folglich muss A. aromaticum zur selben Zeit spezifisch mindestens ein Mo- (Nitrat-Reduktase) und ein W-Enzym (AOR) herstellen können. Während die meisten Enzyme aus dem Molybdän-Cofaktor-Biosyntheseweg auch zur Biosynthese des Wolfram-Cofaktors dienen können, wurden in dieser Arbeit durch bioinformatische Analysen mehrere Enzyme gefunden, die eine Metall-Spezifität unterstützen könnten. Dazu gehören Molybdat- und Wolframat-spezifische Transporter und Enzyme, die das Metall auf den Cofaktor übertragen. Außerdem wurden Proteine aus dem Cofaktor-Biosyntheseweg gefunden, die in enger Assoziation mit AORs codiert werden und möglicherweise auch bei der Bereitstellung des richtigen Cofaktors eine Rolle spielen. Durch Anreicherung der NAD(P)-abhängigen Phenylacetaldehyd-oxidierenden Aktivitäten konnte das zugehörige Enzym, eine Aldehyd-Dehydrogenase, die durch das Gen ebA4954 codiert wird, identifiziert werden. Die Phenylacetaldehyd-Dehydrogenase (PDH) wurde heterolog produziert, mithilfe eines C-terminalen Strep-Tags aufgereinigt und biochemisch charakterisiert. Es handelt sich um ein Homotetramer, das sehr spezifisch für Phenylacetaldehyd ist, eine kooperative Kinetik zu diesem Substrat zeigt, stark durch steigende Phenylacetaldehyd-Konzentrationen inhibiert wird und sowohl NAD als auch NADP reduzieren kann. Die Ergebnisse dieser Arbeit führen zu der neuen Hypothese, dass die PDH das Schlüsselenzym für den Phenylalanin-Stoffwechsel ist. Es wurde gezeigt, dass die AOR nicht essentiell für das denitrifizierende Wachstum auf Phenylalanin ist, aber verschiedenste Aldehyde mit ähnlichen Reaktionsgeschwindigkeiten oxidieren kann. Deshalb ist es vorstellbar, dass der AOR eine Funktion zur Detoxifizierung reaktiver Aldehyde zukommt, wenn der Stoffwechsel aus dem Gleichgewicht gerät. Die Erkenntnis, dass A. aromaticum gleichzeitig Molybdän- und Wolfram-Enzyme produzieren kann, eröffnet viele neue Fragestellungen und Forschungsansätze.

Influenza-A-viruses cause highly contagious respiratory infections in different species against which vaccination provides the most effective protection. Presently the majority of influenza vaccines are still produced in embryonated chicken eggs but the development of cell culture-based systems is increasing (e.g. MDCK- and Vero-cells). The producible antigen yield that is highly dependent on the seed virus growth capacities is the major limiting factor for sufficient vaccine supply. In particular for emerging pandemic viruses the recoverable amounts of antigen are often very low (such as those of the H1N1 pandemic of 2009 and potentially pandemic H5N1 isolates). The focus of this work was to generate higher antigen yields by using an alternative acceptor strain for the generation of the reassortant seed viruses to be used for vaccine production. Usually the human H1N1-subtype isolate A/Puerto Rico/8/1934 (PR8) is the recommended high-yield acceptor strain for the integration of the surface antigen proteins of circulating viruses. In this study the suitability of the non-pathogenic, attenuated variant FPVmut of the avian influenza strain A/chicken/Rostock/1934 (H7N1) to serve as an alternative background strain was explored. For this purpose recombinant reassortant viruses were generated in both acceptor strain backgrounds that contained the antigenic surface proteins hemagglutinin and neuraminidase (HA and NA) of selected seasonal and (potentially) pandemic donor viruses (subtypes H1N1, H1N1pdm, H3N2, H5N1, H9N2). Further, due to its established function in promoting viral particle formation the potential influence of the incorporation of the HA- and NA-homologous M1 protein was analyzed. Both acceptor strains, FPVmut and PR8, produced almost identical viral yields when propagated in embryonated chicken eggs, MDCK- and Vero-cells. However, we found that the onset of virus production and growth to high titers in MDCK cells was faster for FPVmut than for PR8. Both acceptor strains were equally suitable for the generation of recombinant reassortant viruses applying a “reverse genetics” approach. For reassortants carrying HA and NA from an avian donor strain a more rapid and pronounced cell-to-cell spread was detectable in the FPVmut acceptor background. No significant differences were observed in the NA yields or the virus morphology depending on the background strain or the genetic composition. When using a potentially pandemic avian H5N1 strain as HA and NA donor a significant increase in the antigen yield was obtained in chicken eggs with FPVmut-reassortants. Both, higher average and maximum HA-titers and higher absolute amounts of HA-antigen were reached in the allantoic fluid of infected eggs in the FPVmut-background. This finding was even more pronounced in the Vero cell production system where the HA-antigen yields achievable with the FPVmut-reassortants were threefold higher than those of the PR8-reassortants. For the H9N2 isolate the incorporation of the surface proteins homologous M gene segment within the FPVmut genetic background resulted in an 1,5-fold increase in antigen yield. Similarly, for the H1N1pdm09 donor virus the highest individual values of the HA yields were measured in the PR8 background with the homologous M gene segment. Taken together, these data show that depending on the donor virus the use of the alternative acceptor strain FPVmut and/or the integration of the homologous M1 protein are effective approaches to optimize the composition of influenza vaccine seed viruses to achieve higher HA antigen yields. Therefore, both approaches could be of good value for the production of future seasonal and pandemic vaccines., Influenza-A-Viren lösen beim Menschen hochansteckende Infektionen der Atemwege aus, die in Abhängigkeit des Immunstatus der Person und der Pathogenität des Virus unterschiedlich schwere Krankheitsverläufe nehmen können. Eine Impfung bietet hierbei den effektivsten Schutz vor einer Infektion und den damit einhergehenden gesundheitlichen Komplikationen. Zum jetzigen Zeitpunkt erfolgt die Herstellung der Impfstoffe überwiegend in embryonierten Hühnereiern, jedoch zunehmend auch in zellkulturbasierten Vermehrungssystemen (MDCK- und Vero-Zellen). Einer der wichtigsten limitierenden Faktoren für die ausreichende Impfstoffversorgung der Bevölkerung stellt dabei die erzeugbare Antigenausbeute dar, die abhängig von dem eingesetzten Saatvirus stark variabel sein kann. Insbesondere bei neu auftretenden pandemischen Viren, wie z.B. denen der H1N1-Pandemie 2009 sowie den H5N1-Isolaten, sind die erzielbaren Antigenmengen häufig sehr niedrig. In dieser Arbeit wurde mit dem Fokus höhere Antigenausbeuten zu erzielen, die Eignung der apathogenen, attenuierten Variante FPVmut des hochpathogenen aviären Influenzastammes A/Huhn/Rostock/1934 (H7N1) als neuer, alternativer Akzeptorstamm für die Generierung der Impfstoffsaatviren im Vergleich zu dem gegenwärtig durch die WHO empfohlenen humanen H1N1-Stamm A/Puerto Rico/8/1934 (PR8) analysiert. Zusätzlich wurde der Einfluss der Inkorporation des zu den Oberflächenantigenen Hämagglutinin und Neuraminidase (HA und NA) homologen M-Gens in die Saatviren untersucht. Hierzu wurden mittels des Reversen-Genetik-Systems Doppel-Reassortanten (HA+NA) sowie Triple-Reassortanten (HA+NA+M) in den beiden zu vergleichenden Akzeptorstämmen hergestellt. Bei dieser Reassortierungsmethode kann die genetische Zusammensetzung der zu erzeugenden rekombinanten Viren vorab gezielt festgelegt werden, da die Virusgenerierung ausschließlich ausgehend von klonierter cDNA erfolgt. Hierzu werden acht für die Gensegmente kodierenden Plasmide in Zellen transfiziert. Als Donorviren wurden sowohl saisonale Viren der Subtypen H1N1 und H3N2 als auch (potenziell) pandemische Isolate der Subtypen H1N1pdm09, H5N1 und H9N2 eingesetzt. FPVmut zeichnet sich bei Vermehrung in embryonierten Hühnereiern sowie MDCK- und Vero-Zellen durch identische Ausbeuten im Vergleich mit dem aufgrund seiner guten Wachstumseigenschaften für die Erzeugung von Influenzasaatviren standardmäßig eingesetzten PR8-Isolat aus. Zusätzlich erwiesen sich beide Hintergrundstämme grundsätzlich als gleichermaßen geeignet für die Erzeugung rekombinanter Viren, da mit ihnen im selben Zeitrahmen ein identischer Satz an Reassortanten erzeugt werden konnte. Bei der Untersuchung der Replikationseigenschaften zeigte sich, dass bei den Viren mit dem FPVmut-Hintergrund eine produktive MDCK-Zellinfektion zu früheren Zeitpunkten einsetzte und ergänzend bei den aviären Donor-Isolaten eine gesteigerte Infektionsausbreitung beobachtet werden konnte. Kein wesentlicher Unterschied war in der NA-Ausbeute oder der Virusmorphologie in Abhängigkeit von dem Hintergrundstamm oder der genetischen Zusammensetzung festzustellen. Bei Verwendung des aviären H5N1 konnte eine deutliche Steigerung der Antigenausbeute im Hühnerei- und noch signifikanter im Vero-Anzuchtsystem erzielt werden, wodurch sich für dieses potenziell pandemische Isolat das FPVmut als ein leistungsfähigerer Akzeptorstamm im Vergleich zu dem PR8-Standardsystem herausstellte. Hierbei wurden sowohl höhere gemittelte als auch maximal erreichbare HA-Titer sowie höhere absolute HA-Antigenmengen in der Allantoisflüssigkeit infizierter Hühnereier gemessen. Bei der Vermehrung in Vero-Zellen wurden in den Doppel-Reassortanten nach einer 72-stündigen Inkubation 3fach höhere HA-Antigenmengen im FPVmut Akzeptorstamm erhalten. Im Falle des H9N2-Isolates bewirkte die Inkorporation des homologen M-Gensegmentes im FPVmut-Hintergrund eine Steigerung der Antigenausbeute um den Faktor 1,5. Auch bei dem H1N1pdm09-Isolat wurden die höchsten Einzelwerte der HA-Ausbeuten nach Inkorporation des M-Gensegmentes im PR8-Hintergrund gemessen. Somit konnte gezeigt werden, dass sich isolatabhängig Triple-Reassortanten als sinnvolle Variation der genetischen Zusammensetzung der Saatviren eignen können und die Verwendung eines aviären Akzeptorstammes zu einer deutlichen Steigerung der erzielbaren HA-Antigenausbeute in unterschiedlichen Vermehrungssystemen führen kann.

Sound management and conservation of insect communities and forests require a thorough understanding of the factors affecting insects and their habitats. Insects play an essential role in forest ecosystems. Many species of forest insects, e.g., the gypsy moth (Lymantria dispar L), impose a great danger on forests by defoliating trees. Other species, such as butterflies, are considered indicator species for nature conservation. The purpose of this dissertation is to provide some insight into the relationship between insects and forests. I use moths as a model to study the processes affecting insect assemblages, tree-insect interactions and population dynamics of insects. In the first chapter, I present the topics of my dissertation starting with a general introduction about the roles of insects in forests. The second chapter points out the effects of environmental and neutral processes on species compositions. I particularly disentangle the effects of environmental versus spatial distance on the compositions of moth assemblages. Two statistical approaches were applied for this purpose: the raw and distance approaches. Our results show that both environmental and spatial distance influence the composition of species assemblages. Thus, environmental and neutral processes contribute to the diversity of Lepidoptera insects in Bavarian forests. However, the statistical methods (raw and distance approaches) showed inconsistent results with regard to the relative importance of each process on moth assemblages. In the third chapter, I investigate the effects of the diversity of tree stands on insect herbivory on oak and whether the effects of tree diversity on herbivory damage are reflected by the performance (leaf consumption, growth) of the generalist herbivore Lymantria dispar. The study shows that the damage on oak caused by herbivores decreases with the increased diversity of tree stands. This decrease is not reflected by the performance of a generalist herbivore (Lymantria dispar), neither in field nor in lab assays. Hence, the changes in the tree quality do not explain the reduction of damage by herbivores. Alternative mechanisms such as natural enemies and resource dilution (associational resistance) are suggested. In the fourth chapter, I study and review factors affecting the population dynamics of forest insects. I use the foliage feeding insect, the gypsy moth (Lymantria dispar), as a study- model. I highlight the role of natural enemies in the population dynamics and population cycles of the gypsy moth in its native and invasive ranges. The results show that natural enemies have a large impact on the population dynamics of the gypsy moth because they cause the highest mortality rates. Among parasitoids, the tachinids cause the highest rates of mortality in larvae and pupae populations. These mortality rates increase in the northern latitudes. Furthermore, the effects of the parasitoids seem to be density dependent. Parasitoids are thought to influence the population cycles in the native range. In the invasive range, predators were reported to be responsible for the population cycles. Certain types of forests and host plants were additionally reported to influence population cycles in the invasive range. We speculate that the population dynamics of the gypsy moth is largely influenced by the interaction of several factors, basically weather, host plants and natural enemies. However, this may differ between native and invasive ranges.

Antiviral medication is an important option for treatment of influenza virus infections. Two classes of anti-influenza drugs are available for prophylaxis and treatment of the infections: M2 ion channel inhibitors and neuraminidase inhibitors. However, most of the currently circulating influenza A virus strains are resistant to M2 inhibitors, and wide spread application of neuraminidase inhibitors is increasing resistance to these drugs. Therefore, discovery of new antiviral drugs and more efficient therapeutic approaches are urgently needed. The hemagglutinin (HA) protein is the major membrane glycoprotein of influenza A viruses. It facilitates binding of the virus to host cell receptors and mediates fusion between viral and endosomal membranes. Precursor HA0 must be activated by host proteases to gain its fusion capacity. The cleavage motif of HA is a major determinant of influenza virus pathogenicity. HA of highly pathogenic avian influenza virus (HPAIV) of subtypes H5 and H7 contains a multibasic cleavage motif, which is activated by the eukaryotic subtilase furin. Furin’s essential role during the HPAIV infection makes it an attractive drug target. Novel peptidomimetics imitating the furin recognition motif -R-X-K/R-R- proved to be efficacious anti-HPAIV inhibitors. They interfered with the proteolytic activation of HA and suppressed virus replication in cell cultures. Combination of oseltamivir and ribavirin with a furin inhibitor had synergistic antiviral effects. Furthermore, it suppressed the development of oseltamivir-resistant variants. Therefore, combination treatment is considered as a promising approach for the control of HPAIV.

Eisen ist ein essentielles Spurenelement mit entscheidenden Funktionen in einer Vielzahl an metabolischen Prozessen wie der mitochondrialen Atmung, Aminosäure- und Nukleotid-Synthese, Ribosomen-Assemblierung, DNA-Replikation und DNA-Reparatur. Jedoch sind erhöhte zelluläre Eisenkonzentrationen toxisch für die Zelle. Daher ist eine exakte Regulation des intrazellulären Transports und der Erfassung des Eisenstatus erforderlich, um sowohl Eisenmangel als auch Eisenüberschuss zu vermeiden. Die vorliegende Arbeit widmet sich deshalb dem Mechanismus der mitochondrialen Eisenaufnahme und der Adaption an erhöhte Eisenmengen. Mitochondrien sind essentielle Organellen, die unter anderem eine entscheidende Rolle in der Eisen-Schwefel-(Fe/S)-Cluster- und in der Häm-Biogenese spielen. Aufgrund dieser Stoffwechselleistungen konsumieren Mitochondrien den größten Anteil des in die Zelle aufgenommenen Eisens. Frühere Studien konnten die mitochondrialen Carrier-Proteine Mrs3 und Mrs4 als mitochondriale Eisentransporter charakterisieren. Allerdings ist die simultane Deletion beider Gene für die Hefezellen nicht letal. Da die Fe/S-Cluster Biogenese essentiell ist, lässt dies auf einen weiteren Carrier schließen, der ebenfalls in der Lage ist, Eisenionen zu transportieren. Ein vielversprechender Kandidat ist der mitochondriale Carrier Rim2. Auch wenn dieser ursprünglich als Pyrimidintransporter charakterisiert wurde, häufen sich die Hinweise auf eine zusätzliche Funktion in der Eisenaufnahme. Dabei stellt sich die Frage, inwiefern sich die gut dokumentierte Transportfunktion für Pyrimidine mit einer möglichen Rolle im Eisentransport vereinen ließe. Im ersten Teil dieser Arbeit konnte gezeigt werden, dass die zusätzliche Deletion von RIM2 die in mrs3/4Δ Zellen vorhandene Defekte im Wachstum und in der Biosynthese von Eisen-abhängigen Proteinen verstärkt. Dagegen rettet die Überexpression von RIM2 in mrs3/4Δ Zellen die Maturierung der Fe/S-Proteine und der Häm-Synthese auf Wildtypniveau. Demzufolge sind hohe Konzentrationen von Rim2 ausreichend, um die mitochondriale Eisenversorgung in mrs3/4Δ Zellen wiederherzustellen. Der direkte biochemische Nachweis für eine Transportfunktion von Rim2 wurde durch in vitro Transportexperimente mit sog. submitochondrialen Partikeln in Zusammenarbeit mit der Arbeitsgruppe Dr. Wiesenberger (Wien) geliefert. Zusammengenommen zeigen die in vivo, in organello und in vitro Experimente, dass Rim2 als mitochondrialer Carrier den obligatorischen Co-Transport von Pyrimidinen und divalenten Metallionen einschließlich Fe2+ vermittelt. Diese Modelvorstel-lung erklärt, wie die mitochondriale Eisenaufnahme in mrs3/4Δ Zellen gesichert werden kann und wie Rim2 als „high copy suppressor“ von mrs3/4Δ Zellen fungiert. Eine Funktion des Rim2 in der mitochondrialen Eisenhomöostase unter normalen physiologischen Bedingungen, d.h. in Anwesenheit von Mrs3 und Mrs4, ist jedoch vernachlässigbar. Der zweite Teil dieser Arbeit konzentrierte sich auf die Charakterisierung des Sensors für hohe Eisenkonzentrationen, Yap5, der eine zentrale Rolle bei der Anpassung an toxische Eisenmengen in S. cerevisiae spielt. Bei Eisenüberschuss aktiviert der Transkriptionsfaktor Yap5 die Expression von CCC1, dem einzigen bekannten vakuolären Eisenimporter, was zur Speicherung von Eisen in der Vakuole und damit zur Vermeidung einer toxischen Eisenakkumulation im Cytosol führt. Wie Yap5 biochemisch den Eisenstatus der Zelle erfasst, ist allerdings unklar. Zunächst konnte die direkte Bindung von radioaktivem Eisen (55Fe) an die Aktivator-Domäne von Yap5 (tYap5) in vivo nachgewiesen werden. Zirkular-dichroismus-, Elektronenspinresonanz- und Mößbauer-Spektroskopie des rekombinanten tYap5 belegten die Bindung eines [2Fe-2S]-Clusters an tYap5 nach chemischer Rekonsti-tution. Dieser [2Fe-2S]-Cluster wird durch die N-terminale Cystein-reiche-Domäne (n-CRD) in der Aktivator-Domäne koordiniert und ist entscheidend für die transkriptionelle Aktivität. Des Weiteren induziert die Fe/S-Cluster-Bindung an tYap5 eine Konformationsänderung, die möglicherweise geeignet ist, die Transkriptionsaktivität von Yap5 zu modulieren. Zusätzlich bindet Yap5 in vitro einen zweiten Fe/S-Cofaktor an der C-terminalen CRD, der nicht an der Regulation der transkriptionellen Aktivität von Yap5 in vivo beteiligt ist. Dagegen ist das Fe/S-Cluster-Bindungsmotiv innerhalb der regulatorischen n-CRD von Yap5 in mehreren Pilzarten konserviert, u.a. auch im Aspergillus Transkriptionsfaktor HapX. Daher könnte dieses Motiv als konservierte Bindungsstelle für einen sensorischen Fe/S-Cluster in der eukaryotischen Stressantwort fungieren. Zusammengefasst hat diese Arbeit an Yap5 grundlegende neue Einblicke in den transkriptionellen Mechanismus der Erfassung und Regulation des Eisenstatus in Pilzen geliefert. Yap5 konnte somit als erster eukaryotischer Transkriptionsfaktor, der einen Fe/S-Cluster als Sensor für intrazelluläre Eisenkonzentrationen nutzt, charakterisiert werden.

Ustilago maydis, der Erreger des Maisbeulenbrandes, ist ein biotrophes Pflanzen-pathogen, das auf lebendes Pflanzengewebe angewiesen ist, um seinen Lebenszyklus zu beenden. Dies erfordert eine effiziente Unterdrückung des pflanzlichen Immunsystems, was durch die Sekretion sogenannter Effektorproteine erzielt wird. Ein Beispiel für einen solchen Effektor ist Pit2 (Protein important for tumors 2, Um01375). pit2-Deletionsmutanten können zwar Maispflanzen kolonisieren, sind jedoch nicht mehr dazu fähig, die Entstehung der für diesen Pilz charakteristischen Pflanzentumore zu induzieren. Stattdessen kommt es zu verstärktem Auftreten von Chlorosen in infizierten Pflanzen, was auf eine erhöhte Aktivität pflanzlicher Abwehrmechanismen hindeutet. Es konnte gezeigt werden, dass Pit2 mit den Abwehr-assoziierten apoplastischen Cysteinproteasen CP1A/B, CP2 und XCP2 interagiert und diese spezifisch inhibiert. Durch Sequenzvergleiche mit Pit2-Orthologen aus verwandten Brandpilzen konnte ein 14 Aminosäuren umfassendes Motiv (PID14) identifiziert werden, welches zur Protease-Interaktion und -Inhibition benötigt wird und zudem essentiell für die Virulenz von U. maydis ist. Darüber hinaus können synthetische UmPID14-Peptide apoplastische Maisproteasen inhibieren und die Virulenz der pit2-Deletionsmutanten partiell wieder herstellen. Diese Ergebnisse zeigen, dass Pit2 durch Inhibition apoplastischer Cysteinproteasen die pflanzliche Abwehr blockiert und dem Pilz dadurch die Etablierung und Aufrechterhaltung einer biotrophen Interaktion ermöglicht. Zusätzlich konnte durch Komplementationsversuche gezeigt werden, dass Pit2-Orthologe aus den verwandten Brandpilzen Ustilago hordei, Sporisorium reilianum oder Melanopsichium pennsylvanicum im U. maydis-Mais-Pathosystem nicht funktionell sind. Es wurde außerdem gezeigt, dass die orthologen PID14-Regionen innerhalb von UmPit2 die Funktion der UmPID14 in planta nicht ersetzen können. Umgekehrt war es jedoch möglich, die Wildtypvirulenz mithilfe von Chimären bestehend aus den orthologen Pit2-Proteinen kombiniert mit der UmPID14-Region teilweise wieder herzustellen. Insgesamt deuten diese Beobachtungen auf eine Wirtsspezifität der verschiedenen Pit2-Orthologe hin, die durch die jeweilige PID14-Region determiniert wird.

Diese Studie ist ein Bewertungsmodell der Nachhaltigkeit in einem Biosphärenreservat. Es wurde im La Amistad Panama Biosphärenreservat (RBLAP), im Nordwesten der Republik von Panama in Mittelamerika eingesetzt. Das Bewertungsmodell, welches hier dargestellt wird, soll universell in der Analyse der Nachhaltigkeit in allen anderen Biosphärenreservaten der Welt anwendbar sein. Aufgrund der Existenz von zahlreichen Indikatoren zur Nachhaltigkeit, habe ich in dieser Forschung als Hauptmethode die von der Kommission der Vereinten Nationen empfohlenen Indikatoren für nachhaltige Entwicklung (CSD-Indikatoren) verwendet, unter Berücksichtigung der Tatsache, dass diese komplette Reihe von Indikatoren, in umfangreichen globalen Konsultationen bereits diskutiert und mit breitem Konsens in der globalen Agenda (zu diesem Thema) angenommen wurden. Diese Studie zeigt auch, im Sinne einer didaktischen Übung, wie Empfehlungen zu Fragen der nachhaltigen Entwicklung in globalen Foren weiterentwickelt wurden, vor allem seit 1980 mit der Veröffentlichung des World Conservation Strategy der IUCN (International Union for Nature Conservation) und dem Brundtland-Bericht von 1987 sowie Folgekonferenzen der Vereinten Nationen über die Entwicklung und Umwelt. Based from these ideas, the concept of the Biosphere Reserve developed the own conceptual framework, or guidelines of sustainable development, beyond the biological issue of biodiversity conservation per se. Anhand dieser Ideen, das Konzept des Biosphärenreservats innerhalb des eigenen konzeptionellen Rahmen hinzugefügt, diese Leitlinien der nachhaltigen Entwicklung, über die Frage der Erhaltung der biologischen Vielfalt an sich. Die vorgeschlagenen Indikatoren zur Beurteilung der Nachhaltigkeit in einem Biosphärenreservat werden von dem internationalen Kontext unterstützt und ermöglichen somit deren universelle Anwendung. Die Bewertung der einzelnen CSD -Indikatoren in LAPBR war notwendig, um mit Sicherheit, das Ausmaß der Fläche des Biosphärenreservats zu definieren. Diese Studie untersucht die Grenzen des Kerns, Puffer- und Übergangszonen des LAPBR. Das vorhandene Kartenmaterial wurde aktualisiert und verbessert, weil viele Indikatoren eine präzise Flächenangabe erfordern, um in der Studie untersucht werden zu können. Das Ergebnis der Nachhaltigkeitsanalyse basiert auf einem Netzwerk von Indikatoren, die in drei Säulen eingeteilt werden. Diese drei Hauptsäulen der nachhaltigen Entwicklung werden in dieser Forschung vorgestellt: Die Sozial-, Umwelt- und Wirtschaftsfragen. Diese Säulen sind in Unterthemen unterteilt, um so auch didaktische Zwecke zu erfüllen. So hat das RBLAP einen Gesamtfortschritt von 56,3% in der Nachhaltigkeit aufzuweisen, was einen sehr geringen Prozentsatz im Vergleich zu dem minimalen annehmbaren Wert von > 70% darstellt. Betrachtet man die Analyse der nachhaltigen Entwicklung in den drei einzelnen Säulen, so bekommt man die besten Werte im Bereich Umwelt mit 73,3%, gefolgt von 46,7% im sozialen Bereich und 36,1 % für den wirtschaftlichen Bereich. In der Synopse der Studie wird ersichtlich, dass bei Einteilung der CSD-Indikatoren in Unterthemen, die Vervendbarkeit dieser der allgemeine Öffentlichkeit und bei Entscheidungsträgern möglich ist. Ebenso können diese Indikatoren für die Entwicklung von Programmen und Projekten in Biosphärenreservaten bei denen man das Niveau der Fortschritte in der nachhaltigen Entwicklung erhöhen will dienlich sein., This study is a valuation model of sustainability in a biosphere reserve. It was applied to the La Amistad Panama Biosphere Reserve (RBLAP), located in the northwest of the Republic of Panama, in Central America. The evaluation model is intended to be widely used in the analysis of whole sustainability and nature conservation status in any other biosphere reserve of the world. As the main methodology were used the indicators recommended by the United Nations Commission on Sustainable Development (CSD indicators). They were chosen because they are the most complete set of indicators available. They have been discussed in extensive global consultations and adapted with consensus on the global agenda on this topic. This study also shows, in the sense of a didactic exercise, how recommendations on sustainable development issues were evolving in global forums, especially since 1980 with the publication of the World Conservation Strategy of IUCN (International Union for Conservation of the Nature) and the Brundtland Report of 1987 and subsequent United Nations conferences about development and environment. Based from these ideas, the concept of the Biosphere Reserve developed the own conceptual framework, or guidelines of sustainable development, beyond the biological issue of biodiversity conservation by itself. The valuation of each of the CSD indicators in LAPBR was necessary to define with certainty the extent of the area of the biosphere reserve. This study analyzed the boundaries of the core, buffer, and transition zones of the LAPBR. The map of LAPBR was clearly defined, because many indicators under analysis required a precise area for the analysis. The result of sustainability analysis is based on a network of indicators that are grouped in three pillars. These three main theoretical pillars of sustainable development are presented in this research: The social, the environmental (segregated in general and nature conservation) and the economic pillar. These pillars are divided into sub-issues in order to deal with more specific analysis. Thus, the RBLAP has a total of 56.3% of progress in sustainability, which is a low percentage compared to the acceptable minimum (>70%). In the pillar analysis, the best progress in sustainable development is the environmental pillar with 73.3%, 46.7% for social pillar and 36.1% for the economic pillar. The progress for the environmental sub-pillar about general-physical indicators was 71.64% and for the environmental sub-pillar of nature conservation was 75%. The synopsis of the study shows that if the CSD indicators are segregated into subpillars and themes then they can be used for the public and decision-makers, and of course, for development programs and projects in a biosphere reserve with the purpose to improve the levels of advances in sustainable development. The conclusions show that the whole set of CSD indicators used are adequate to properly assess sustainability, including analysis of nature conservation within a biosphere reserve, and therefore can be seen as the best way to incorporate a priority and biologically rich area within the global agenda of sustainable development.

Ziel dieser Arbeit war die Produktion und Reifung einer O2-toleranten [NiFe]-Hydrogenase, der SH aus Cupriavidus necator (Cn), in Escherichia coli (Ec). Zu diesem Zweck wurde zunächst ein verfügbares Basis-Klonierungssystem (StarGate®, IBA) erweitert, um den Anforderungen einer Multigen- und Hochausbeute-Expressionsplattform für den Modellorganismus Escherichia coli zu entsprechen. Die erste Erweiterung beinhaltete das Design neuer Fusionsvektoren, die jedes Gen unter Kontrolle individueller T7-Promotoren und –Terminatoren stellen und die Verknüpfung jedes Genprodukts mit N- oder C-terminalen StrepII-Tags ermöglichen. Unter Einsatz des neuen Systems wurden insgesamt 21 Hydrogenase-assoziierte Cn-Gene, darunter die fünf SH-Stukturgene sowie zwei vollständige Sätze putativer Reifungsgene, systematisch zu funktionalen Multigen-Einheiten (Modulen) assembliert. Die Koexpression von bis zu 10 Genen innerhalb von SH- oder Reifungsmodulen auf einem Plasmid konnte erfolgreich demonstriert werden. Um eine Kombination der SH-Gene mit den Reifungsmodulen in einer Zelle zu ermöglichen, erfolgte anschließend die Entwicklung kompatibler Akzeptorvektoren. Daraufhin konnten Expressionsstämme mit unterschiedlichen Vektor- und Modul-Kombinationen generiert, und damit sowohl SH-Produktions- als auch kombinatorische Studien zum SH-Reifungsprozess ermöglicht werden. SH-Produktionsversuche mit rekombinanten Ec-Stämmen deuteten darauf hin, dass die maximale Löslichkeit und Funktionalität der Reifungsproteine nicht nur von der Gendosis und Expressionsrate, sondern auch maßgeblich von einem transienten, wachstumsabhängigen zellulären Milieu abhängig ist. Aus diesem Grund wurde eine spezielle Kultivierungsstrategie zur SH-Produktion erarbeitet, welche auf einem bekannten Laktose-Autoinduktionssystem basiert. Im Zuge umfangreicher Optimierungsstudien wurden aerobe Langzeit-Kultivierungen mit sequentieller Modifikation der physikalischen Wachstumsparameter und der Medienzusammensetzung vorgenommen. Die Strategie wurde auf die rekombinanten Stämme angewendet und ergab eine einheitliche maximale SH-Aktivität innerhalb der mittstationären Phase 36–40 Stunden nach Inokulation. Maximale spezifische Aktivitäten in Extrakten lagen mit 7,2 U•mg-1 in der Größenordnung der Werte, welche bei optimierten Kultivierungen zur Produktion nativer SH in Cn erreicht wurden. Die Kombination der vorgestellten Expressionsplattform mit dem erarbeiteten Kultivierungsprozess stellt somit die erste Hochausbeute-Produktionsplattform für eine rekombinante [NiFe]-Hydrogenase dar. StrepII-getaggte SH-Varianten konnten homogen aus Zellen rekombinanter Stämme isoliert werden. Mit bis zu 227 U•mg-1 wurde hierbei die höchste bisher für die SH dokumentierte spezifische Aktivität erreicht. In diesen hochreinen Präparationen war die Enzymausbeute verringert, lag jedoch stets im Milligramm-Bereich pro Liter Kultur. Sowohl hinsichtlich der oligomeren Enzymstruktur als auch der katalytischen Eigenschaften entsprachen die rekombinanten Varianten der aus Cn-Zellen isolierten Wildtyp-SH. Durch Entwicklung der kombinatorischen Expressionsplattform wurden innovative Strategien zur Untersuchung des Reifungsprozesses von [NiFe]-Hydrogenasen ermöglicht. Dies wurde anhand der SH als Modellenzym demonstriert. Einzelne Proteine sowie essentielle Reifungs-Intermediate (Komplexe) zweier unabhängiger Reifungsmodule aus Cn wurden rekombinant produziert und gereinigt. Dies lieferte Hinweise darauf, dass die Stabilität der einzelnen Reifungsproteine in vivo stark von der Ausbildung oligomerer Formen und stöchiometrischer Reifungs-Komplexe abhängt. Durch Reinigung der SH-spezifischen Endopeptidase HoxW konnten darüber hinaus Hinweise auf ein redoxaktives [4Fe-4S]-Cluster mit bislang unbekannten Eigenschaften geliefert werden. In-vivo-Deletions- und Substitutionsstudien mit analogen Reifungsproteinen (Hyp) verschiedener Module aus Cn und Ec lieferten darüber hinaus Erkenntnisse über Spezifitäten und damit die Möglichkeit partieller Komplementation. Durch Entwicklung eines zellfreien in-vitro-Reifungssystems für die SH konnten die in-vivo-Experimente anschließend entscheidend ergänzt werden. Essentielle Komponenten und limitierende Faktoren des Reifungsprozesses wurden ermittelt. Erste „Pulldown“-Experimente lieferten Hinweise darauf, dass bislang unbekannte Reifungsintermediate durch das in-vitro-System identifiziert werden könnten. Dadurch erweist sich die vorgestellte Methodik als potentes grundlagenorientiertes Werkzeug zur Untersuchung des Reifungsprozesses.

Prenylated aromatic compounds are widely distributed in nature and many of these compounds display interesting biological and pharmaceutical activities. The transfer of prenyl moieties to aromatic substrates is catalysed by aromatic prenyltransferases, and the multitude of possibilities for attachment of these moieties gives rise to a large structural diversity. Investigation of the functions of aromatic prenyltransferases would therefore help to elucidate the biosynthetic pathways of those natural compounds in the producing organism, as well as the applicability of these enzymes for chemoenzymatic synthesis of biologically active compounds for pharmaceutical purposes. Four putative prenyltransferase genes of the dimethylallyltryptophan synthase (DMATS) superfamily from Aspergillus nidulans (A. nidulans) were investigated as one part of this thesis. The genes xptA, xptB, ANID_10289 and ANID_11080 were cloned, and the two putative xanthone prenyltransferase genes xptA and xptB were overexpressed in Escherichia coli (E. coli). Both recombinant prenyltransferases were purified to near homogeneity using affinity chromatography with Ni-NTA and investigated biochemically. In this thesis, the enzyme XptB was confirmed to function as a xanthone prenyltransferase, catalysing a regiospecific Oprenylation of several xanthones. The enzyme products were isolated on high performance liquid chromatography (HPLC) and analysed by nuclear magnetic resonance spectroscopy (NMR) and mass spectrometry (MS). Another previously postulated substrate, the benzophenone arugosin H, was not accepted by XptB under the tested conditions. No enzyme activity was detected for the second enzyme XptA with postulated or potential substrates. Reports of the enzyme VrtC from Penicillium aethiopicum (P. aethiopicum) implicated that some members of the DMATS superfamily might not be restricted to the usual prenyl donor dimethylallyl diphosphate (DMAPP, C5-unit). VrtC was shown as the first known member of the DMATS prenyltransferases, which accepts geranyl diphosphate (GPP, C10-unit), but not DMAPP, for prenylation of a naphthacenedione substrate. Therefore, the acceptance of prenyl donors, such as GPP and farnesyl diphosphate (FPP, C15-unit), was investigated in this thesis with the prenyltransferases 7-DMATS and CdpNPT, both from Aspergillus fumigatus (A. fumigatus), as well as CdpC3PT and AnaPT, both from Neosartorya fischeri (N. fischeri). It was found that AnaPT accepted, in addition to DMAPP, also GPP as prenyl donor. Furthermore, a shift of the prenylation position was observed. Instead of a reverse C3α-prenylation with DMAPP, C6- and C7-geranylations of tryptophan-containing cyclic dipeptides with GPP were demonstrated in this thesis. This was the first report of the acceptance of both DMAPP and GPP by a member of the DMATS superfamily. The observed shift of the prenylation position by changing the prenyl donor expands the applicability of AnaPT for the production of prenylated compounds. As last part of this thesis, the putative prenyltransferase genes AO090102000322, AO090701000600 and AO090020000527 from Aspergillus oryzae (A. oryzae) were cloned. The recombinant protein BAE61387, encoded by AO090102000322, was successfully overproduced and purified from E. coli. Analysis of neighbouring genes in the genome of A. oryzae revealed no backbone genes for the biosynthesis of a possible natural substrate of BAE61387. The enzyme BAE61387 was therefore incubated with a large number of compounds that are known substrates of enzymes from the DMATS superfamily. Activity was clearly observed in incubation mixtures with hydroxynaphthalenes. Interestingly, these unnatural substrates, which are accepted by several members of this enzyme class, were accepted by BAE61387 in the presence of all three prenyl donors DMAPP, GPP and FPP. The acceptance of all these prenyl donors for regiospecific C-prenylations of hydroxynaphthalenes has never been shown for a member of this enzyme superfamily prior to this work., Prenylierte aromatische Verbindungen sind in der Natur weit verbreitet und viele dieser Stoffe besitzten interessante biologische und pharmazeutische Aktivitäten. Die Übertragung der Prenylreste auf aromatische Substrate wird durch aromatische Prenyltransferasen katalysiert und die Vielzahl der Verknüpfungsmöglichkeiten der Prenylreste ermöglicht eine hohe strukturelle Diversität prenylierter Naturstoffe. Untersuchungen zur Funktion von aromatischen Prenyltransferasen geben einen Einblick in die Biosynthesewege dieser Naturstoffe und bieten diese Enzyme als Werkzeuge in der chemoenzymatischen Herstellung von biologisch aktiven Substanzen für pharmazeutische Anwendungen an. Vier putative Prenyltransferasegene der Dimethylallyltryptophan Synthase (DMATS) Superfamilie aus Aspergillus nidulans (A. nidulans) wurden als ein Teil der vorliegenden Arbeit untersucht. Die Gene xptA, xptB, ANID_10289 und ANID_11080 wurden kloniert, und die beiden putativen Xanthon-Prenyltransferasegene xptA und xptB wurden in Escherichia coli (E. coli) überexprimiert. Die rekombinanten Enzyme wurden mittels Affinitätschromatographie mit Ni-NTA aufgereinigt und biochemisch im Hinblick auf ihre Enzymaktivität und Substratspezifität untersucht. In der vorliegenden Arbeit konnte das Enzym XptB als Xanthon- Prenyltransferase bestätigt werden, welche die regiospezifische O-Prenylierung von einigen Xanthonen katalysiert. Die enzymatischen Produkte wurden mittels high performance liquid chromatography (HPLC) isoliert und mithilfe von Kernresonanzspektroskopie (NMR) und Massenspektrometrie (MS) untersucht. Ein weiteres in der Literatur postuliertes Substrat von XptB, das Benzophenon Arugosin H, wurde unter den getesteten Bedingungen nicht umgesetzt. Für das zweite aufgereinigte Enzym XptA konnte allerdings keine enzymatische Aktivität, weder in Inkubationsansätzen mit dem postulierten Substrat Variecoxanthon A, noch mit anderen potenziellen Substraten nachgewiesen werden. Mit dem Enzym VrtC aus Penicillium aethiopicum (P. aethiopicum) wurde erstmals die Umsetzung einer Naphthacendion-Verbindung mit Geranyldiphosphat (GPP, C10-Einheit) durch eine DMATS-Prenyltransferase beschrieben. Diese Entdeckung führte zu der Annahme, dass nicht alle DMATS-Prenyltransferasen auf den sonst üblichen Prenyldonor Dimethylallyldiphosphat (DMAPP, C5-Einheit) beschränkt sein müssen. In der vorliegenden Arbeit wurden dazu die bekannten Prenyltransferasen 7-DMATS und CdpNPT, beide aus Aspergillus fumigatus (A. fumigatus), sowie CdpC3PT und AnaPT, beide aus Neosartorya fischeri (N. fischeri), auf die Akzeptanz von GPP und Farnesyldiphosphat (FPP, C15-Einheit) untersucht. Von den untersuchten Enzymen konnte für AnaPT, zusätzlich zu DMAPP, eine Umsetzung von Tryptophan-enthaltenden zyklischen Dipeptiden mit GPP nachgewiesen werden. Für sechs zyklische Dipeptide, für welche mit DMAPP zuvor eine reverse C3α- Prenylierung beobachtet wurde, konnte durch die Verwendung von GPP in der vorliegenden Arbeit die Geranylierung durch AnaPT an den Positionen C-6 und C-7 des Indols nachgewiesen werden. Eine Akzeptanz von sowohl DMAPP als auch GPP durch eine DMATSPrenyltransferase wurde somit erstmals demonstriert. Die Akzeptanz von DMAPP und GPP, sowie die beobachtete Verschiebung der Prenylierungsposition durch den Einsatz von Prenyldonoren unterschiedlicher Länge, erhöhen die Nützlichkeit dieses Enzyms zur chemoenzymatischen Synthese prenylierter Verbindungen. Als letzter Teil dieser Arbeit wurden die drei putativen Prenyltransferasegene AO090102000322, AO090701000600 und AO090020000527 aus Aspergillus oryzae (A. oryzae) kloniert. Das putative Produkt BAE61387 von AO090102000322 wurde in E. coli überproduziert und das rekombinante Enzym erfolgreich aufgereinigt. Durch Sequenzanalysen konnten im Genom von A. oryzae in der Nachbarschaft zu AO090102000322 keine Gene identifiziert werden, welche Aufschluss über ein mögliches natürliches Substrat von BAE61387 geben könnten. Das erhaltene Protein wurde daher mit zahlreichen Substraten von bekannten Enzymen der DMATS-Superfamilie inkubiert. Eine enzymatische Aktivität konnte in Inkubationsansätzen mit einigen Hydroxynaphthalin-Derivaten beobachtet werden. Allerdings wurden diese unnatürlichen Substrate, welche von einigen Mitgliedern der DMATSPrenyltransferasen akzeptiert werden, in Gegenwart von DMAPP, GPP und FPP umgesetzt. Die Akzeptanz der drei Prenyldonoren DMAPP, GPP und FPP zur regiospezifischen CPrenylierung von Hydroxynaphthalin-Derivaten durch eine DMATS-Prenyltransferase wurde zuvor noch nicht demonstriert.

Adipositas ist eines der größten Gesundheitsprobleme der modernen Wohlstandsgesellschaft und einer der Hauptrisikofaktoren für die Entstehung von Diabetes mellitus Typ II. Beiden metabolischen Störungen liegen Veränderungen des neuroendokrinen Systems zu Grunde. Hierbei ist vor allem der Verlust der Leptinsensitivität zu nennen, die für die Verknüpfung von Adipositas und Diabetes Typ II verantwortlich sein könnte. Mittlerweile ist das zentrale Nervensystem, insbesondere der mediobasale Hypothalamus (MBH), als Hauptregulationszentrum der zentralen Energie- und Glukosehomöostase anzusehen. Daher ist der Zusammenhang von Adipositas und Diabetes mellitus Typ II auf eine Modulation der beteiligten Signalwege im zentralen Nervensystem zurückzuführen. In dieser Arbeit konnte gezeigt werden, dass der Verlust der zentralen Leptinsignalweiterleitung adipöser Individuen maßgeblich an dem Zusammenhang von Adipositas und Diabetes mellitus Typ II beteiligt ist. Darüber hinaus interagierte Leptin mit dem zentralen WNT/β Catenin- (WNT) Signalweg und inhibierte dabei das Schlüsselenzym, die Glykogen- Synthase- Kinase- 3β (GSK-3β), in Neuronen des MBH. Des Weiteren waren die positiven Effekte von Leptin auf den Glukosemetabolismus von einem intakten WNT- Signalweg abhängig. Im Einklang mit diesen Ergebnissen ging eine zentrale Inhibition der GSK-3β mit einer verstärkten Aktivierung des hypothalamischen Insulin- Signalweges einher, verbesserte die Glukosetoleranz und verringerte die Nahrungsaufnahme von leptindefizienten Mäusen. Eine erhöhte Aktivität im MBH hingegen war mit Adipositas assoziiert, steigerte die Nahrungsaufnahme, führte zu Regulationsstörungen der Energie- und Glukosehomöostase und war mit einer verminderten Leptinsensitivität assoziiert. Diese Daten legen nahe, dass Leptin seine katabolen Eigenschaften über die hypothalamische GSK-3β vermittelt und, dass dieses Enzym als zentraler Regulator des Energie- und Glukosemetabolismus angesehen werden kann. Neben dem zentralen Verlust der Leptinsignalweiterleitung spielen auch noch andere, mit dem Körperfett assoziierte, Faktoren eine entscheidende Rolle bei der zentralen Regulation des Glukosemetabolismus. Neuere Forschungsergebnisse weisen darauf hin, dass die Veränderungen der zentralen Signalwege auf eine hypothalamische Inflammation zurückzuführen sein könnten. Die Zunahme des Fettgewebes geht mit einer erhöhten Sekretion von Zytokinen einher, die pro-inflammatorische Signalwege im Hypothalamus induzieren können. Es konnte gezeigt werden, dass eine erhöhte Aktivität der pro-inflammatorischen c-Jun N-terminale Kinase (JNK) in verschiedenen Nuclei des MBH mit Adipositas assoziiert ist. Die akute Inhibition dieser zentralen Kinase führte zu einer erhöhten Aktivierung des zentralen Insulin- Signalweges und verbesserte die Glukosetoleranz. Die Daten deuten darauf hin, dass die beobachteten Effekte auf eine Inhibition der zentralen GSK-3β zurückzuführen waren, wodurch die Rolle dieser Kinase in der zentralen Regulation der Glukosehomöostase weiter bekräftigt wurde. Neben der JNK ist auch der zentrale pro-inflammatorische NF-κB- Signalweg mit Adipositas verknüpft und eine Aktivierung wird mit einer aktiven GSK-3β in Verbindung gebracht. Eine akute Inhibition dieses Signalweges, mit dem Flavonoid Butein, brachte eine Verbesserung der Glukosetoleranz von diabetischen und adipösen Mäusen mit sich. Des Weiteren verminderte die chronische Inhibition des NF-κB- Signalweges (mittels Gentherapie) im MBH die Zunahme des Körpergewichtes und der Körperfettmasse von Mäusen auf einer hochkalorischen Diät. Dabei verbesserte diese Behandlung die Glukosetoleranz der Tiere, erhöhte die Sauerstoffaufnahme, den Energieverbrauch sowie die basale metabolische Rate und war mit einer erhöhten Leptinsensitivität verbunden. Mit dieser Arbeit konnten neue Aspekte der zentralen Regulation der Energie- und Glukosehomöostase entschlüsselt werden. Unsere Daten deuten darauf hin, dass die zentrale GSK-3β ein Schlüsselenzym ist, welches die metabolischen Eigenschaften von Leptin und Insulin vermittelt. Die Aktivierung dieser hypothalamischen Kinase durch pro-inflammatorische Signalwege scheint die Entstehung einer zentralen Leptinresistenz zu vermitteln, was eine Dysregulation der Glukosehomöostase nach sich zieht. Die zentrale Inhibition dieses Enzyms oder der zugrundeliegenden Inflammation liefert somit neue therapeutische Interventionsmöglichkeiten bei der Entstehung von Adipositas und Diabetes mellitus Typ II.

The tumor suppressor p53 is one of the most frequently mutated proteins in human cancer and has been extensively targeted for cancer therapy. This resulted in wild type p53 gene therapeutic approval for the treatment of head and neck cancer in China. p53 mainly functions as a transcription factor and stimulates a variety of genes involved in the intrinsic and extrinsic apoptotic pathway by binding to p53 responsive elements as a tetramer. In cancer cells, mutations in p53 typically occur in its DNA binding domain (DBD), while its tetramerization domain remains intact. Therefore, mutant p53 can heterotetramerize with wt p53 and abolish its transcriptional activity (dominant negative effect). While transcriptionally active wt p53 is used for gene therapy, mitochondrial p53 has not been fully exploited yet. Targeting p53 to the mitochondria causes a direct rapid apoptotic response by directly interacting with pro-and anti- apoptotic proteins at the mitochondrial outer membrane. Because the monomeric from is sufficient to interact with pro-and anti-apoptotic proteins, mitochondrial p53 is not affected by the dominant negative inactivation. To ensure mitochondrial targeting of p53, we targeted p53 to different mitochondrial compartments; mitochondrial outer membrane, inner membrane and matrix. We have demonstrated that MTSs from the mitochondrial outer membrane are optimal for p53-specific activation. In addition, we discovered the minimal domain of p53, its DNA binding domain (DBD), which is needed for apoptosis induction. Further studies have shown that fusing p53 or DBD to MTS from Bcl-XL causes p53/Bcl-XL specific apoptosis while fusing them to Bak results in p53/Bak specific apoptosis, emphasizing that mitochondrial targeting of p53 is highly dependent on the MTS used. Further, we have shown that DBD fused to the MTS from Bcl-XL can overcome dominant negative inhibition in vitro, but it was unable to shrink dominant negative MDA-MB-468 tumors in an orthotopic mouse model at one dosing regimen attempted. The main theme of this thesis was to design apoptotic proteins based on p53 domains to create modified versions of p53. We focused mainly on optimizing mitochondrial targeting of p53 for cancer therapy but also redesigned the TD of p53 to overcome the dominant negative effect. We substituted the oligomerization domain of p53 with the coiled-coil (CC) domain from BCR to bypass dominant negative inhibition of mutant p53. Our chimeric p53 (p53-CC) can translocate into the nucleus, transactivate genes and cause apoptosis in a similar manner as wt p53. Unlike wt p53, p53-CC does not interact with endogenous mutant p53 and retains apoptotic activity in cancer cells harboring dominant negative mutant p53 in vitro and in vivo. In summary this dissertation focuses on new p53 gene therapeutics, with the potential to overcome current limitations with wt p53 therapy.

Die Fusion der Myoblasten ist ein fundamentaler Prozess bei der Muskelbildung multizellulärer Organismen. Ein hierfür gut untersuchter Modellorganismus ist Drosophila melanogaster, bei welchem die Bildung der somatischen Muskulatur durch die Fusion von Founderzellen (FCs) und fusionskompetenten Myoblasten (FCMs) vollzogen wird. Das eigentliche Fusionsereignis wird durch das spezifische Erkennen und die Adhäsion der beiden Zellpopulationen mit Hilfe der Transmembranproteine eingeleitet. Anschließend wird das Signal intrazellulär an das Aktin-Zytoskelett weitergeleitet, was die Bildung der Fusionsporen und die Verschmelzung der Membranen zur Folge hat. Dabei wird an der Kontaktstelle der fusionierenden Myoblasten ein Adhäsionsring gebildet, in dessen Mitte sich ein Aktin-reiches Zentrum befindet (Kesper et al., 2007). Lebend-Untersuchungen haben gezeigt, dass sich dieser Aktin-Plaque sehr dynamisch verhält und innerhalb von zwei Minuten seine maximale Größe erreicht. Die Auflösung der Plaques dauert nur eine Minute. Mutantenanalysen zeigen, dass die Arp2/3-abhängige Aktin-Polymerisation essentiell für die Myoblastenfusion ist. Die Dynamik der Aktin-Plaques lässt zudem vermuten, dass die Depolymerisation ebenfalls eine entscheidende Rolle spielt. Um diese F-Aktin-basierten Prozesse genauer zu analysieren, wurden in dieser Arbeit mehrere Ansätze verfolgt. Die Arp2/3-abhängige Aktin-Plaque Bildung wird durch die NPFs Scar/Wave und WASP in FCs und FCMs reguliert. Mutationen in der Scar/Wave- als auch der WASP-abhängigen Arp2/3-Aktivierung resultieren in einer Reduktion der Aktin-Plaques, aber nicht in einem Verlust der Aktin-Plaque Bildung (diese Arbeit, Sens et al., 2010). Es wurde daher in dieser Arbeit nach weiteren Komponenten gesucht, die an der Aktin-Plaque Bildung beteiligt sind, wie z.B. das Aktinmonomer-bindende Protein Profilin/Chic (Chic). Die hier durchgeführten Dosisexperimente und Protein-Interaktionsstudien deuten daraufhin, dass Chic sowohl eine Komponente der Scar/Wave- als auch der WASP-abhängigen Aktin-Polymerisation ist. Des Weiteren konnte in diesem Zusammenhang der Arp2/3-Regulator Ena/VASP als eine mögliche neue Komponente der Arp2/3-vermittelten Aktin-Polymerisation während der Myoblastenfusion und der Muskelanheftung identifiziert werden. Ein weiterer Teil meiner Arbeit befasst sich mit der Aktivierung des Scar-Komplexes während der Myoblastenfusion. Dieser erfolgt durch die kleine Rho GTPase Rac bzw. durch ein Zusammenwirken von Rac mit den Komponenten des pentameren Scar-Komplexes. In Drosophila gibt es drei Rac GTPasen, von denen Rac1 und Rac2 während der Myoblastenfusion redundant wirken. Die Expression der konstitutiv-aktiven und dominant-negativen Konstrukte von Rac1 resultiert in einem starken Fusionsphänotyp. Auch die Doppelmutanten für rac1- und rac2 zeigen unfusionierte Myoblasten. In allen Mutanten konnte ich noch die Bildung von Aktin-Plaques beobachten. Zudem zeigen die in dieser Arbeit durchgeführten biochemischen und genetischen Interaktionsstudien eine Interaktion von Rac mit Chic, Scar/Wave, Sra-1 und Kette. Um Aktivatoren bzw. Inaktivatoren für die beiden Rac GTPasen aufzudecken, wurde unter Verwendung der aktivierten Form von Rac1 und Rac2 ein globaler Hefe-2-Hybrid Screen durchgeführt. Unter den potentiellen Interaktionspartnern für Rac1 während der Myoblastenfusion konnten die Csk-Kinase und das Aktin-bindende Protein WupA identifiziert werden. Der letzte Teil dieser Arbeit befasst sich mit der Suche nach Aktin-depolymerisierenden Komponenten, die am Membranzusammenbruch während der Fusion beteiligt sind. Dabei wurden Mutationen im Depolymerisierungsfaktor Cofilin/Twinstar (Tsr) auf Fusionsstörungen untersucht. Weder homozygote tsr-Mutanten zeigten Defekte in der Fusion der Myoblasten, noch die Expression von aktivierten bzw. inaktiviertem Tsr in Myoblasten. Daraufhin wurde ein weiterer Kofaktor, Aip1/Flare (Flr), bezüglich seiner mRNA-Expression analysiert und Doppelmutantenanalysen mit tsr durchgeführt. Die Lokalisation des flr Transkripts konnte dabei in der embryonalen somatischen Muskulatur nachgewiesen werden, sowie auch in den Ovarien, im Testis und in den Imaginalscheiben. Allerdings zeigen flr-Einzelmutanten keine Muskeldefekte. In tsr;flr-Doppelmutanten konnten jedoch schwache Muskelstörungen beobachtet werden, was auf ein potentielles Zusammenwirken der beiden Proteine während der Muskelbildung hindeutet. Zusammenfassend lässt sich aus diesen Ergebnissen postulieren, dass Tsr in funktioneller Redundanz mit weiteren depolymerisierenden Proteinen wirkt.

Peroxisomen sind nahezu ubiquitäre, eukaryotische Zellorganellen, die am Abbau von Fettsäuren und an der Entgiftung des dabei entstehenden Wasserstoffperoxids beteiligt sind. Neben dieser generellen Funktion beherbergen die Peroxisomen weitere Stoffwechselwege. Dazu zählen Teile des Glyoxylatwegs in Pflanzen und Pilzen und Stoffwechselwege für die Bildung von Sekundärmetaboliten. Eine Sonderform der Peroxisomen sind die Glycosomen, die in Trypanosomen identifiziert werden konnten und einen Großteil der glykolytischen Enzyme enthalten. Peroxisomale Matrixproteine enthalten entweder carboxyterminale oder aminoterminale PTS („peroxisomal targeting signal“)-Motive (C-terminal: PTS1; N-terminal: PTS2). Diese werden von zytoplasmatischen Rezeptoren erkannt, die gefaltete und sogar im Komplex vorliegende Proteine in die Peroxisomen überführen. In dem pflanzenpathogenen Basidiomyceten Ustilago maydis konnten im Verlauf dieser Arbeit kryptische PTS1-Motive in einer Reihe von Enzymen aus der Glykolyse bzw. Gluconeogenese identifiziert werden. Peroxisomale Isoformen dieser Enzyme entstehen durch alternatives Spleißen oder durch Überlesen von Stopcodons während der Translation. Eine bioinformatische Analyse ergab, dass in einer Vielzahl von Pilzen Isoformen glykolytischer Enzyme mit PTS1-Motiv gebildet werden, wobei die Mechanismen zur Herstellung dieser Isoformen in unterschiedlichen Spezies variieren. Zudem wurden in einigen glykolytischen Enzymen ungewöhnliche PTS1-Motive gefunden, die vom bisher gültigen Konsensus für PTS1-Motive abweichen und ebenfalls eine duale Lokalisierung der Enzyme in Peroxisomen und dem Zytoplasma hervorrufen können. Bei der genaueren Charakterisierung der Peroxisomen in U. maydis fiel auf, dass diese Organellen nicht nur für die β-Oxidation von Fettsäuren benötigt werden, sondern auch eine Funktion beim Zuckerstoffwechsel und der biotrophen Interaktion mit der Wirtspflanze Mais haben. Außerdem konnte gezeigt werden, dass Peroxisomen in U. maydis an der Synthese eines extrazellulären Glykolipids beteiligt sind. Die Ergebnisse dieser Arbeit legen nahe, dass die Peroxisomen in Pilzen durch eine größere metabolische Vielfalt charakterisiert sind, als bisher angenommen wurde. Die Identifizierung kryptischer PTS1-Motive in Enzymen aus der Glykolyse lässt die Vermutung zu, dass Peroxisomen auch in anderen Organismen noch weitere unerwartete Proteine beinhalten.

Der Wurzelendophyt Piriformospora indica und der Orchideen-Mykorrhiza Pilz Sebacina vermifera (Sebacinales, Basidiomycota) sind in der Lage eine mutualistische Symbiose mit Pflanzen zu etablieren. Beide Pilze kolonisieren dabei die Wurzelrinde einer Vielzahl von Gefäßpflanzen, einschließlich der monokotyledonen Gerste (Hordeum vulgare) und des dikotyledonen Ackerschmalwands (Arabidopsis thaliana). Die Besiedelung der Wirtspflanze durch die Pilze führt zu einer Wachstumsförderung, sowie einer erhöhten Resistenz gegen abiotische und biotische Stressfaktoren. Während der Entwicklung der Pilze innerhalb der Wurzel sind diese sowohl in toten Zellen der Wurzelrinde, als auch in einer biotrophen Interaktion mit lebenden Pflanzenzellen zu finden. Diese Eigenschaften zusammen mit der Möglichkeit, die Pilze auf synthetischen Medien zu kultivieren, offenbaren eine umfangreiche phänotypische Flexibilität, welche sich auch in ihrem Erbgut widerspiegeln. In dieser Arbeit wurden die Genome von Piriformospora indica und Sebacina vermifera charakterisiert. Es konnte gezeigt werden, dass bestimmte Gene und funktionelle Proteindomänen in beiden Spezies expandiert sind. Zu diesen gehören Proteine, für die eine Funktion im intra- und extrazellulären Transport (Transporter), in der Proteolyse (Peptidasen), im Abbau von Kohlenhydraten (Hydrolasen) und in der Bindung von Kohlenhydraten (Lektine) vorhergesagt wurde. Zusätzlich wurde eine neuartige Familie von kleinen sekretierten Proteinen in P. indica identifiziert, welche sich durch regelmäßig verteilte Histidine und Alanine, sowie ein konserviertes, sieben Aminosäuren-Motiv ("RSIDELD") am C-terminus der Proteine auszeichnet. Auf der anderen Seite konnte gezeigt werden, dass die Anzahl an Proteinen welche eine Funktion in der Produktion von Sekundärmetaboliten besitzen, insbesondere Polyketide und nicht-ribosomale Peptidsynthetasen, in beiden Pilzen stark reduziert ist. Dies ist bezeichnend für den nicht pathogenen Charakter von P. indica und S. vermifera. Des weiteren konnte unter Verwendung von "Microarrays" und "RNA-Sequenzierung" gezeigt werden, dass die Expression von Genen in P. indica während der Besiedelung von Gersten- oder Arabidopsis-Wurzeln zeit- und wirtsabhängig reguliert ist. Eine erste vergleichende Untersuchung der Genexpression in S. vermifera und P. indica während der Besiedelung von Arabidopsis legt nahe, dass definierte Unterschiede während der Besiedelung dieses Wirtes durch die beiden untersuchten Pilze existieren., The root endophyte Piriformospora indica and the orchid mycorrhiza Sebacina vermifera (Sebacinales, Basidiomycota) are able to establish a mutualistic symbiosis with plants. Both fungi colonize the root cortex of a wide range of vascular plants, including the monocot barley (Hordeum vulgare) and the dicot Arabidopsis thaliana. Colonization by the fungi results in growth promotion and induced resistance against abiotic and biotic stresses. Fungal development in roots combines biotrophic growth in living plant cells and cell-death associated colonization of dead cortex cells. These features together with the possibility to cultivate the fungi on synthetic media reveal substantial phenotypic plasticity which is reflected in their genomic traits. In this study, the genomes of Piriformospora indica and Sebacina vermifera were characterized. It could be shown that certain gene and functional protein domain expansions occurred in both species. These included proteins predicted to be involved in intra- and extracellular transport (Transporters), proteolysis (Peptidases), degradation of carbohydrates (Hydrolases) and non-destructive carbohydrate binding (Lectins). Additionally, a novel family of small secreted proteins was identified in P. indica which is characterized by regular distributed histidine and alanine residues and a conserved seven amino acid motif ("RSIDELD") at the C-terminus. On the other side, the number proteins involved in secondary metabolism, in particular polyketide and nonribosomal peptide synthetases, were shown to be strongly reduced in both fungi which is indicative of the non pathogenic character of P. indica and S. vermifera. By using microarrays and RNA-sequencing, a time- and host-specific expression of genes could be shown in P. indica during colonization of barley- or Arabidopsis roots. A first comparative analyses of genes expressed in S. vermifera and P. indica during colonization of Arabidopsis suggests that defined differences exist during the colonization of this host by both analysed fungi.

Type IV secretion systems (T4SSs) are able to transport DNA and effector proteins across the inner and outer membranes of prokaryotes. T4SSs consist of a transport complex which forms the channel across the inner and outer membrane, the so called mating pair formation complex (MPF), and DNA processing and transfer proteins (Dtr proteins). A unique T4SS is encoded in the gonococcal genomic island which is found in most Neisseria gonorrhoeae strains. Remarkably, this secretion system is the first T4SSs that was shown to secrete ssDNA during all phases of growth directly into the environment. This property might facilitate functional studies on the transport mechanisms used by T4SSs. Remarkably, the T4SS encoded within the GGI consists of a MPF complex that is homolgous to the MPF complex of the E. coli F-plasmid (MPFF family) and Dtr proteins that belong to the MOBH family of targeting factors. Although many different members of the MOBH family have already been identified, almost no information is currently available on this novel group of targeting factors. To study the conservation of GGI-like T4SSs, similar T4SS were identified in a computational analysis of all currently completely sequenced chromosomes and plasmids. Next to N. gonorrhoeae very similar conserved T4SSs have been found in several other bacteria. These T4SSs are either encoded within the chromosome or on plasmids. Most of the genes encoded in the GGI between the ltgX and exp1 genes, the region which encodes mainly the MPFF proteins, were highly conserved in allmost all of the identified systems, even though, several of theses genes have been shown previously not to be important for ssDNA transport. Remarkably, all identified chromosomal GGI-like T4SSs encode mpf genes of the MPFF family and dtr genes of the MOBH family; whereas, the plasmid encoded GGI-like T4SSs always contain dtr genes of the MOBF family and mpf genes of the MPFF family. This suggests that relaxases of the MOBH family are preferentially found in chromosomally encoded T4SSs. To elucidate the functional mechanism of the DNA processing reaction of this unique DNA secretion system a biochemical approach was set up to functionally characterize the coupling protein TraD, the relaxase TraI and the hypothetical protein Yaf which are different key enzymes of the Dtr proteins of N. gonorrhoeae. The overexpression and purification of coupling proteins and relaxases of other T4SSs has previously been shown to be inherently difficult. Although many different approaches using E. coli as host for a recombinant overexpression have been tested, it was not possible to obtain soluble TraD and large amounts of inclusion bodies were produced. Small amounts of TraD have been detected in isolated inner membranes of E. coli, but all performed solubilization attempts failed. Finally, TraD was isolated and purified from inclusion bodies under denaturing conditions, but all further refolding approaches with the purified protein resulted either in the loss or the aggregation of TraD. Therefore, it was not possible to characterize the enzymatic activity of the neisserial coupling protein TraD. The hypothetical protein Yaf, which is encoded in same operon with traI and traD was sucessfully overexpressed and purified. Interestingly, Yaf forms different oligomeric states in solution. The most abundant oligomer of native Yaf was the dimeric state. The dynamic equilibrium of the different oligomeric states was strongly dependent on the concentration of the protein and the buffer conditions. The interconversion between the different oligomeric states is a slow process. The presence of an N-terminal His-tag strongly stabilized the tetrameric form. Limited proteolysis experiments showed that Yaf is highly resistant against trypsin and most likely has a very compact and stable structure. Tetrameric Yaf showed a higher resistance against proteolytic digestion than dimeric Yaf. Remarkably, the introduction of different point mutations into the sequence of Yaf resulted in a destabilization of the protein and a strong decrease in the amount of soluble protein. Different activity assays have been performed with the purified protein to study the function of Yaf. DNA binding assays showed binding of dimeric and tetrameric Yaf to dsDNA with low affinity (>5 μM). Furthermore, a metal dependent sequence unspecific nuclease activity was observed associated with elution fractions containing dimeric and tetrameric Yaf. This nuclease activity was specific for dsDNA fragments and oligonucleotides that contained secondary structures. In the presence of different divalent metals, a relaxation activity on supercoiled plasmid DNA has been observed for fractions containing dimeric and tetrameric Yaf, and was strongly enhanced in the presence of Mn2+ and Co2+, but was also observed in the presence of Mg2+. To obtain further information on the structure and function of Yaf, crystallization attempts have been started in close collaboration with Dr. S. Smits in the group of Prof. Dr. L. Schmitt (Heinrich Heine University in Düsseldorf). Small crystals of N-terminally His-tagged Yaf diffracted up to 3 Å. Remarkably, no crystals have been obtained for native Yaf in any of the tested conditions. Recentyl, crystals of N-terminal His-tagged Yaf with incorporated selenomethionine have been obtained. To characterize the MOBH relaxase TraI, many different overexpression and purification approaches have been tested. Finally, an overexpression and purification method could be established to purify soluble TraI. Isolated TraI formed stable dimers in solution, and limited proteolysis revealed the presence of at least three trypsin resistant domains in TraI. DNA binding assays showed that TraI binds to ssDNA and dsDNA with high affinity in a sequence unspecific manner. The minimal binding frame of TraI for ssDNA substrates has been determined with 9 nucleotides. Furthermore, a metal dependent sequence unspecific relaxation activity of TraI on supercoiled plasmids has been observed, with Mn2+ as preferred metal cofactor. The relaxation activity of TraI is similar to the activity of E. coli Topoisomerase I, but differs within the preferred metal cofactor and the lack of detectable intermediates during the relaxation reaction of TraI. DNA cleavage assays performed with different ssDNA substrates demonstrated that TraI cleaves oligonucleotides containing the putative oritT sequence of the GGI or the oriT region of the E. coli F plasmid strand specific in a Mn2+ dependent manner. The complementary strands and a polyT oligonucleotide were not cleaved by TraI. Analysis of the putative cleavage sites did not show any sequence similarity between both cleaved oligonucleotides. To obtain structural information about TraI, crystallization attempts in close collaboration with Dr. S. Smits in the group of Prof. L. Schmitt (Heinrich Heine University in Düsseldorf) were started. Besides the characterization of the enzymatic activity of TraI and Yaf, pull down assays were performed to test whether these proteins interact with each other or with the T4SS ATPase TraC. Unfortunately, no protein-protein interactions were detected between these three proteins. The experimental results from the current study help to understand the DNA processing mechanism of the unique T4SS of N. gonorrhoeae. Important steps have been made in the functional overexpression and the purification of Yaf and TraI. The hereby obtained results from the biochemical characterization of TraI represent the first reported biochemical data which is available on the novel MOBH relaxase family. Furthermore, this study revealed first insights into a possible enzymatic activity of the previously uncharacterized hypothetical protein Yaf, even though the function of this protein still remains unknown.

Hydroxyzimtsäureester und -amide, z.B. Hydroxycinnamoylchinat, Hydroxycinnamoylshikimat, Hydroxycinnamoyltyramin und Rosmarinsäure, sind im Pflanzenreich sehr weit verbreitet. Pflanzen synthetisieren diese Stoffe zur Abwehr gegen Bakterien oder Pilze, nutzen sie aber auch als UV-Schutz. Die Rosmarinsäuresynthase (RAS, Hydroxy-cinnamoylCoA:Hydroxyphenyllactat Hydroxycinnamoyltransferase) ist für die Biosynthese der Rosmarinsäure (RA), einem wichtigen phenolischen Inhaltsstoff der Buntnessel (Coleus blumei), essentiell. Zur Kristallisation und Strukturanalysen des RAS-Proteins wurde RAS-cDNA heterolog in E. coli exprimiert. Da das Protein hauptsächlich in inclusion bodies vorliegt, wurde eine Rückfaltung und Resolubilisierung durchgeführt. Auf Grund der geringen Aktivität wurde das RAS-Protein in SoluBL21TM E. coli-Zellen heterolog exprimiert. Nach Aufreinigung durch Gelpermeationschromatographie konnte aktives, sauberes Protein für Kristallisationsversuche verwendet werden. Es erfolgte jedoch kein Kristallwachstum. RAS, HST (Hydroxycinnamoyl-CoA:Shikimat Hydroxycinnamoyltransferase), die zur Bildung von Lignanen und Monolignolen wichtig ist, und HQT (Hydroxycinnamoyl-CoA:Chinat Hydroxycinnamoyltransferase), ein Enzym der Chlorogensäure (CA)-Biosynthese, sind wichtige Vertreter der Hydroxycinnamoyltransferasen (HCTs). Ein Ziel dieser Arbeit war die Charakterisierung verschiedener HCTs in dem Efeublättrigen Gundermann (Glechoma hederacea). Die krautige, mehrjährige Pflanze ist in Europa, Asien und Amerika beheimatet und kann als interessantes Untersuchungsobjekt angesehen werden, da sie RA, CA und Kaffeesäure akkumuliert. Eine partielle cDNA-Sequenz, die möglicherweise für eine Hydroxycinnamoyl-CoA:Shikimat/Chinat Hydroxycinnamoyltransferase kodiert, konnte aus Glechoma herderacea isoliert werden. Außerdem wurden die RA-, CA- und Kaffeesäuregehalte, sowie die Transkriptmenge der RAS, HST und einer unbekannten HCT in Blättern, Blüten, Stängeln und Wurzeln bestimmt. Die untersuchten Transkripte konnten in allen Organen, außer in Wurzeln, nachgewiesen werden. Die Blüten akkumulierten 12,5% RA, während der Gehalt in Blättern, Stängeln und Wurzeln bei etwa 1% lag. Darüber hinaus wurde die Akkumulation der CA, RA und Kaffeesäure und außerdem die spezifische Aktivitäten der RAS und der Phenylalanin Ammoniak-Lyase (PAL) in einer Suspensionskultur von Glechoma hederacea bestimmt. Während des Untersuchungszeitraums von 14 Tagen wurden Wachstums- und Mediumsparameter, sowie der Sekundärmetabolismus untersucht. Die maximale PAL-Aktivität konnte an Tag 5 und die maximale RAS-Aktivität an Tag 8 bestimmt werden. RA war im Vergleich mit den anderen Sekundärmetaboliten mit fast 26% an Tag 7 am stärksten vertreten. In einem anderen Projekt wurden die spezifische Aktivität und Substratspezifität von bereits konstruierten CbRAS/HST- und CbHST/RAS-Chimären analysiert. Die Kristallstrukturanalyse verschiedener HCTs zeigt, dass sie aus zwei ungefähr gleich großen Domänen aufgebaut sind. Durch den Austausch der beiden Domänen konnten die Chimären synthetisiert werden. Die Aktivitätstests zeigten geringe RAS-Aktvität bei beiden Chimären, wohingegen keinerlei HST-Aktivität gemessen werden konnte. Melissa officinalis gehört wie die beiden vorher erwähnten Pflanzen zur Familie der Lamiaceae (Unterfamilie Nepetoideae) und dient aufgrund des Gehalts an ätherischem Öl und Phenolcarbonsäuren als Arzneipflanze. In dieser Arbeit wurde der Einfluss von geringen Ozonkonzentrationen auf den Primär- und Sekundärstoffwechsel untersucht. Die Melissenpflanzen wurden geringen Ozonkonzentrationen (80 ppb, 5 h) ausgesetzt, da verschiedene Studien gezeigt haben, dass erhöhte Hintergrundkonzentrationen genauso schädlich wie Ozonspitzenkonzentrationen sein können. Die Probenahme erfolgte 0, 3, 5, 12 und 24 h nach Beginn der Ozon-Begasung. Es wurden Änderungen der photosynthetischen Funktionen bestimmt, außerdem wurden ökophysiologische, biochemische und strukturelle Parameter untersucht. Nach Ende der Begasungsperiode konnten makroskopisch keinerlei Schäden erkannt werden, doch auf mikroskopischer Ebene zeigten sich nekrotische Bereiche in den Blättern. Auch wurden die photosynthetischen Funktionen stark beeinflusst. Verschiedene Enzyme, z.B. PAL, Hydroxyzimtsäure:Coenzym A Ligase (4CL), Tyrosin Aminotransferase (TAT) und RAS, sind an der Biosynthese der RA beteiligt. Durch quantitative Real-time-PCR wurden die Transkriptionslevel dieser Gene in Melissa officinalis untersucht. Es erfolgte eine schnelle Hochregulierung aller Gene, aber 24 h nach Beginn der Ozon-Begasung waren nur noch RAS und PAL hochreguliert. Die spezifische Aktivität der RAS korrelierte mit einem Absinken des RA-Gehalts, wohingegen die PAL-Aktivität einen Anstieg um 163% nach 12 h aufwies. In einem zweiten Begasungsexperiment unter den gleichen Bedingungen wurden antioxidative Effekte in der Zitronenmelisse untersucht. Die Probenahme erfolgte 0, 3, 5, 12, 24 und 48 h nach Beginn der Ozon-Begasung. Es konnten ein signifikanter Anstieg an Ascorbat, Dehydroascorbat und Gesamtascorbat, sowie ein biphasischer Verlauf des Redoxstatus festgestellt werden. Ein hohes Radikalfängerpotential korrelierte mit einem hohen Gesamtgehalt an phenolischen Verbindungen und einem hohen Carotinoidgehalt. Außerdem stiegen der Gehalt an Wasserstoffperoxid und Prolin. Die Bestimmung der Katalaseaktivität zeigte einen biphasischen Verlauf mit einem Anstieg nach 5 h und einem Abfall nach 48 h. Zusammenfassend verdeutlichen diese Ergebnisse den Einfluss von Ozonstress auf die Arzneipflanze Melissa officinalis.

Die Methanbildung aus H2 und CO2 ist die einzige Energie-liefernde Reaktion in vielen methanogenen Archaeen. Pro Mol gebildetem Methan werden vier Mol H2 verbraucht. Der Wasserstoff wird dabei durch Hydrogenasen aktiviert, wovon es in den meisten hydrogenotrophen Methanbildnern drei unterschiedliche [NiFe]-Hydrogenasen und eine [Fe]-Hydrogenase gibt. Von den vier Hydrogenasen ist die F420-reduzierende [NiFe]-Hydrogenase die quantitativ wichtigste, da sie über reduziertes F420H2 vier der acht zur CO2 Reduktion benötigten Reduktionsäquivalente bereitstellt. F420 ist ein 5 ́-Deazaflavinderivat, das zwar strukturell einem Flavin ähnelt, sich aber funktionell wie ein Pyridinnukleotid verhält, in dem es ein Hydrid und nicht einzelne Elektronen übertragen kann. Das Redoxpotential Eo ́ von F420 ist mit -360 mV aber um 40-mV negativer als das von NAD und NADP. Die Reduktion von F420 mit H2 (Eo ́= -414 mV) erfolgt daher auch nahe am thermodynamischen Gleichgewicht, insbesondere unter physiologischen Bedingungen, unter denen der H2-Partialdruck in Kulturen von methanogenen Archaeen sehr viel niedriger als ein Bar ist. Ziel der vorliegenden Arbeit war, die Struktur von FrhABG aufzuklären, wofür es eine Reihe unterschiedlicher Motive gab. Zum einen ist es die funktionelle Reversibilität, die dieses Enzym von allen bisher strukturell untersuchten Hydrogenasen unterscheidet. Zum anderen gehört FrhABG zur phylogenetischen Gruppe 3 [NiFe]-Hydrogenasen, von denen es noch keine Strukturen gibt; alle bisher strukturell aufgeklärten NiFe-Hydrogenasen gehören der Gruppe 1 an. Und letztlich, weil der FrhABG Komplex die Untereinheit B enthält, die phylogenetisch verwandt ist mit Untereinheiten, die in anderen F420-abhängigen Enzymen vorkommen wie in den F420- abhängigen Formiat Dehydrogenase, F420-abhängigen Glutamat-Synthase, F420-abhängigen Sulfit- Reduktase, den F420H2:Quinon-Oxidoreduktase und F420H2:Phenazin-Oxidoreduktase Komplexen, von denen es ebenfalls noch keine Strukturen gibt. Der F420-reduzierende FrhABG Komplex wurde aus Methanothermobacter marburgensis gereinigt. Nach 100-facher Anreicherung wurde eine homogene Präparation mit einer spezifischen Aktivität von 280 U/mg und einem apparenten Km für F420 von 40 μM erhalten. Die Präparation mit einer apparenten Molmasse von über 1000 kDa enthielt die drei Untereinheiten A, B und G im Verhältnis 1 zu 1 zu 1. Die makromolekulare Struktur von FrhABG legte es nahe, den multimeren Komplex zunächst Cryo-elektronenmikroskopisch (Cryo-EM) zu charakterisieren, was mit einer einmaligen Auflösung bis ~4 Å gelang. Auf Grund der hohen Auflösung war es möglich, das Kohlenstoffrückrad in die Elektronendichte zu modellieren. Das Heterotrimer bildet einen (FrhABG)12 Komplex mit einer molekularen Masse von etwa 1215 kDa. Dabei werden die Trimerisierung und die Multimerisierung hauptsächlich über Salzbrücken stabilisiert. Parallel zu den Cryo-EM Untersuchungen wurden Kristallisationsversuche von FrhABG durchgeführt. Die Kristallstruktur konnte bis zu einer Auflösung von 1.8 Å verfeinert werden, was eine exakte Analyse insbesondere der Metallzentren erlaubte. In der Kristallstruktur ist das [NiFe]-Zentrum in der FrhA Untereinheit viel deutlicher zu erkennen, als in der Cryo-EM Struktur. Das Nickelatom wird durch vier Cystein-Thiolate koordiniert, wobei zwei dieser Thiolate zusätzlich eine Brücke zu dem Eisenatom bilden. Weiter ist zu erkennen, dass das Eisen drei diatomische Liganden trägt, sehr wahrscheinlich ein CO und zwei CN-. Trotz des hohen Konservierungsgrads des aktiven [NiFe]-Zentrums, gibt es in seiner Umgebung ein paar markante Aminosäureaustausche, die unsere Vorstellung über Hydrogenasen erweitern. In der FrhG Untereinheit mit drei [4Fe4S]-Clustern weist das proximale [4Fe4S]-Cluster eine ungewöhnliche, in anderen [NiFe]-Hydrogenasen noch nicht beschriebene Koordinierung mit einem Aspartat anstelle eines Cysteins auf. Ebenfalls ungewöhnlich ist, dass der mediale Cluster ein [4Fe4S]- und nicht ein [3Fe4S]-Cluster ist und dass der mediale und distale [4Fe4S]-Cluster in eine Ferredoxin- ähnliche Struktur eingebettet sind. In der FrhB Untereinheit sind das [4Fe4S]-Cluster und das FAD, welches eine ungewöhnlich gestauchte Konformation aufweist, gut aufgelöst. Die Distanz zwischen dem [4Fe4S]-Cluster und dem FAD liegt bei 7,5 Å. FAD ist so angeordnet, dass es in van-der-Waals-Kontakt zu F420 kommt und ein Hydrid von F420H2 von der pro-S-Position akzeptieren kann, was aus Modellierungen hervorgeht. Um zu zeigen, dass FrhB tatsächlich die Untereinheit ist, an der F420 reduziert wird, wurde das Gen frhB aus Methanocaldococcus jannaschii in Escherichia coli überproduziert, gereinigt und charakterisiert. Die heterolog produzierte Untereinheit hatte eine molekulare Masse von etwa 31 kDa und enthielt sowohl FAD und als auch ein Eisen-Schwefel-Cluster. Das rekombinante Enzym katalysierte die Oxidation von F420H2 mit Benzylviologen als Elektronenakzeptor mit einer spezifischen Aktivität von 15 U/mg Protein, verlor aber seine Aktivität schnell, insbesondere beim Einfrieren. Diese und vorläufige Elektronenspinresonanzspektroskopische (ESR) Untersuchungen zum Redoxpotential der einzelnen [4Fe4S]-Cluster werden in Kapitel 3 der vorliegenden Arbeit beschrieben.

Motility of Myxococcus xanthus cells is powered by two distinct engines: S-motility allows grouped cells movement and is driven by type IV pili (T4P) at the leading cell pole that use ATP for their function and pull the cell forward upon their retraction. Single cell movement is called gliding or A-motility and its AglQ/R/S engine is powered by proton-motive force and is incorporated at focal adhesion complexes in the cell. The control of motility and its direction is accomplished by cells rapidly switching their leading into lagging cell pole (cellular reversal), a process regulated by the small Ras-like G-protein MglA and its cognate GTPase activating protein (GAP) MglB. Using fluorescence microscopy it was previously shown that MglA localizes at the leading cell pole and MglB at the lagging cell pole and both proteins dynamically switch polarity during cellular reversal. Further, recent experiments showed that an A-motility protein AglZ, and A-motility engine AglQ/R/S localize at clusters distributed along the cell body that stay fixed relative to the substratum as the cell moves forming focal adhesion complexes (FACs). Based on the in vivo experiments it has been proposed that gliding motility machinery assembles at the leading cell pole and that it is guided by the cytoskeletal element to the lagging cell pole, where it disassembles. In this work we investigated the function of MglA during gliding motility. First, we demonstrate that MglA in its active state forms a focal adhesion cluster, which co-localizes with AglZ and AglQ, thus showing that active MglA is a component of the FACs. We show that MglA is essential for incorporation of AlgQ in the FACs, and that MglA GTPase cycle regulates the number of AglQ clusters. Further, we provide evidence that the GTPase negative MglA variant MglAQ82A leads to regularly reversing cells after movement of only one cell length, and that MglA GTPase cycle regulates the disassembly of the FACs at the lagging cell pole. Fluorescent YFP-MglAQ82A forms a focal adhesion cluster which appears to regularly oscillate between the poles, and causes the cell to move in a pendulum-like manner. Unlike wildtype MglA, MglAQ82A is insensitive to the GAP activity of MglB, and upon reaching the lagging cell pole where MglB localizes, it causes a cellular reversal by starting to oscillate in the opposite direction. The co-localizing YFP-MglAQ82A/AglZ-mCherry and YFP-MglAQ82A/AglQ-mCherry FAC also appear to continuously oscillate between the poles suggesting that the gliding motility machinery coupled to active MglA needs to be disassembled at the lagging cell pole by MglB GAP, and in this way allow uni-directional motility for distances longer than one cell length. Furthermore, in this work we demonstrate that active wt MglA and MglAQ82L variant interact directly with filament forming MreB actin homolog. Additionally, our results show that the formation and localization of FACs depend on intact MreB, thus indicating that MreB acts as a scaffold for the assembly of gliding motility machinery. The addition of antibiotics which inhibit peptidoglycan (PG) synthesis and reduce the dynamics of MreB in other bacteria did not inhibit single cell motility and did not cause mislocalization of MglA and AglQ. This strongly suggests that the major proposed function of MreB as a scaffold for PG elongation machinery is not coupled to its essential role during gliding motility in M. xanthus. Thus, we demonstrate that MreB is required for MglA, AglZ and AglQ localization at FACs during gliding, and this function of MreB is separable from its major proposed function in PG synthesis.

Termites are a group of eusocial insects in the superorder Dietyaptera, believed to have evolved from a lineage of ancient cockroach-like ancestors 150 million years ago. They play an important role in the breakdown of dead plant material, with the help of microorganisms harboured in the gut. The termites can be classified into flagellate-harbouring lower termites and flagellate-free higher termites. In comparison to the lower termites, the higher termites have undergone immense phylogenetic and dietary diversification, that has led to major changes in their gut structure. This diversification in the host is reflected in differences in their gut communities. To understand how host phylogeny and diet help shape bacterial communities in higher termites, I conducted an extensive pyrosequencingbased community survey of the gut communities of the major higher termite subfamilies, Macrotermitinae, Termitinae, and Nasutitermitinae. First, I constructed clone libraries and calculated phylogenetic trees for relevant bacterial taxa found in a variety of higher termites. The node information in these trees was used to provide a robust phylogenetic backbone for the accurate taxonomic assignment of the shorter pyrosequences. The analysis revealed that phylogenetically related termites in general, have similar community structure. However, one of the wood-feeding termites showed a greater similarity in gut community structure to other wood-feeders, in spite of not being phylogenetically related to them. The results suggest that although host phylogeny appears to be the major driving force in the determination of gut community membership, host diet can significantly contribute to community structure. However, far from being a homogenous environment, the higher termite gut is a highly structured habitat and shows the presence of spatially separated and physicochemically distinct compartments. Conditions unique to each compartment, playa significant role in shaping distinct compartment-specific communities. I used pyrotag sequencing to conduct an in-depth analysis of the communities of gut compartments from termites belonging to the families Termitinae and Nasutitermitinae. I found that homologous compartments from closely related termites are more similar in their community structure than adjacent compartments from the same termite. Based on our results, we hypothesize that similar ecological conditions such as increased alkalinity in the anterior gut, drive community structure in the gut compartments, and are reflected in overall hindgut community structure as well. The paunch (or P3 compartment) is the most voluminous of all hindgut compartments in wood-feeding higher termites, and is densely colonized by bacteria. Studies have shown that cellulase activity in the hindgut is particle-associated and possibly of bacterial origin. By fractionation of particles in the paunch lumen, using density-dependent centrifugation , I was able to show that the fraction enriched in wood fibers contributes substantially to the total cellulase activity in the hindgut. Using pyrosequencing, I examined the bacterial communities associated with the wood fibers in two wood-feeding members of the Nasutitermitinae. The results revealed the presence of a distinct cellulolytic fiber-associated community, primarily composed of the phyla TG3, Fibrobacteres and Spirochaetes. This fiber-associated community appears to have filled the niche for cellulose digestion, vacated by the flagellates. Lastly, the gut wall in termites is one of the major habitats in the gut, and home to an endospore-forming filamentous bacterium called 'Candidatus Arthromitus'. Due to the lack of a cultured isolate, the phylogenetic identity of 'Arthromitus' was disputed, and often confused with similar filamentous bacteria from mammalian guts. Phylogenetic analysis of picked filaments reveals 'Candidatus Arthromitus' to be a diverse clade of bacteria, found widely among arthropods, that is distinct from the segmented filamentous sequences recovered from mammalian guts., Die Termiten sind eine Gruppe eusozialer Insekten in der Superordnung Dictyoptera und haben sich vermutlich vor 150 Millionen Jahren aus einer Linie Schaben-ahnlicher Vorfahren entwickelt. Sie spielen beim Abbau toter Pflanzen masse eine wichtige Rolle, wobei sie von in ihrem Darm lebenden Bakterien unterstotzt werden. Man unterscheidet zwischen den Flagellaten beherbergenden niederen Termiten und den Flagellaten-freien hOheren Termiten. 1m Gegensatz zu den niederen Termiten vollzogen die hbheren Termiten eine immense phylogenetische und diatische Diversifizierung, die grundlegende Veranderungen ihrer Darmstruktur zur Feige hatte. Diese Diversifizierung im Wirt tritt in Unterschieden der Darmmikrobiota zu Tage. Urn zu verstehen , wie Phylogenie und Erna.hrungsweise des Wirtes die bakteriellen Gemeinschaften in h6heren Termiten formen , fUhrte ich eine extensive Pyrosequenzierung-basierte Vergleichsstudie der Darmgemeinschaften in den wichtigsten Unterfamilien der Termiten, Macrotermitinae, Termitinae und Nasutitermitinae, durch. Zunachst konstruierte ich Klonbibliotheken und berechnete phylogenetische Saume fUr relevante bakterielie Taxa aus verschiedenen h6heren Termiten . Die Knotenpunkt-Informationen aus diesen Baumen dienten als robustes phlylogenetisches ROckgrat fOr die korrekte taxonomische Zuordnung der kOrzeren Pyrosequenzen. Die Analyse ergab, dass phylogenetisch verwandte Termiten im Aligemeinen eine ahnliche Gemeinschaftsstruktur aulweisen. Eine der holzfressenden Termiten zeigte jedoch eine gr6~ere Ahnlichkeit zu anderen holzfressenden Arten, ohne mit ihnen phylogenetisch verwandt zu sein. Die Ergebnisse leg en nahe, dass die Phylogenie des Wirtes zwar die wesentliche treibende Kraft bei der Festlegung der Darmgemeinschaft darstellt, die Ernahrungsweise des Wirtes jedoch signifikant zur Gemeinschaftsstruktur beitragen kann. Der Darm der h6heren Termiten, mitnichten eine homogene Umgebung, bildet ein hoch strukturiertes Habitat und weist Ortlich getrennte und physiochemisch verschiedene Kompartimente auf. In jedem Kompartiment bestimmen einzigartige Bedingungen die spezifische Gemeinschaft. Mittels Pyrotag-Sequenzierung fOhrte ich eine ausfOhrliche Analyse der Kompartiment-spezifischen Gemeinschaften in Termiten der Familien Termitinae und Nasutitermitinae durch. Ich fand heraus, dass homo loge Kompartimente nah verwandter Termiten einander ahnlicher waren als benachbarte Kompartimente derselben Termite. Basierend auf unseren Ergebnissen vermuten wir, dass ahnliche dkologische Bedingungen, wie beispielsweise erMhte Alkalinitat im Vorderdarm, die Gemeinschaftsstruktur in den Darmkompartimenten beeinflussen und ebenfalls in der Gemeinschaftsstruktur des Dickdarms insgesamt reflektiert werden. Der Pansen (oder P3-Kompartiment) ist volumenmal>ig der gr61>te Dickdarmabschnitt in holzfressenden h6heren Termiten und ist vollstandig mit Holzfasern und Bakterien gefOllt. Ober den Beitrag von Bakterien zum Celluloseverdau ist jedoch wenig bekannt. Durch Fraktionierung der Partikel im Lumen des Pansen mittels Dichtegradientenzentrifugation konnte ich zeigen, dass die in Holzfasern angereicherte Fraktion substantiell zur gesamten Cellulase-Aktivitat beitrug. Mittels Pyrosequenzierung untersuchte ich die mit den Holzfasern assQziierten bakteriellen Gemeinschaften in zwei holzfressenden Vertretern der Nasutitermitinae. Die Ergebnisse offenbarten die Anwesenheit einer eindeutig cellulolytischen, Faser-assoziierten Gemeinschaft, die vor allem aus den Phyla TG3, Fibrobacteres und Spirochaetes bestand. Diese Faser-assoziierte Gemeinschaft scheint die von den Flagellaten verlassene Nische des Celluloseverdaus zu besetzen. Die Darmwand der Termiten ist eines der wichtigsten Habitate des Darms und beherbergt ein Endosporen-bildendes filament6ses Bakterium namens "Candidalus Arthromitus", Mangels eines kultivierten Isolates wurde die phylogenetische Identitat von 'Arthromitus' angezweifelt und oft mit ahnlichen filament6sen Bakterien aus Saugetierdarmen verwechselt. Phylogenetische Analyse einzeln ausgewahlter Filamente zeigte Candidatus Arthromitus als einen diversen Stamm von Bakterien, der unter Arthropoden weit verbreitet ist und sich deutlich von segmentierten filamentDsen Sequenzen aus Saugetierdarmen unterscheidet.

The membrane lipid phosphatidylinositol(4,5)bisphosphate (PIP2) regulates many cellular processes. Yet the dynamics of PIP2 concentration changes in living cells in their native environment are virtually unknown. However, knowledge of these dynamics is prerequisite to understanding the physiological functions of PIP2. Recent development of PIP2-probes made of PIP2-binding domains and fluorescent proteins has enabled optical measurements of PIP2 dynamics in living cells. Previous studies in heterologous expression systems and isolated neurons showed that activation of Gáq coupled receptors can deplete the PIP2 content in the plasma membrane. This PIP2 reduction results in a decrease of lipid-protein interactions and consequently to a modulation of the activity and localization of PIP2-sensitive proteins (effectors). In neurons, PIP2 depletion is thought to modulate various ion channels and thus electric excitability. In this study, I have characterized the Gq-induced PIP2 depletion in CA1 hippocampal neurons in situ in acute brain slices. Measurement of PIP2 dynamics was achieved by means of confocal microscopy of PIP2 dependent membrane association of the tubby domain. Comparative measurements of PIP2- and potentially IP3-sensitive PLCd1-PH domain translocation largely resembled the tubby data but showed a slower recovery especially upon strong translocation. Pharmacological activation of both muscarinic acetylcholine (mAch) and metabotropic glutamate (mGlu) receptors (R) induced a robust depletion of PIP2. The amplitude of mAchR induced PIP2 depletion was significantly larger compared to mGluR (type I). This difference in amplitudes was more pronounced in the main apical dendrite compared to the soma. The average time course of PIP2 dynamics was similar for both receptors and showed an initial peak and a lower plateau phase, revealing desensitization. The phasic-tonic time course according to desensitization was more pronounced for mAchR activation. Furthermore, the data obtained here show for the first time that in some neurons Gáq coupled receptor activation induces oscillations of membrane PIP2 concentrations. Moreover, oscillations demonstrate that neurons can rapidly recover PIP2 during prolonged presence of agonists. Application of other Gq coupled receptor agonists did not induce a measureable PIP2 depletion in soma and main apical dendrite. Taken together the results support a physiological function of PIP2 dynamics and correlate well with the general time course of electrophysiological responses to the agonists. A physiological role of PIP2-dynamics is further supported by results of electric stimulation in the area of afferent fibers in the stratum oriens. The data implicate that PIP2 depletion can be induced by synaptic receptor activation, but the pharmacology needs further verification. Data from dentate gyrus granule cells show that PIP2 depletion is not only a receptor but also neurontype specific process, as application of mAchR and mGluR agonists did not induce a measureable PIP2-depletion here., Das Plasmamembranlipid Phosphatidylinositol(4,5)biphosphat (PIP2) ist an der Regulation einer Vielzahl zellularer Prozesse beteiligt. Die Dynamik der PIP2-Konzentration in lebenden Zellen in ihrer nativen Umgebung ist bislang allerdings weitgehend unerforscht. Die Kenntnis der PIP2-Dynamik in nativen Zellen ist jedoch eine wesentliche Voraussetzung, um die physiologische Funktion von PIP2 verstehen zu konnen. Seit wenigen Jahren ermoglicht die Entwicklung von PIP2-Sensoren aus PIP2-bindenden Domanen und fluoreszierenden Proteinen die optische Messung der PIP2-Dynamik in lebenden Zellen. In heterologen Expressionssystemen und isolierten Neuronen ist bereits gezeigt worden, dass die Aktivierung von Gq-gekoppelten Rezeptoren die Konzentration von PIP2 in der Plasmamembran reduzieren kann. Diese Reduktion fuhrt zu einer Verminderung von Lipid-Proteininteraktionen und als Konsequenz zu einer Modulation der Aktivitat oder Lokalisation PIP2-abhangiger Proteine (Effektoren). In Neuronen fuhrt diese Depletion von PIP2 nach derzeitigen Modellvorstellungen u.a. zur Regulation verschiedener Ionenkanale und damit zu einer Modulation der elektrischen Erregbarkeit der Zellen. In dieser Arbeit habe ich mit Hilfe konfokaler Mikroskopie der PIP2-abhangigen Membranlokalisation der Tubby-Domane die Gq-induzierte PIP2-Dynamik in situ in hippocampalen CA1-Pyramidenneuronen in akuten Hirnschnitten charakterisiert. Vergleichende Messungen der Translokation der PIP2- und potentiell IP3-sensitiven PLCƒÂ1-PH-Domane zeigten einen ahnlichen Verlauf im Vergleich zu Tubby, wiesen aber insbesondere bei starken Translokationen eine langsamere Regeneration auf. Pharmakologische Aktivierung Gq-gekoppelter muskarinischer Acetylcholinrezeptoren (mAchR) und metabotroper Glutamatrezeptoren (mGluR) fuhrten zur robusten PIP2-Depletion. Die Amplitude der mAchR-induzierten PIP2-Depletion war signifikant groser als die der Typ-I mGluR-induzierten Depletion. Der Unterschied zwischen den Amplituden war in dem apikalen Hauptdendriten starker ausgepragt als im Soma. Bei beiden Rezeptoren zeigte die PIP2-Dynamik im Mittel einen phasisch-tonischen Verlauf. Die Desensitisierung der PIP2-Depletion war bei Aktivierung von mAchR starker ausgepragt. Daruber hinaus zeigen die Daten erstmals, dass die Aktivierung Gq-gekoppelter Rezeptoren auch eine Oszillation der PIP2-Konzentration in der Plasmamembran bewirken kann. Die mAchR- und mGluRI-induzierten Oszillationen zeigen auserdem, das Neurone zu einer rapiden PIP2-Regeneration wahrend andauernder Anwesenheit der Agonisten fahig sind. Die Applikation von Agonisten weiterer Gƒ¿q-gekoppelter Rezeptoren induzierte im Soma und apikalen Hauptdendriten keine PIP2-Dynamik. Insgesamt unterstutzen die Daten eine physiologische Funktion der PIP2-Dynamik in Neuronen und korrelieren gut mit dem allgemeinen Verlauf von elektrophysiologischen Antworten der Zellen auf die Agonisten. Eine physiologische Funktion der PIP2-Dynamik wird weiter von Ergebnissen aus elektrischen Stimulationen im Bereich afferenter Fasern im Str. oriens unterstutzt. Die Daten deuten auf eine synaptisch induzierbare PIP2-Depletion hin, die Pharmakologie der Effekte muss aber noch naher untersucht werden. Wie Daten aus Gyrus dentatus Kornerzellen zeigen, ist die Gq-induzierte PIP2-Dynamik nicht nur rezeptor-, sondern auch neuronentypspezifisch, denn hier induzierten mAchR- und mGluR-Agonisten keine messbare PIP2-Depletion.

Peatlands constitute >3% of the Earth’s terrestrial area but store approximately one third of global soil organic carbon. Although peatlands act as sinks for atmospheric carbon, they are net emitters of greenhouse gasses, like CH4 and N2O, into the atmosphere. Hence, most of the studies conducted on peatlands focused on methanogenesis and the role of environmental factors influencing this process and very few studies focused on other electron-accepting processes. Recent studies have shown indications that Fe(III) reduction could be playing an important role in the mineralization of organic carbon in mildly acidic peat bogs. However, this process in peatlands has not been well investigated. In the first part of the work the role of Fe(III) reduction and methanogenesis as electron-accepting processes was investigated. Unlike the earlier hypothesis of sequential reduction of electron acceptors according to their redox potentials in sediments, a simultaneous reduction of Fe(III) and methanogenesis was observed in the sediment of Lake Grosse Fuchskuhle. Quantitative comparison of these processes showed that Fe(III) reduction is the dominant organic matter mineralization process compared to methanogenesis during the course of the incubations. After an initial Fe(III) reduction a fluctuating Fe(II) concentration was observed during the course of our incubation indicating a continuous anaerobic Fe(II) oxidation and reduction in this sediment. Following the above results, the second part of the work focused on identifying, enriching and characterizing microorganisms involved in anaerobic nitrate-dependent Fe(II) oxidation. These investigations indicated the chemolithotrophic nitrate-dependent Fe(II)-oxidizing nature of TM3 Actinobacteria and that these organisms could be involved in mediating anaerobic oxidation of Fe(II) in the sediment. Previous culture-independent studies had shown a widespread distribution of these Actinobacteria in natural environments and were hypothesized to be contributing to ecologically important processes; however, the physiological capabilities of these microorganisms remained unknown. To the best of our knowledge this is the first study to show the autotrophic nitrate-dependent Fe(II)-oxidizing nature of TM3 group of uncultured Actinobacteria. The third part of the thesis deals with the role of humic substances in abiotic and microbial Fe(II) oxidation. Despite the fact that Fe(II) is predominantly present in natural environments as chelated to humic substances, the role of humic substances in mediating Fe(II) oxidation has not been elucidated. Our findings indicate that the presence of humic substances could be beneficial for microorganisms oxidizing Fe(II) due to reduced abiotic Fe(II) oxidation and also possibly due to an increased energy yield caused by a lowering of the redox potential of chelated Fe(II) compared to free Fe(II). Estimations of nitrate-dependent Fe(II)-oxidizing microorganisms from Lake Grosse Fuchskuhle sediment using a cultivation-based approach showed a two-order of magnitude higher number of chemolithotrophic nitrate-dependent Fe(II)-oxidizing microorganisms when including humic substances in the growth medium. The incubations of sediment under chemolithotrophic nitrate-dependent Fe(II)-oxidizing conditions showed the enrichment of microorganisms belonging to the genus Thiomonas. Further characterization of these enrichments provided preliminary evidence of a chemolithotrophic nitrate-dependent Fe(II)-oxidizing capability of these Thiomonas strains. Lastly, Thiomonas arsenivorans strain 3As was tested for chemolithoautotrophic nitrate-dependent Fe(II) oxidation since the presence of all the genes required for mediating this physiological process were identified in the genome. These assays were performed both in the presence and absence of humic substances. A stoichiometric consumption of Fe(II) and nitrate consistent with nitrate-dependent Fe(II) oxidation was observed in the presence of humic substances under autotrophic growth conditions. In contrast, no Fe(II) oxidation either under autotrophic or heterotrophic conditions was observed in the absence of humic substances, indicating the importance of humic substances in mediating nitrate-dependent Fe(II) oxidation. To the best of our knowledge this is the first study to show a chemolithotrophic nitrate-dependent Fe(II)-oxidizing physiology in a bacterial pure culture. Furthermore, the findings of the study indicate that humic substances are beneficial for microbial Fe(II) oxidation., Umwelt vorwiegend an Huminstoffe gebunden vorkommt, konnte die Rolle von Huminstoffen in der Fe(II)-Oxidation noch nicht geklärt werden. Unsere Ergebnisse zeigen, dass die Anwesenheit von Huminstoffen einen Vorteil für Fe(II) oxidierende Mikroorganismen darstellen kann. Dies beruht auf der reduzierten abiotischen Fe(II)-Oxidation und einer möglicherweise erhöhten Energieausbeute durch eine Absenkung des Redoxpotentials von chelatiertem Fe(II) im Vergleich zu freiem Fe(II). Eine MPN-basierte Quantifizierung der Nitrat-abhängige Fe(II)-oxidierenden Mikroorganismen im Sediment des Moorsees Große Fuchskuhle zeigte eine um zwei Größenordnung erhöhte Zellzahl von chemolithotrophen Nitrat-abhängige Fe(II)-oxidierenden Mikroorganismen bei Huminstoffzugabe zum Wachstumsmedium. Bei Sediment Inkubationen unter chemolithotrophen Nitrat-abhängigen Fe(II)-oxidierenden Bedingungen wurden Mikroorganismen der Gattung Thiomonas angereichert. Einen weitere Charakterisierung dieser Anreicherungen lieferte vorläufige Belege dafür, dass diese Thiomonas Stämme fähig zur chemolithotrophen Nitrat-abhängigen Fe(II)-Oxidation sind. Zuletzt wurde der Thiomonas arsenivorans Stamm 3As auf die Fähigkeit zur chemolithotrophen Nitrat-abhängigen Fe(II)-Oxidation getestet, da alle dafür notwendigen Gene im Genom identifiziert werden konnten. Diese Versuche wurden sowohl unter Anwesenheit als auch in Abwesenheit von Huminstoffen durchgeführt. Es konnte ein stöchiometrischer Verbrauch von Fe(II) und Nitrat, wie für Nitrat-abhängige Fe(II)-Oxidation in Gegenwart von Huminstoffen unter autotrophen Wachstumsbedingungen erwarted, beobachtet werden. Demgegenüber konnte in Abwesenheit von Huminstoffen weder unter autothrophen noch unter heterotrophen Bedingungen Fe(II)-Oxidation beobachtet werden, was auf die Bedeutung von Huminstoffen bei der Vermittlung Nitrat-abhängiger Fe(II)-Oxidation hinweist. Nach unserem Wissen ist dies die erste Studie, welche die chemolithotrophe Nitrat-abhängige Fe(II) oxidierende Physiologie in einer bakteriellen Reinkultur zeigt. Darüberhinaus konnte in dieser Arbeit gezeigt werden, dass Huminstoffe mikrobielle Fe(II)-Oxidation begünstigen. Umwelt vorwiegend an Huminstoffe gebunden vorkommt, konnte die Rolle von Huminstoffen in der Fe(II)-Oxidation noch nicht geklärt werden. Unsere Ergebnisse zeigen, dass die Anwesenheit von Huminstoffen einen Vorteil für Fe(II) oxidierende Mikroorganismen darstellen kann. Dies beruht auf der reduzierten abiotischen Fe(II)-Oxidation und einer möglicherweise erhöhten Energieausbeute durch eine Absenkung des Redoxpotentials von chelatiertem Fe(II) im Vergleich zu freiem Fe(II). Eine MPN-basierte Quantifizierung der Nitrat-abhängige Fe(II)-oxidierenden Mikroorganismen im Sediment des Moorsees Große Fuchskuhle zeigte eine um zwei Größenordnung erhöhte Zellzahl von chemolithotrophen Nitrat-abhängige Fe(II)-oxidierenden Mikroorganismen bei Huminstoffzugabe zum Wachstumsmedium. Bei Sediment Inkubationen unter chemolithotrophen Nitrat-abhängigen Fe(II)-oxidierenden Bedingungen wurden Mikroorganismen der Gattung Thiomonas angereichert. Einen weitere Charakterisierung dieser Anreicherungen lieferte vorläufige Belege dafür, dass diese Thiomonas Stämme fähig zur chemolithotrophen Nitrat-abhängigen Fe(II)-Oxidation sind. Zuletzt wurde der Thiomonas arsenivorans Stamm 3As auf die Fähigkeit zur chemolithotrophen Nitrat-abhängigen Fe(II)-Oxidation getestet, da alle dafür notwendigen Gene im Genom identifiziert werden konnten. Diese Versuche wurden sowohl unter Anwesenheit als auch in Abwesenheit von Huminstoffen durchgeführt. Es konnte ein stöchiometrischer Verbrauch von Fe(II) und Nitrat, wie für Nitrat-abhängige Fe(II)-Oxidation in Gegenwart von Huminstoffen unter autotrophen Wachstumsbedingungen erwarted, beobachtet werden. Demgegenüber konnte in Abwesenheit von Huminstoffen weder unter autothrophen noch unter heterotrophen Bedingungen Fe(II)-Oxidation beobachtet werden, was auf die Bedeutung von Huminstoffen bei der Vermittlung Nitrat-abhängiger Fe(II)-Oxidation hinweist. Nach unserem Wissen ist dies die erste Studie, welche die chemolithotrophe Nitrat-abhängige Fe(II) oxidierende Physiologie in einer bakteriellen Reinkultur zeigt. Darüberhinaus konnte in dieser Arbeit gezeigt werden, dass Huminstoffe mikrobielle Fe(II)-Oxidation begünstigen.

Iron sulfur (Fe-S) clusters are important cofactors of numerous proteins and are present in all known forms of life. Fe-S proteins have various functions in electron transport, enzyme catalysis and gene regulation. Moreover, recently Fe-S cluster-containing proteins with a function in essential cellular processes such as DNA replication, DNA repair, transcription and ribosome function were detected. The synthesis of the Fe-S clusters and their subsequent insertion into apoproteins require three complex proteinaceous machineries in eukaryotes that are localized in the mitochondria and the cytosol. The maturation of cytosolic and nuclear Fe-S proteins is accomplished by the cooperation of the mitochondrial iron sulfur cluster (ISC) assembly machinery, the ISC export machinery and the cytosolic iron sulfur protein assembly (CIA) machinery. The CIA machinery consists of eight known proteins but their interactions with each other are not fully understood. Moreover it is likely that even more CIA proteins are involved in this complex biosynthetic process. In the first part of my thesis the interactions of previously known CIA proteins were analyzed in the model organism Saccharomyces cerevisiae. By performing a systematic CIA protein interaction analysis it was shown that the individual CIA factors do not assemble a supercomplex. They rather can be divided into three functional subcomplexes that assist different stages in biogenesis of cytosolic and nuclear Fe-S proteins. The scaffold protein complex consisting of Cfd1-Nbp35 is required for the assembly of a [4Fe-4S] cluster in the early phase of biogenesis. Electrons required for this reaction are provided by the CIA subcomplex Dre2-Tah18. In the late phase of cytosolic Fe-S protein biogenesis the newly assembled Fe-S cluster is transferred from the scaffold protein complex onto apoproteins. This step is performed by the so-called "CIA targeting complex" consisting of Cia1, Cia2 and Met18. The CIA factor Nar1 fulfills an intermediary, so far not well-defined function and interacts with both the early and the late parts of the CIA machinery. In the second part of my thesis the essential proteins Yae1 and Lto1 were discovered and characterized as new components of the CIA machinery. These two proteins are highly conserved and form a complex that is specifically required under aerobic conditions. In a proteome-wide interaction analysis Yae1 and Lto1 were identified as binding partners of the CIA targeting complex. Moreover, a previous systematic interaction analysis has shown an association of Yae1-Lto1 with the Fe-S protein Rli1. However, a functional connection of these proteins to the CIA machinery has not been reported until now. It was shown in this work that the depletion of Yae1 or Lto1 results in a maturation defect of the essential Fe-S protein Rli1 but surprisingly no other cytosolic or nuclear target proteins were affected. Additionally, by setting up a new technology I showed that the cofactors were stably associated with Rli1 when Yae1 was rapidly degraded, confirming that this protein is not a stabilization factor of the two Fe-S clusters. These findings suggest that Yae1 and Lto1 are highly specific maturation factors for Rli1. The Yae1-Lto1 complex is conserved in eukaryotes and can be functionally replaced by the human YAE1D1-ORAOV1 complex in yeast. This work shows that certain cytosolic Fe-S proteins such as Rli1 obviously do not only depend on the general CIA machinery for the maturation of their Fe-S clusters, but also on the function of other more specialized CIA components. A comparable substrate specificity as observed for these two new CIA factors was described recently for the human CIA factor CIA2A, which is solely responsible for the maturation of the cytosolic Fe-S protein IRP1. It has to be clarified whether additional CIA factors exist that support the dedicated maturation of eukaryotic Fe-S proteins. Furthermore, future studies will have to address the molecular mechanism by which such highly specific factors conduct the insertion of the Fe-S clusters into target proteins., Eisen-Schwefel (Fe-S) Cluster sind wichtige Kofaktoren zahlreicher Proteine und kommen in allen bekannten Lebensformen vor. Fe-S Proteine haben vielfältige Funktionen, u.a. beim Elektronentransport, in Enzymkatalysen und in der Genregulation. In neuester Zeit wurden überdies Fe-S Cluster-haltige Proteine mit einer Funktion in essentiellen zellulären Prozessen wie der DNA-Replikation, DNA-Reparatur, Transkription und Ribosomenassemblierung entdeckt. Die Synthese der Fe-S Cluster und der anschließende Einbau in Apoproteine erfordern in Eukaryoten drei komplexe Synthesemaschinerien, die in den Mitochondrien und im Zytosol lokalisiert sind. Die Reifung zytosolischer und nukleärer Fe-S Proteine wird durch das Zusammenwirken der mitochondrialen Eisen-Schwefel Cluster (ISC)-Assemblierungsmaschinerie, der ISC-Exportmaschinerie und der zytosolischen Eisen-Schwefel Protein Assemblierungs (CIA)-Maschinerie ermöglicht. Die CIA-Maschinerie besteht bisher aus acht Proteinen, jedoch sind deren Interaktionen nicht umfassend beschrieben. Darüber hinaus ist wahrscheinlich, dass weitere CIA-Proteine an diesem komplexen Prozess beteiligt sind. Im ersten Teil dieser Arbeit wurden die Interaktionen der bisher bekannten CIA-Proteine im Modellorganismus Saccharomyces cerevisiae analysiert. Dabei konnte in einer systematischen CIA-Protein Interaktionsanalyse gezeigt werden, dass die einzelnen CIA-Faktoren keinen Superkomplex bilden, sondern in drei funktionelle Subkomplexe unterteilt werden können, die unterschiedlichen Phasen der Biogenese zytosolischer und nukleärer Fe-S Proteine zuzuordnen sind. Auf dem Gerüstproteinkomplex bestehend aus Cfd1-Nbp35 wird in der frühen Phase ein [4Fe-4S] Cluster assembliert. Die für diese Reaktion nötigen Elektronen werden durch den CIA-Subkomplex Dre2-Tah18 bereitgestellt. In der späten Phase der zytosolischen Fe-S Proteinbiogenese wird der neu assemblierte Fe-S Cluster vom Gerüstproteinkomplex auf Apoproteine übertragen. Dieser Schritt erfolgt mithilfe des sog. „CIA-Targetingkomplexes“ bestehend aus Cia1, Cia2 und Met18. Der CIA-Faktor Nar1 nimmt dabei eine intermediäre, noch nicht genau definierte Funktion ein und interagiert sowohl mit den frühen als auch mit den späten Teilen der CIA-Maschinerie. Im zweiten Teil dieser Arbeit wurden die essentiellen Faktoren Yae1 und Lto1 als neue Bestandteile der CIA-Maschinerie entdeckt und charakterisiert. Diese beiden Proteine zeichnen sich durch eine hohe Konservierung aus und bilden einen Komplex, der unter aeroben Bedingungen von besonderer Bedeutung ist. Yae1 und Lto1 wurden durch Auswertung der proteomweiten Interaktionsanalyse als Bindepartner der Komponenten des CIA-Targetingkomplexes identifiziert. Eine frühere systematische Interaktionsstudie hat außerdem gezeigt, dass Yae1 und Lto1 mit dem Fe-S Protein Rli1 interagieren. Die Verbindung zur CIA-Maschinerie war jedoch bis dato nicht bekannt. Es konnte in dieser Arbeit gezeigt werden, dass die Depletion von Yae1 oder Lto1 einen Reifungsdefekt des essentiellen Fe-S Proteins Rli1, nicht aber anderer zytosolischer oder nukleärer Zielproteine zur Folge hat. Darüber hinaus wurde unter Verwendung einer neu etablierten Methode gezeigt, dass Rli1 seine Fe-S Cluster auch nach raschem Abbau von Yae1 stabil gebunden hält, was gegen eine Rolle des Yae1 als Stabilisator der beiden Fe-S Cluster spricht. Diese Befunde legen nahe, dass den beiden Proteinen Yae1 und Lto1 eine Funktion als hoch spezifische Reifungsfaktoren für Rli1 zukommt. Der Komplex aus Yae1 und Lto1 ist in Eukaryoten konserviert und kann durch den humanen YAE1D1-ORAOV1 Komplex funktionell in der Hefe ersetzt werden. Diese Arbeit zeigt, dass bestimmte zytosolische Fe-S Proteine wie Rli1 offensichtlich nicht nur die generelle CIA-Maschinerie, sondern auch die Funktion weiterer spezifischer CIA-Komponenten für die Reifung ihrer Fe-S Cluster benötigen. Eine vergleichbar hohe Substratspezifität wie bei diesen neu entdeckten CIA-Faktoren wurde kürzlich auch für den humanen CIA-Faktor CIA2A beschrieben, der ausschließlich für die Maturierung des zytosolischen Fe-S Proteins IRP1 verantwortlich ist. Zukünftige Untersuchungen müssen deshalb die interessante Frage angehen, ob nicht weitere CIA-Faktoren existieren, die auf bisher unbekannte Weise die Reifung eukaryotischer Fe-S Proteine unterstützen. Ein weiteres Ziel wird die Klärung der Frage sein, nach welchem molekularen Mechanismus solch hoch spezifische Faktoren den Fe-S Cluster-Einbau in Zielproteine gewährleisten.

In dem Gram+ Bakterium Bacillus subtilis spielt Prolin eine wichtige Rolle. Als proteinogene Aminosäure ist es essentiell für die Biosynthese von Proteinen, es findet als Kohlen- oder Stickstoffquelle Verwendung und es fungiert außerdem als osmotische Schutzsubstanz. B. subtilis besitzt zwei Wege um Prolin de novo zu synthetisieren: die anabole und die osmoadaptive Prolinbiosynthese. Beide Wege sind über das gemeinsam genutzte Enzym ProA miteinander verknüpft. Die Deletion von proA führt zu einer Störung in der Prolinbiosynthese. In dieser Arbeit wird gezeigt, dass Suppressor-Mutationen innerhalb der rocR-rocDEF-Region diese Störung durch die Rekrutierung des Argininabbau-Weges für die Prolin Neusynthese ausgleichen können. Zwei Klassen von Mutationen konnten identifiziert werden: (i) einzelner Aminosäureaustausch im Aktivatorprotein RocR führt zu teilweise Induktor unabhängigen RocR*-Proteinen; (ii) Mutationen in der Promotorregion von rocDEF führen zur Aktivierung eines kryptischen SigA-abhängigen Promotors. In beiden Fällen kam es zu einer erhöhten Transkription des rocDEF-Operons, was die Erhöhung der Menge an RocD in der Zelle zur Folge hatte. RocD als Teil des Argininabbau-Weges produziert dabei dasselbe Produkt wie ProA und kann somit dessen Fehlen ersetzen. Außerdem entwickelte sich dabei ein völlig neuer regulatorischer Mechanismus für die Expression des rocDEF-Operons, da dessen Expression nun auch in Anwesenheit von Ammonium durch Prolin induziert werden konnte. Dies demonstriert wie effektiv sich Bakterien an Einschränkungen innerhalb essentieller Stoffwechselwege anpassen können. In seinem natürlichen Habitat ist B. subtilis ständig wechselnden Umweltbedingungen, wie die Osmolarität, ausgesetzt. Die Anpassung an hochosmolare Bedingungen erfolgt dabei durch die osmotisch kontrollierte de novo Synthese von Prolin, oder durch dessen Aufnahme aus der Umgebung. In dieser Arbeit wird gezeigt, dass prolinhaltige Peptide ebenfalls eine osmoprotektive Wirkung besitzen. Nach dem Import der Peptide durch spezielle Peptidtransporter (App, Dpp, Opp, DtpT) kommt es intrazellulär zu deren Spaltung, was zu einer Freisetzung des Prolins führt. Durch die Akkumulation dieses Prolins kommt es zu einem Schutz der osmotisch gestressten Zelle. Die an der Spaltung der Xaa-Pro bzw. Xaa-Pro-Xaa Peptide beteiligten Peptidasen konnten identifiziert werden: PapA (YqhT) und PapB (YkvY). Dies fügt einen neuen Aspekt in der Nutzung von Prolin als osmotische Schutzsubstanz durch B. subtilis hinzu und demonstriert wie gewinnbringend die im Habitat verfügbaren Ressourcen zum Schutz vor osmotischem Stress genutzt werden können. B. subtilis besitzt neben den beiden bekannten Prolintransportern (PutP, OpuE) noch ein weiteres, bisher unbekanntes Prolinaufnahmesystem. In dieser Arbeit wurde für dessen Identifizierung ein genetisches Screening-Verfahren entwickelt. In einem Stamm der Prolin nicht mehr aktiv in die Zelle aufnehmen kann, wurden trotz externer Zugabe von Prolin die Gene des Prolinabbau-Weges (putBCP) nicht mehr exprimiert. Dies demonstriert, dass der Import des externen Prolins in die Zelle, die Voraussetzung für die Induktion der Transkription von putBCP ist. Die im Rahmen dieser Arbeit erlangten Erkenntnisse enthüllen weitere Facetten der physiologischen Rolle von Prolin in B. subtilis und zeigen außerdem sehr eindrucksvoll, wie effektiv sich Bakterien an die unterschiedlichsten Veränderungen anpassen können.

Type IV pili (T4P) are hairlike surface structures, present on a variety of different bacteria. They are polymers involved in diverse functions such as motility, adherence, protein secretion, DNA uptake and in many pathogens they are found to be the primary colonization factor. Especially their role in virulence makes T4P particularly relevant for studying pilus function and assembly. The T4P machinery consists of 12 conserved proteins building an envelope-spanning macromolecular machinery, which localizes polarly in Myxococcus xanthus. Although most of the proteins have been known and studied for a long time, the precise mechanism of how and in which order the individual components are assembled to generate a macromolecular machinery remain largely unknown. Here we uncovered a sequential, outside-in assembly pathway starting with the outer membrane (OM) PilQ secretin, and proceeding inwards over the periplasm and inner membrane (IM) to the cytoplasm. Specifically, by taking advantage of the cell biology tools for studying T4P in M. xanthus, we carried out one of the largest screens comprising 11 of the 12 proteins of the T4P machinery by systematically profiling the stability and localization of T4P proteins in the absence of each individual other T4P protein in combination with mapping direct protein-protein interactions. Using these approaches, we show that assembly of the T4P machinery initiates with the formation of the PilQ secretin ring, assisted by its pilotin Tgl, in the OM. Oligomeric PilQ serves as an assembly platform for further T4P components. PilQ recruits TsaP, a peptidoglycan binding protein, as well as PilP by direct interactions with PilP. PilP, in turn, recruits the IM proteins PilN and PilO. PilP/PilO/PilN likely make up a complex aligning IM and OM components of the T4P machinery. The PilP/PilO/PilN complex recruits cytoplasmic PilM by direct interaction between PilN and PilM and recruits PilC, presumably by direct interaction between PilC and PilO. Finally, the ATPases PilB and PilT that power extension and retraction of T4P, localize independently of other T4P machinery proteins. In this study, we elucidate the assembly process and functional interactions between T4P proteins. This work lays the basis for further understanding of these functionally highly versatile surface structures. Interestingly, the assembly of the type II and III secretion systems also initiates from the OM secretin and proceeds inwards. Thus, an outside-in assembly pathway is emerging as a conserved feature in secretin-containing trans-envelope export machines.

Glutaredoxine kommen in allen phylogenetischen Reichen der Lebewesen vor. Zu dieser Proteinfamilie gehören Dithiol-Glutaredoxine, die ein CPYC Motiv im aktiven Zentrum aufweisen und eine wichtige Rolle bei der Aufrechterhaltung des zellulären Redoxpotentials spielen. Einzeldomänen Monothiol-Glutaredoxine mit einem CGFS Motiv im aktiven Zentrum spielen eine zentrale Funktion bei der Maturierung zellulärer Eisen-Schwefel (Fe/S) Proteine und sind üblicherweise in den Mitochondrien und Chloroplasten lokalisiert. Multidomänen Monothiol-Glutaredoxine sind Fusionsproteine, die aus einer N-terminalen Thioredoxindomäne und einer oder mehreren C-terminalen Monothiol Glutaredoxindomäne(n) bestehen. Diese Unterfamilie der Glutaredoxine kommt im Cytosol und Nukleus fast aller Eukaryoten vor. In der Bäckerhefe S. cerevisiae binden die Multidomänen-Glutaredoxine Grx3 und Grx4 einen Fe/S-Kofaktor und spielen eine essenzielle Rolle bei der Maturierung aller Klassen Eisen-haltiger Proteine und der Regulation der zellulären Eisenhomöostase. Zentrales Ziel der Arbeit war die bessere funktionelle Charakterisierung der Multidomänen Monothiol-Glutaredoxine. Zwei zentrale Fragen standen hierbei im Vordergrund: (1) Welche strukturellen Unterschiede befähigen die ansonsten sehr ähnlichen Glutaredoxine dazu, jeweils spezifische Funktionen zu übernehmen? (2) In wie weit ist die für S. cerevisiae beschriebene Funktion der Multidomänen Glutaredoxine im Eisenmetabolismus höherer Eukaryoten konserviert? Der ersten Frage wurde durch Untersuchungen der Auswirkungen gezielter Mutationen auf die Funktionalität von Grx4 in S. cerevisiae nachgegangen. Diese Analyse zeigte, dass ein Dithiol-Motiv anstelle des Monothiol Motivs im aktiven Zentrum von Grx4 zu einer stark reduzierten Fe/S Clusterbindung und einem moderaten Funktionsverlust dieses Proteins in vivo führt. Hingegen ist ein Prolin im aktiven Zentrum von Grx4 im Gegensatz zu den Einzeldomänen Glutaredoxinen vollkommen kompatibel mit der Bindung eines Fe/S Clusters. Darüber hinaus ist die Thioredoxindomäne von Grx4 absolut essenziell für die Funktion. Wahrscheinlich fungiert diese Domäne als Bindestelle für andere Proteine. Grx3 und Grx4 interagieren direkt mit dem Eisen-regulierten Transkriptionsfaktor Aft1 und inaktivieren Aft1 bei ausreichend verfügbarem Eisen. Es konnte gezeigt werden, dass die Regulation von Aft1 inkompatibel mit einem Dithiol-Motiv im aktiven Zentrum von Grx4 ist und dass Aft1 mit dem C Terminus von Grx4 interagiert. Diese Interaktion ist nicht Eisen-abhängig und ist erhöht, wenn Grx4 keinen Fe/S Cluster gebunden hat. Somit ist nur die Inaktivierung von Aft1 direkt vom Fe/S Cluster von Grx4 abhängig. Insgesamt zeigte diese Arbeit wichtige strukturelle Voraussetzungen für die Funktion der Multidomänen Glutaredoxine im Eisenmetabolismus von S. cerevisiae auf. Zur Beantwortung der zweiten Frage wurden die Auswirkungen der siRNA-vermittelten Depletion von Grx3 in HeLa Zellen untersucht. Grx3-depletierte HeLa Zellen zeigten vergleichbar mit Hefe-Zellen Defekte in der Assemblierung von Fe/S Proteinen des Cytosols und des Zellkerns. Ein Defekt in der Reifung des „Iron Regulatory Protein 1“ (IRP1) führte zum Abbau der Apo-Form dieses Proteins und entsprechenden Auswirkungen auf den Eisenmetabolismus. Im Gegensatz zu Hefe-Zellen zeigten Grx3-depletierte HeLa Zellen keinen Effekt auf die Maturierung mitochondrialer Fe/S Cluster- oder Häm-haltiger Proteine. Trotz des geänderten Eisenmetabolismus wies das Transkriptom von Grx3-depletierten HeLa Zellen keine geänderte Regulation typischer Eisen-regulierter Gene auf. Dazu gehören z.B. Gene, die eine Funktion in den Mitochondrien sowie unter hypoxischen Bedingungen ausüben. Dies und die fehlenden Effekte auf die mitochondrialen Eisen-abhängigen Proteine sind auffällige Unterschiede zu der Hefe. Zusammenfassend konnte eine in allen Eukaryoten konservierte Funktion von Grx3 hinsichtlich der Biogenese von cytosolischen, nicht aber mitochondrialen Fe/S Proteinen nachgewiesen werden.

Metatranscriptomics is a state-of-the-art technique to elucidate the functional activities of microbial communities, but its application is still limited to marine microbial assemblages. In my PhD project, we established the complete approach of soil metatranscriptomics, involving RNA extraction, cDNA library preparation by random priming, 454-pyrosequencing, and bioinformatic data analysis. The approach was tested on microbial communities in the oxic surface layer and the anoxic bulk soil of flooded rice paddy soil microcosms. Total RNA was recovered in high integrity and purity by low-pH phenol extraction (pH 5.0) followed by Q-Sepharose column chromatography. We were able to enrich mRNA sequences up to 50-70% in the metatranscriptome libraries using Ribo-Zero™ rRNA removal kit (Meta-Bacteria). All the 454 reads obtained were preprocessed prior to data analysis to minimize sequence ambiguities. A total of 10,000 SSU-ribotags (total RNA) were analyzed to elucidate community composition in the oxic and anoxic zones at three different incubation time points (25, 45 and 90 days after transplantation of rice seedlings). Additionally, about 45,000 and 12,000 mRNA-tags (enriched mRNA) were obtained for the analysis of functional activities in, respectively, the oxic and anoxic zone of 90-day-old rice microcosms. SSU-ribotag data analysis revealed no major temporal changes in community composition except for Geobacter, Clostridia and methanogens in the anoxic bulk soil. However, the taxonomic composition of microbial communities was clearly distinct between the oxic and anoxic zones, with cyanobacteria being the dominant group in the surface layer. Although mRNA-tags related to basic cellular functions were most abundant in both mRNA datasets, the expression of specific functions in response to different oxygen conditions was observed such as, for example, methane oxidation in the oxic zone and methanogenesis in the anoxic zone. Our metatranscriptomic approach provides a means to analyze the composition and functional gene expression of complex soil microbial communities while avoiding the limitations of PCR-based approaches., Metatranskriptomik ist eine ‘state-of-the-art’ Technik um die funktionellen Aktivitäten mikrobieller Gemeinschaften aufzuklären. Die Anwendung hat sich bis auf wenige Ausnahmen bis jetzt auf marine Lebensräume fokussiert. In meiner Doktorarbeit haben wir den gesamten Ablauf der Metatranskriptomik, einschließlich RNA Extraktion, Vorbereiten von cDNA Bibliotheken mittels Zufalls-priming, 454 Pyrosequenzierung und bioinformatische Analyse für terrestrische Lebensräume etabliert. Der gesamte, entwickelte Ablauf wurde bezogen auf mikrobielle Gemeinschaften in oxischer- und anoxischer Erde von Reisbodenmikrokosmen umfassend getestet. Gesamt-RNA von hoher Integrität und Reinheit konnte bei einem pH Wert von 5 mittels Phenolextraktion kombiniert mit Q-Sepharose Säulenchromatographie gewonnen werden. Durch Anwendung des Ribo-Zero ™ rRNA removal kits (Meta-Bacteria) war es uns möglich mRNA bis zu einem Grad von 50-70% in unseren Metatranskriptombibliotheken anzureichern. Alle erhaltenen 454 reads sind vor der eigentlichen Datenverarbeitung vorverarbeitet worden um potentielle Unklarheiten auszuräumen. Insgesamt 10,000 SSU-ribotags (Gesamt-RNA) sind analysiert worden um die Gemeinschaftsstruktur in den oxischen und anoxischen Zonen an drei unterschiedlichen Inkubationszeitpunkten (25, 45 und 90 Tage, nach dem Pflanzen von Reiskeimlingen) aufklären zu können. Zusätzlich konnten 45,000 beziehungsweise 12,000 mRNA-tags (angereicherte mRNA) für die Analyse funktioneller Aktivitäten, bezogen auf die oxische und anoxische Zone 90 Tage alter Reismikrokosmen gewonnen werden. Die Analyse der SSU-ribotags hat keine gravierenden Veränderungen der mikrobiellen Gemeinschaften gezeigt, mit Ausnahme von Geobacter, Clostridien und Methanogenen in der anoxischen Zone. Nichtsdestotrotz konnte belegt werden das klare taxonomische Unterschiede zwischen der oxischen und anoxischen Zone vorliegen, wobei Cyanobakterien die dominierende Gruppe der oxischen Zone darstellen. Obwohl mRNA-tags bezogen auf grundlegende zelluläre Funktionen das Gros in beiden Datensätzen ausmachten, konnten spezifische Funktionen in Abhängigkeit zur Verfügbarkeit von Sauerstoff gezeigt werden. So zum Beispiel Zusammenfassung VI Methanoxidierung in der oxischen Zone und Methanogenese unter anoxischen Bedingungen. Der von uns etablierte Ansatz der Metatranskriptomik stellt ein nützliches Mittel dar um die Zusammensetznung und funktionelle Genexpression von komplexen, terrestrischen mikrobiellen Gemeinschaften untersuchen zu können, ohne den Beschränkungen PCR-basierter Techniken zu unterliegen.

RNA Interferenz ist ein natürlicher Prozess in eukaryoten Zellen, der zur spezifischen Herunterregulation der Genexpression (Gen-Silencing) führt. Der Mechanismus der RNAi wird durch 21 - 23 nt lange doppelsträngige RNA-Moleküle (siRNA) vermittelt, welche sequenzspezifisch den Abbau und die Degradation ihrer Ziel-mRNA herbeiführen, indem sie den RISC-Komplex im Zytosol zu seiner Ziel-mRNA dirigieren. Ein Kriterium bei der Transfektion der Zellen mit siRNA ist der schnelle Abbau der Nukleinsäuren durch Ribonukleasen und damit eine verminderte Transfektionseffizienz. Polyethylenimine sind synthetische Polymere, die in verschiedenen Molmassen vorliegen und die eine hohe kationische Ladungsdichte aufweisen. Aufgrund dieser Protonierung sind sie in der Lage, Komplexe mit siRNA oder DNA zu bilden. Als positiv geladene Polyplexe interagieren sie dann mit der Zellmembran und werden per Endozytose in das Zytosol aufgenommen. Die Pufferkapazität der Polyethylenimine ermöglicht das Verlassen der Lyosomen nach deren Platzen (Protonenschwammhypothese) und schützt die Nukleinsäuren vor der Degradation. In dieser Arbeit wurde die gelpermeationschromatographische Trennung der Lösung eines verzweigten 25-kDa-Polyethylenimins zur Herstellung eines Low molecular weight Polyethylenimins genutzt. Dieses als F25-LMW-PEI bezeichnete Polyethylenimin zeigte eine verbesserte Transfektionseffizienz sowie eine geringere Zytotoxizität, die bei Transfektionsversuchen mit den Zelllinien SKOV3, U87 und PC3 näher untersucht wurden. Hier konnten bei Co-Transfektionen mit DNA hervorragende Transfektionseigenschaften nachgewiesen werden. Gleichfalls war die durch siRNA vermittelte Herunterregulation der Luciferase bei stabil Luciferase-exprimierenden SKOV3-10-Zellen unter verschiedenen Transfektionsbedingungen eindeutig nachweisbar. Auch nach Lyophilisierung und Resolubilisierung der PEI/siRNA/DNA-Komplexe konnte ein Genknockdown durch RNAi beobachtet werden. Zur weiteren Charakterisierung des F25-LMW-PEI-vermittelten siRNA-Targetings tumorrelevanter Genprodukte wurden die Prostatakarzinomzelllinie PC3 sowie die Glioblastomzelllinie U87 verwendet. Die Prostatakarzinomzellen PC3 exprimieren den wichtigen Angiogenese-Faktor VEGF, welcher vermehrt beim Tumorwachstum und der damit verbundenen Angiogenese nachgewiesen wird. Eine Vielzahl von Krebsarten geht mit einer erhöhten VEGF-mRNA-Expression einher. Die Möglichkeit des wirkungsvollen siRNA-Targetings und des Knockdowns wurde durch ein vermindertes PC3-Zellwachstum im WST-Assay dargestellt. U87-Zellen exprimieren den Heparin-bindenden Wachstumsfaktor Pleiotrophin (PTN), welcher vermehrt bei bösartigen Erkrankungen gefunden wird. Die protoonkogene Wirkung des PTN-Gens beruht hauptsächlich auf der Stimulation der Proliferation von Tumorzellen und der Angiogenese. Bei den U87-Zellen konnte bei den mit der spezifischen PTN-siRNA transfizierten Zellen eine PTN-Herunterregulation auf mRNA- und Protein-Ebene nachgewiesen werden, was zu einer verminderten Zellproliferation führte. Die Möglichkeit der Lyophilisierung der F25-LMW-PEI/siRNA-Komplexe war auch bei Transfektion der PC3- sowie der U87-Zellen eindeutig nachweisbar und es zeigten sich nach der Transfektion mit den spezifischen siRNAs ein vermindertes Zellwachstum der malignen Zellen sowie eine verminderte Konzentration von PTN auf Proteinebene., RNA interference is a natural process in eukaryotic cells leading to the specific down-regulation of gene expression (gene silencing). The mechanism of RNAi is mediated through 21-23 nt long double-stranded RNA molecules (siRNA) which sequence-specifically induce the degradation of their target-mRNA. One critical factor that determines the success of RNAi is the rapid degradation of nucleic acids by ribonucleases and reduced transfection efficiency. Polyethylenimines are synthetic polymers which are present in different molecular weights and which have a high cationic charge density. Due to their protonation they are able to form complexes with DNA or siRNA. As positively charged polyplexes they interact with the cell membrane and are absorbed by endocytosis into the cytosol. By fractionation of a commercially available 25kDa PEI using gel permeation chromatography, a low molecular weight polyethylenimine (F25-LMW-PEI) with superior transfection efficacy and low toxicity in the cell lines SKOV3, U87 and PC3 was obtained. Upon lyophilization and reconstitution of F25-LMW-PEI/siRNA/DNA complexes, siRNAs are still able to efficiently induce RNAi. To further demonstrate their applicability, lyophilized PEI/siRNA complexes are employed for targeting the growth factors VEGF and PTN. Treatment of the PC3 prostate carcinoma cells or U87 glioblastoma cells with fresh or with lyophilized complexes results in decreased cell proliferation in different assays due to the siRNA-mediated downregulation of VEGF and PTN. In conclusion, siRNAs can be applied in lyophilizes formulations, and lyophilized F25-LMW-PEI-based siRNA complexes represent a powerful, inexpensive, non-toxic and simple ready-to-use platform for the specific and efficient targeting of genes in vitro.

Sporisorium relianum ist ein Verursacher von Maiskopfbrand. Die Symptome werden sichtbar, wenn der Pilz Sporenbildung und Verlaubung (Phyllodie) im Blütenstand verursacht. In dieser Studie sollten Symptom- und Virulenzfaktoren des Pathogens identifiziert und charakterisiert werden, und herausgefunden werden, wie der Pilz das Entwicklungsprogramm von Mais verändert. Die Interaktion zwischen Mais und S. reilianum wurde von beiden Seiten untersucht. Auf der Seite der Maispflanze wurden die induzierten Veränderungen in Bezug auf Transkription, Hormongehalt und Konzentration der reaktiven Sauerstoffspezies (ROS) untersucht. Morphologische Studien zeigten, dass eine Infektion mit S. reilianum den subapikalen Auswuchs von Kolben förderte, welches darauf hindeutete, dass die Anwesenheit des Pilzes die Apikaldominanz unterdrückt. Eine Kolonisierung mit S. reilianum führte außerdem zu einem Anstieg der Zytokinin- und Auxingesamtkonzentrationen im Blütenstand und zu einer Akkumulation von ROS, was die Unterdrückung der Apikaldominanz erklären könnte. Ferner führte eine Infektion mit S. reilianum zum Verlust der Identität der Blütenorgane und des Meristems, sowie zum Verlust der Meristem-Determinanz. Microarray-Analysen zeigten, dass diese Entwicklungsveränderungen von einer transkriptionellen Regulation von Genen begleitet waren, die für bekannte oder postulierte Regulatoren der Identität der Blütenorgane und des Meristems sowie der Meristem-Determinanz kodieren. Auf der Seite von S. reilianum wurden Genomvergleiche mit den eng verwandten Brandpilzen Ustilago maydis und Ustilago hordei durchgeführt, um potentielle Genkandidaten zu identifizieren die für die Symptomausbildung oder Virulenz auf Mais verantwortlich sind. Eine funktionelle Charakterisierung der Kandidaten zeigte, dass die Deletion von dicer nicht zu einer Veränderung der Virulenz oder der Stressresistenz führte. Weiterhin wurden Gene mit Avirulenz- (sr10057, sr10060, sruni1 und sruni2) und mit Virulenzfunktion (clusters 19A, cluster 5-1uni und sruni5) identifiziert. Cluster 19A3 scheint Faktoren zur Unterdrückung der Blattalterung zu kodieren, da seine Deletion das verfrühte Sterben der Spitzen infizierter Blätter auslöste. Weiterhin erfüllte vag1 Virulenzfunktionen in Blättern und Avirulenzfunktionen in Nodien. Zwei Gene, sad1 und sad2, zeigten eine Beteiligung an der Unterdrückung der Apikaldominanz. SAD1 und VAG1 werden im Blatt proteolytisch abgebaut. Nach Expression in Pflanzenzellen lokalisierte SAD1 im Zellkern und im Zytoplasma und interagierte mit dem Effektor MIG1 sowie mit Pflanzenproteinen, welche vermutlich an der Ubiquitinierung, an Kernfunktionen und an Signalprozessen beteiligt sind. Diese Interaktionspartner könnten den Mechanismus des organspezifischen Abbaus von SAD1 und die Rolle von SAD1 in der Unterdrückung der Apikaldominanz erklären. Somit konnte eine molekulare Verbindung zwischen spezifischen Effektoren von S. reilianum und induzierten Entwicklungsveränderungen im Wirt etabliert werden., Sporisorium reilianum causes head smut disease on maize. Symptoms of S. reilianum become obvious when the fungus forms spores and induces phyllody in the inflorescences. This study aimed to provide an understanding of how S. reilianum changes the developmental program of maize, and to identify and characterize symptom and virulence determinants of the pathogen. The maize-S. reilianum interaction was approached from both sides. From the side of maize, the induced alterations on morphology, transcription, hormone level and concentration of reactive oxygen species (ROS) were investigated. Morphological analysis showed that S. reilianum infection promoted outgrowth of subapical ears suggesting that fungal presence suppressed apical dominance. S. reilianum colonization also led to an increase in the total cytokinin and auxin content of the inflorescence and an accumulation of ROS that could explain suppression of apical dominance. Furthermore, S. reilianum infection triggered loss of floral organ and meristem identities, and loss of meristem determinacy. Microarray analysis showed that these developmental changes were accompanied with transcriptional regulation of genes known or proposed to regulate floral organ and meristem identities, and meristem determinacy in maize. From the side of S. reilianum, genome comparison with the closely related smuts Ustilago maydis and Ustilago hordei was performed to predict potential candidate genes with function in symptom formation or virulence on maize. Functional characterization of the candidates showed that deletion of dicer did not lead to changes in virulence or in the mutant behavior in response to different stresses. In addition, genes with avirulence functions (sr10057, sr10060, sruni1 and sruni2) and those with virulence functions (clusters 19A, cluster 5-1uni and sruni5) were identified. Cluster 19A3 was suggested to encode leaf senescence inhibitors, since its deletion triggered leaf tip death. Additionally, vag1 fulfilled avirulence and virulence functions in leaves and nodes, respectively. Two genes, sad1 and sad2 showed involvement in suppression of apical dominance. SAD1 and VAG1 were degraded in a leaf-specific manner. SAD1 localized to the nucleus and the cytoplasm when expressed in plant cells and, interacted with the effector MIG1 and plant proteins involved in ubiquitination, nuclear functions and signaling. These interaction partners could shape the mechanism of tissue-specific degradation of SAD1 and the role of SAD1 in suppression of apical dominance. Hence, a molecular link could be established between specific effectors of S. reilianum and induced developmental changes in the host.

In der Bäckerhefe Saccharomyces cerevisiae ist das RNA-Bindeprotein (RBP) Whi3 an der Regulation diverser Prozesse des Zellwachstums und der Entwicklung beteiligt. Welche Signalwege und Effektoren Whi3 für diese Kontrolle beeinflusst, ist jedoch weitestgehend unverstanden und lediglich im Rahmen der Zellgrößenkontrolle näher untersucht, in der Whi3 den G1/S-Übergang durch cytoplasmatische Retention von Cdc28-Cln3 inhibiert. In dieser Studie konnten erstmals weitere Effektoren von Whi3 identifiziert werden, mit deren Hilfe das RBP die Zellzyklusprogression und Biofilmbildung steuern könnte. Unter diesen Faktoren befinden sich die G1-Zykline Cln1/2 sowie diverse Regulatoren der Biofilmbildung wie z. B. die PKA-Untereinheit Tpk1, die DYRK-Kinase Yak1 und der Transkriptionsaktivator Tec1. Dabei scheint Whi3 durch posttranskriptionelle Regulation adäquate Proteinmengen dieser Schlüsselfaktoren bereitzustellen und könnte zu diesem Zweck die Translationseffizienz beeinflussen. Interessanter Weise konnte Whi3 in dieser Arbeit erstmals mit der Kontrolle der Ploidiestabilität assoziiert werden, da WHI3-defiziente Stämme in Abhängigkeit der Wachstumsbedingungen eine erhöhte Rate von Genomduplikationen aufweisen. Die hier gewonnenen Daten deuten darauf hin, dass Whi3 die Genomintegrität durch Regulation der Chromosomensegregation gewährleisten könnte. So beeinflusst Whi3 sowohl die Expression diverser Kohäsionskomponenten als auch der Dynaktinuntereinheit NIP100. Abschließend bietet diese Studie außerdem neue Einblicke in die Whi3-vermittelte Stresskontrolle. Dabei wird Whi3 sowohl für die Stress-induzierte Expression des Oberflächenflokkulins FLO11 als auch die allgemeine Stressantwort benötigt und könnte dies einerseits über die DYRK-Kinase Yak1 und Msn2/4 erreichen. Ferner scheint die Deletion von Whi3 ein Yak1-unabhängiges, transkriptionelles Stresssignal zu generieren, das infolge der Genomduplikation aufgehoben wird. Zusammenfassend legt diese Studie den Schluss nahe, dass das RBP Whi3 ein zentraler Regulator des Zellwachstums und der Entwicklung ist, der in der Lage ist die Signalkapazität von Regulationsnetzwerke durch hinreichende Produktion diverser Schlüsselfaktoren zu gewährleisten.

Plasmodium falciparum is an intracellular protozoan parasite that has been associated with humans since the dawn of time and causes severe forms of malaria. It is a major health problem around the globe and causes highest toll of death among children less than five years of age in developing countries. An infected female Anopheles mosquito injects malaria sporozoites into the skin while taking a blood meal. The sporozoites, which are released into the blood stream, reaches the liver where they undergo exoerythrocytic schizogony. After exoerythrocytic schizogony, millions of merozoites are released into the blood stream and infect new red blood cells, where they undergo erythrocytic schizogony in a cyclic manner. The erythrocytic schizogony stage of Plasmodium life cycle is where all clinical manifestations of malaria as a disease become apparent. The clinical symptoms like fever, headache, jaundice, vomiting have been associated with hyperparasitemia and these clinical symptoms coincide with the cyclical release of malaria parasites during schizonts rupture. A severe form of malaria develops as a consequence of capillaric sequestration of parasitized red blood cells (pRBC) and rosetting of pRBC with uninfected red blood cells which obstruct the blood flow to the brain. Activation of complement and coagulation, and increase in vascular permeability further aggravates severity of the disease which can lead to microcirculatory disturbances with comatous death as the ultimate outcome. Rupture of each Plasmodium falciparum infected red blood cell releases 8-32 infective merozoites along with a single digestive vacuole into the blood stream. The released digestive vacuole is an organelle in which hemozoin is surrounded by an intact membrane. We have discovered that the digestive vacuoles have the capacity to dually activate the complement and coagulation systems. Activation of complement and coagulation requires an intact DV membrane. The complement and coagulation activating properties of the DV are inhibited by low molecular weight dextran sulfate. In non-immune serum, DVs are opsonised with complement C3b and rapidly phagocytosed by polymorphonuclear granulocytes (PMN). Upon rupture, DVs lost its functional activities and the extracted malaria pigment from the DV organelle is not engulfed by the PMN. Liberated merozoites are not opsonized in non-immune serum and escape phagocytosis. High titered anti-malarial antibodies from immune patients mediate some uptake of the merozoites, but to an extent that is not sufficient to markedly reduce re-invasion rates. Engulfment of DVs by PMN induces a respiratory burst, but the generated reactive oxygen species (ROS) are unable to suppress the infective capacity of invading merozoites. Finally, ingested DVs drive the PMN into a state of functional exhaustion. Upon challenging of PMN with bacteria after DV ingestion, the ability to phagocytose bacteria prevails, but their capacity to mount a respiratory burst is reduced and microbicidal activity is compromised. We propose that these events might be linked to the development of septicemic episodes in patients with severe malaria in sub-Saharan African countries.

U. maydis ist ein pilzliches Pflanzenpathogen, das in Mais den sogenannten Maisbeulenbrand auslöst. Die pathogene Entwicklung aller Brandpilze ist an die sexuelle Entwicklung gekoppelt, die durch die Fusion zweier haploider Zellen mit unterschiedlichen Paarungstypen initiiert wird (Bölker et al., 1992). Dies führt zur Bildung eines dikaryotischen Filaments, welches in der Lage ist, Pflanzenzellen mittels spezieller Infektionsstrukturen, den Appressorien, zu penetrieren (Feldbrügge et al., 2004). Während dieses Prozesses wird die Plasmamembran des Wirtes eingestülpt und umhüllt die Pilzhyphen. Dies erzeugt eine spezielle Interaktionszone zwischen Pflanze und Pilz. Biotrophe Pathogene wie U. maydis sind vom Überleben der Wirtspflanze abhängig. Aus diesem Grund ist es essenziell für das Pathogen Erkennung durch das Pflanzenimmunsystem zu vermeiden oder zu unterdrücken, um eine kompatible Interaktion zu etablieren (Doehlemann et al., 2008b). Um diese biotrophe Interaktion mit seiner Wirtspflanze aufzubauen ist U. maydis auf eine Vielzahl von sekretierten Proteinen angewiesen. In dieser Arbeit wurde der U. maydis Effektor Tin3 charakterisiert, der signifikant an der Tumorbildung beteiligt ist und der in Hefe Zwei-Hybrid-Analysen mit einer pflanzlichen Cysteinprotease und dem pflanzlichen Autophagieprotein Beclin1 interagiert (T. Brefort, pers. Mitteilung). Expressionsstudien zeigten, dass tin3 stark und spezifisch während der biotrophen Phase hochreguliert wird. Funktionelle Studien offenbarten eine duale Funktion von Tin3, die über die Interaktion mit zwei Maisproteinen vollzogen wird. Nach der Sekretion in die apoplastische Interaktionszone inhibiert Tin3 sekretierte Mais Cysteinproteasen. In vitro Protease-Aktivitätstests in Kombination mit in vivo Studien zeigen, dass Tin3 in der Lage ist die Cysteinprotease Mir3 und nahe verwandte Proteasen durch Bindung im aktiven Zentrum zu inhibieren. Die biologische Relevanz der roteaseinhibition durch Tin3 zeigte sich in Versuchen, in denen es gelang den Virulenzphänotyp der tin3 Mutante partiell durch Proteaseinhibitoren zu erreichen. Des Weiteren konnte eine zweite Funktion von Tin3 als Autophagie-Repressor postuliert werden, die durch Hefe-Assays und in planta Autophagosomen-Färbungen entdeckt wurde. Die Expression von vier pflanzlichen Autophagiegenen war nach Deletion von tin3 induziert, ein Befund der die Inhibition der Autophagie durch Tin3 unterstützte. H2O2 Akkumulationen in Infektionen mit der tin3 Deletionsmutante deuten an, dass der Tin3 Effektor pflanzliche Abwehrreaktionen durch seine duale Funktion aktiv unterdrückt und deshalb für die Etablierung der Biotrophie benötigt wird.

Ziel dieser Doktorarbeit war es die Bedeutung des braunen Fettgewebes, über seine anerkannte Funktion hinaus, in Säugetieren zu charakterisieren. Besonders die Rolle von aktivem UCP1 während des Aufwachvorgangs auf dem Torpor und in der Prävention von reaktiven Sauerstoffradikalen während der zitterfreien Wärmebildung standen im Fokus dieser Arbeit. Um den evolutionären Ursprung von UCP1 und braunem Fett besser zu verstehen, wurden Studien an zwei Vertretern der phylogenetisch ursprünglichen Überordnung Afrotheria durchgeführt. Anhand dieser Ergebnisse sollte ein neues Licht auf die Evolution des braunen Fettgewebes geworfen werden. War wirklich die Migration in kältere, holarktische Regionen der Hauptgrund seiner Entstehung? Die vorliegende Arbeit ist in vier Kapitel gegliedert, deren Inhalt im Folgenden zusammengefasst wird., Although textbook knowledge inevitable associates brown adipose tissue with cold and body temperature regulation (regulatory thermogenesis), we are far from understanding how, why and when Eutherian mammals gained full UCP1-mediated thermogenic support. Brown adipose tissue is also present in humans, and it is currently considered a major therapeutic target in the treatment of obesity. To fully appreciate and to potentially modulate the function of this unique tissue, comparative studies from nature’s toolbox will prove invaluable new insights. In my PhD-thesis I therefore sought to expand our knowledge on brown adipose tissue thermogenesis and its significance in various mammalian orders, spanning from the in vitro to the in vivo level. In doing so, I aimed to uncover novel aspects regarding the evolution of its thermogenic function. In my studies, I used artificially generated UCP1-ablated mice to evaluate further benefits of UCP1 expression on brown adipose tissue function (ROS prevention) and the torpor behavior of Eutherian mammals from Holartic regions. Furthermore I tried to clarify the function of UCP1-mediated nonshivering thermogenesis in more “ancient” mammals from Afrotropical regions, is brown adipose tissue of Afrotherians seasonally regulated? Therefore I worked with two members of the Afrotherian clade, Western rock elephant shrews (Elephantulus rupestris) and protoendothermic Lesser hedgehog tenrecs (Echinops telfairi). The later additionally provided me the perfect model organism for another approach; the function of brown adipose tissue in protoendothermic mammals and the revealing of selection constraints that supported the evolution of brown adipose tissue and mammalian endothermy. Specifically, the following questions were addressed: 1.What are the effects of UCP1 activity on the torpor behavior of Eutherian mammals, can they arouse from hypometabolic and hypothermic states (torpor) without UCP1-mediated nonshivering thermogenesis? If so, what are the benefits of UCP1 activity for arousal? 2.Does UCP1 play a role in the prevention of reactive oxygen species during nonshivering thermogenesis? Was the prevention of ROS the ancient function of UCP1? 3.Do species from the Afrotropics adjust their thermoregulatory capacities during winter? Is nonshivering thermogenesis in Western rock elephant shrews adaptive and a common feature of the Afrotherian clade? 4.Do protoendothermic Lesser hedgehog tenrecs possess functional brown adipose tissue and adaptive thermogenesis? If so, is the specific function of UCP1 comparable between protoendothermic and endothermic mammals? 5.Was brown adipose tissue involved in the evolution of endothermy?

Die zelluläre Adhäsion stellt einen Eckpunkt für den evolutionären Erfolg mehrzelliger Organismen dar. Die Spezialisierung einzelner Zellen und das Entstehen komplexer funktioneller Einheiten manifestiert sich in verschiedensten Zell- und Gewebstypen. Desmosomen und Adhärenzverbindungen sind für die Bildung und Aufrechterhaltung dieser Gewebsstrukturen unerlässlich und ermöglichen auch deren funktionelle Dynamik. Eine wichtige strukturelle Komponente dieser Zell-Zell-Verbindungen sind Armadillo-Proteine. Diese fungieren allerdings nicht ausschließlich als Zelladhäsionsmoleküle, sondern übernehmen auch weitere zelluläre Aufgaben. Die verschiedenen funktionellen Eigenschaften der Armadillo-Proteine werden meist durch spezifische posttranslationale Modifikationen reguliert. Für einige Mitglieder der Proteinfamilie existieren bereits umfangreiche Studien, die sich mit der Dynamik der Moleküle infolge spezifischer Phosphorylierungen auseinandergesetzt haben. Regelmäßig wurden bei diesen Analysen Kinasen der Src-Familie und der epidermale Wachstumsfaktorrezeptor als katalysierende Proteine identifiziert. Im Zuge dieser Arbeit wurde das desmosomale Armadillo-Protein Plakophilin 3 auf das Vorhandensein von Proteinmodifikationen in normalen und Tumorzellen hin analysiert. Mittels zweidimensionaler Gelelektrophorese (IEF) wurde gezeigt, dass Plakophilin 3 Ziel post-translationaler Modifikationen ist, die sich zumindest teilweise auf Tyrosin-Phosphorylierungen zurückführen ließen. Aus einer entsprechenden Datenbank von Phospho-Proteinen wurden für Plakophilin 3 fünf Tyrosin-Reste und ein Serin-Rest, die einerseits häufig in Phosphoanalysen nachgewiesen wurden und andererseits von Relevanz für die Funktion des Proteins sein könnten, ausgewählt. Diese sechs Aminosäure-Reste wurden in Mutagenese-Experimenten substituiert und zur Konstruktion von PKP3-Einzelmutanten und PKP3-Kombinationsmutanten verwendet. Epitheliale Zellen wurden mit diesen unterschiedlichen PKP3-Konstrukten stabil transfiziert und mittels Immunofluoreszenz-Färbung und differentieller Extraktion untersucht. Eine funktionelle Bedeutung hinsichtlich der PKP3-Eigenschaften einzelner Modifikationen konnte hierbei bislang nicht nachgewiesen werden. Des weiteren wurden gegen die phosphorylierten Plakophilin 3-Sequenzen polyklonale Antiseren hergestellt. Aus einem der Seren konnten ausreichend sauber Phospho-spezifische Antikörper gegen den Tyrosin-Rest Y195 aufgereinigt werden. Mit Hilfe dieses Antikörpers wurde die Phosphorylierung von Plakophilin 3 an Y195 in in-vivo und in-vitro Experimenten untersucht. Plakophilin 3 wurde dabei durch Einsatz spezifischer Kinase-Inhibitoren und in einem in-vitro Kinase-Assay als neues Substrat der c-Src-Kinase identifiziert. Hierbei wurde festgestellt, dass die Phosphorylierung dieses Tyrosin-Restes streng reguliert wird und erst durch den Einsatz des Tyrosin-Phosphatase-Inhibitors Pervanadat detektiert werden kann. Wachstumsfaktoren wie EGF, IGF-1 oder HGF führten erstaunlicherweise zu keiner Phosphorylierung des spezifischen Tyrosin-Restes. Allerdings konnte die Tyrosin-Phosphorylierung durch Stimulation der Zellen mit Wasserstoff-Peroxid induziert werden. Dies legt nahe, dass PKP3 ein Zielmolekül des Src-vermittelten Signalwegs darstellt, welches in Abhängigkeit von reaktiven Sauerstoff-Spezies und oxidativem Stress an Y195 phosphoryliert wird. Immunfluoreszenz-Färbungen an c-Src-überexprimierenden Zellen zeigten, dass Y195-phosphoryliertes PKP3 an der desmosomalen Struktur lokalisiert. An dieser Stelle sind allerdings weitere funktionelle Untersuchungen notwendig, da die Tyrosin-Phosphorylierung von Plakophilin 3 in einigen Versuchen mit einem veränderten zellulären Löslichkeitsverhalten in Verbindung zu stehen schien, wobei diese Beobachtung bisher nicht mit einer einzelnen, spezifischen Phosphorylierung korreliert werden konnte. Somit hat die vorliegende Studie erstmals für das desmosomale Protein Plakophilin 3 die Existenz einer spezifischen Tyrosin-Phosphorylierung und einen damit assoziierten Signalweg aufgezeigt, deren zellbiologische Relevanz in weiterführenden Experimenten zu klären ist. Hinsichtlich maligner Tumoren konnte in früheren Arbeiten an Prostatakarzinomen ein höherer Malignitätsgrad sowohl mit einer erhöhten c-Src-Kinaseaktivität als auch mit einer gesteigerten Expression von Plakophilin 3 korreliert werden. Unter Berücksichtigung unserer experimentellen Daten wurden daraufhin Adenokarzinome der Prostata hinsichtlich des Auftretens der spezifischen Phosphorylierung von Plakophilin 3 immunhistochemisch untersucht. Hier wurde Y195-phosphoryliertes PKP3 in bestimmten Tumorarealen einiger schlecht differenzierter Adenokarzinome entlang von Zellgrenzen gefunden. Ob die untersuchte Modifikation unter Umständen eine diagnostische Relevanz hat, muss in weiterführenden Untersuchungen bestimmt werden., Cellular adhesion is one hallmark accountable for the evolutionary success of multicellular organisms. Cellular specialization and the development of sophisticated functional units are reflected by the multiple kinds of cells and tissues. Desmosomes and adherens junctions are essential for the assembly and integrity of these tissues and facilitate - inter alia - their functional dynamics. Integral parts of both types of cell junctions are proteins of the armadillo family. Next to cellular adhesion, these proteins implement further cellular functions, which are mostly regulated by specific post-translational modifications. Detailed analyses of some of these proteins describe specific phosphorylation events related to the molecular dynamics. Several studies identified kinases of the Src-family and the epidermal growth factor receptor as responsible enzymes catalyzing reversible phosphorylation of armadillo proteins. In this thesis the desmosomal armadillo protein plakophilin 3 (PKP3) was analyzed for protein modifications occurring in normal and tumor cells. Utilizing two-dimensional gel electrophoresis, it was shown that PKP3 is a target of post-translational modification events, and some of them could be attributed to phosphorylation of tyrosine residues. By screening a phosphotomic database we selected five tyrosine residues and one serine residue that were frequently detected in phosphorylation studies and that may be relevant for functional properties of PKP3. The selected amino acid residues were replaced by mutagenesis experiments and several PKP3 mutants were generated covering single or multiple mutations. Epithelial cells were stably transfected with these PKP3 constructs and analyzed by immunofluorescence staining and differential extraction. So far, the individual modifications studied did not result in a detectable change in PKP3 function or cellular behavior. Furthermore, we generated polyclonal antisera against these phosphorylated PKP3 sequences. Purification of one of these sera revealed that it was suitable for further analyses. Using these antibodies, the phosphorylation of the tyrosine residue Y195 of PKP3 was analyzed by in-vivo and in-vitro experiments. By the application of specific kinase-inhibitors and in-vitro kinase assays we identified PKP3 as a new substrate of c-Src kinase. We found that phosphorylation of this tyrosine residue is tightly regulated and is only detectable after inhibition of cellular tyrosine phosphatases by pervanadate. Incubation of cells with common growth factors like EGF, IGF-1 or HGF surprisingly did not result in a detectable phosphorylation of this specific residue. Interstingly, phosphorylation of Y195 was induced by hydrogen peroxide treatment of cells. This suggests that this modification of PKP3 is at least part of a Src-mediated signalling pathway which is dependent on reactive oxygen species and oxidative stress. Immunofluorescence staining of c-Src over-expressing cells detected Y195-phosphorylated PKP3 at the desmosomal structure. At this particular point further investigations seem to be necessary since tyrosine phosphorylation of PKP3 was associated with altered protein solubility in several experiments, and so far, these findings did not correlate with a specific phosphorylation of PKP3. In conclusion, the present study shows for the first time the existence of a specific tyrosine phosphorylation and an associated signaling pathway for the desmosomal protein PKP3, whose cell biological relevance has to be addressed in future experiments. With regard to malignant tumors, the grade of malignancy of prostate carcinomas was previously correlated with an elevated activity of c-Src kinase and increased PKP3 expression. According to the results obtained in this thesis, adenocarcinomas of prostate were immunohistochemically analyzed for the presence of Y195-phosphorylated PKP3. The specific phosphorylation was found in some poorly differentiated adenocarcinomas at distinct tumour areas along cell borders. Further studies have to elucidate the functional relevance and if the specific PKP3 modification may achieve diagnostic significance.

In seinem natürlichen Lebensraum ist der Mikroorganismus Bacillus subtilis zahlreichen Stressfaktoren ausgesetzt. Durch komplexe Regulations- sowie Differenzierungsprozesse (Biofilm-Formation, Sporulation) besitzt dieses Bakterium die Fähigkeit, sich an diverse Stresssituationen anzupassen. Die Verfügbarkeit von Wasser ist ein Beispiel für einen solchen Stressfaktor. Als eine zentrale Anpassungsstrategie an hyperosmotische Kulturbedingungen, konnte in B. subtilis die Akkumulation von kompatiblen Soluten durch Synthese und Aufnahme identifiziert werden. In Transkriptom-Analysen hyperosmotisch gestresster B. subtilis Kulturen wurden jedoch zahlreiche Gene identifiziert, die unter Hochsalz Bedingungen eine Induktion in der Genexpression zeigten. Interessanterweise kristallisierte sich bei der Analyse dieser Transkriptom-Daten eine Gruppe von Genen heraus, denen eine Beteiligung am Zellwandmetabolismus zugesprochen werden konnte. Beispiele dafür sind die Gene yqiH sowie yqiI. Das Gen yqiH kodiert vermutlich für ein Lipoprotein, wohingegen das Protein YqiI Sequenzähnlichkeiten zu der Enzymklasse der N-Acetylmuramyl-L-Alanin Amidasen aufweist. Diese Enzyme gehören zu der Gruppe der Zellwandhydrolasen (Autolysine), die in wichtige zelluläre Prozesse involviert sind. Mit Hilfe der Zymographie konnte im Verlauf dieser Arbeit die hydrolytische Fähigkeit für das Protein YqiI in vitro bestätigt werden. Außerdem wurde gezeigt, dass die Kultivierung von B. subtilis unter hyperosmotischen Bedingungen zu einer drastischen Veränderung in der Zellmorphologie führte, die ausschließlich während der Anpassungsphase auftrat. Die Ergebnisse der Transkriptom-Analysen und auch die Beobachtung der morphologischen Veränderungen führten zu der Hypothese, dass die Restrukturierung der Zellhülle eine neue Facette in der Adaptation von B. subtilis an hochsaline Bedingungen darstellen könnte. Um eine mögliche Beteiligung der Proteine YqiH sowie YqiI zu untersuchen wurden, diese im Rahmen der vorliegenden Arbeit einer biochemischen, physiologischen sowie regulatorischen Charakterisierung unterzogen. Durch eine RT-PCR-basierende Methode konnte eine Co-Transkription der yqiHI Gene mit einem weiteren Gen yqiK erstmals gezeigt werden. Die Charakterisierung einer yqiHIK Deletionsmutante zeigte unter normalen physiologischen sowie hyperosmotischen Bedingungen eine Wachstums-verzögerung im Vergleich zum Wildtyp, was alleinig auf das Fehlen der Amidase YqiI zurückgeführt werden konnte. Darüber hinaus konnte ausgeschlossen werden, dass die YqiHIK Proteine wesentlich an der Restrukturierung der Zellwand beteiligt sind. Durch Reportergenstudien wurde die osmotische Induktion des yqiHIK Operons näher analysiert. Dabei zeigte sich, dass eine Expression des yqiHIK Genclusters nur bei sehr hohen NaCl-Konzentrationen erfolgte (> 0,7 M NaCl). Die Expression wird dabei über einen SigA-Promotor vermittelt, der mit Hilfe einer Primer-Extension-Analyse identifiziert werden konnte und ferner einer detaillierten Mutagenese-Studie unterzogen wurde. Verkürzungen in der yqiHIK Promotorregion führten zu der Identifikation einer AT-reichen Region, die kritisch für die Induktion des Operons unter hohen osmotischen Bedingungen war. Diese AT-reiche Region wurde als mögliche Binderegion für den Regulator DegU aus B. subtilis wiedererkannt. Die Beteiligung des Zwei-Komponenten-Systems DegS/DegU an der Induktion der Expression des yqiHIK Operons unter salinen Bedingungen, stellte dabei ein zentrales Ergebnis dieser Arbeit dar, wobei somit erstmalig ein Hinweis darauf gegeben wurde, wie die Zelle in der Lage ist, hohe NaCl-Konzentrationen wahrzunehmen und darauf zu reagieren. Neben der Induktion des yqiHIK Operons unter hyperosmotischen Bedingungen wurden im Verlauf dieser Dissertation noch zwei weitere regulatorische Besonderheiten dieses Genclusters aufgedeckt. Zum einen konnte gezeigt werden, dass eine Induktion der Expression des yqiHIK Operons direkt nach Initiation der Sporulation erfolgte. Dabei wurde eine Beteiligung des SinR Regulators nachgewiesen, welcher auch die Expression dieses Operons unter normalen Wachstumsbedingungen verhindert. Darüber hinaus konnte eine Erhöhung der Transkription des yqiHIK Genclusters in der sogenannten „Todeszone“ beobachtet werden. Für beide dieser regulatorischen Aspekte wurde eine Beteiligung des zuvor identifizierten SigA-Promotors ausgeschlossen. Im Rahmen dieser Dissertation wurden somit drei physiologische Prozesse aufgedeckt, an denen die Genprodukte des yqiHIK Operons beteiligt zu sein scheinen, wobei die Transkription des yqiHIK Genclusters über mindestens zwei unterschiedliche Promotoren erfolgt. Zusätzlich wurden zwei Transkriptionsfaktoren identifiziert, die die Expression des yqiHIK Operons kontrollieren. Die Regulation des yqiHIK Operons ist ein gutes Beispiel dafür, wie facettenreich Bakterien ihre Umwelt wahrnehmen und genetisch darauf reagieren können.

Das Nukleoprotein der Arenaviren erfüllt zentrale Aufgaben im viralen Replikationszyklus. Dazu gehört die Enkapsidierung des viralen Genoms und die Regulation von Transkription und Replikation sowie die Interaktion mit dem Matrixprotein und die Inhibition der Typ I Interferon-Antwort. Über die Homo-Oligomerisierung des Nukleoproteins, ihre Bedeutung für diese vier Aufgaben sowie die hierfür notwendigen Domänen innerhalb des Nukleoproteins war bisher nichts bekannt. In der vorliegenden Arbeit wurde gezeigt, dass sich das Nukleoprotein in Abwesenheit viraler RNA zu symmetrischen, ringförmigen Trimeren zusammenlagert. Die Bildung dieser Trimere ist unabhängig von posttranslationalen Modifikationen und ist innerhalb der Arenaviren konserviert. Mutationsanalysen ergaben, dass Bereiche innerhalb der N- und der C-terminalen Domäne kritisch für die Trimerisierung des Nukleoproteins sind. Darüber hinaus wurde gezeigt, dass die Oligomerisierung des Nukleoproteins eine Grundvorraussetzung für seine Funktion bei der Replikation und Transkription des viralen Genoms ist. Im Gegensatz dazu spielt sie bei der Interaktion des Nukleoproteins mit dem Matrixprotein und für die Fähigkeit des Nukleoproteins zur Inhibition der Typ I Interferon-Antwort keine Rolle. Vermutlich wird das Nukleoprotein der Arenaviren durch Wirtszell-spezifische Proteasen verkürzt. Die dabei entstehenden, großen Spaltfragmente liegen als Monomere vor und könnten in der infizierten Zelle die Funktion als Interferon-Antagonist übernehmen, während ungespaltenes Nukleoprotein für die Replikation, Transkription und Enkapsidierung des viralen Genoms verwendet wird. Das Nukleoprotein sorgt durch seine Interaktion mit dem Matrixprotein für den Einbau des viralen Genoms in neu entstehende Virionen. In dieser Arbeit wurden die dafür verantwortlichen Aminosäurebereiche auf kurze Bereiche innerhalb der C-terminalen Proteindomäne des Nukleoproteins eingegrenzt. Anhand dieser Untersuchungen wurde ein Modell für die Interaktion zwischen dem Nukleoprotein und dem Matrixprotein an der Virusmembran aufgestellt. Vergleichende Studien zwischen den Nukleoproteinen und Matrixproteinen verschiedener Arenaviren ergaben zudem, dass heterotypische Interaktionen nur zwischen dem Nukleoprotein und dem Matrixprotein nahe verwandeter Arenaviren möglich sind. Die Interaktion zwischen dem Nukleoprotein und dem Matrixprotein wurde somit als Faktor identifiziert, der die die Bildung von Arenavirus-Reassortanten stark einschränkt. Insgesamt konnte in dieser Arbeit der Zusammenhang zwischen der Homo-Oligomerisierung und den biologischen Funktionen des Nukleoproteins aufgezeigt werden. Darüber hinaus wurden funktionelle Domänen für die NP-NP-Interaktion und die Interaktion zwischen dem Nukleoprotein und dem Matrixprotein innerhalb des Nukleoproteins identifiziert.

Phylogenetically higher termites emit higher amounts of methane than lower termites, but the reason for this phenomenon has not been clear. Our comparative study based on 16S rRNA gene sequencing and qPCR analysis of archaeal communities in the guts of higher termites revealed that unlike the lower termites, which host mainly members of Methanobacteriales in their guts, higher termites host a diverse assemblage of methanogenic euryarchaeota comprising representatives of four major orders: Methanobacteriales, Methanosarcinales, Methanomicrobiales and the recently discovered Methanoplasmatales. 16S rRNA-based diversity of archaea was highest in soil-feeding taxa, where nearly all major archaeal groups were represented. Besides the euryarchaeotal lineages, the gut contained also lineages closely related to ammonia-oxidizing Thaumarchaeota and a deep-branching termite specific group of uncultured archaea loosely affiliated to Crenarchaeota. Archaeal diversity in the fungus-cultivating Macrotermes species, in the grass-feeding Trinervitermes sp., and in the wood-feeding Microcerotermes sp., which show low methane emission rates, was much lower. These results show the high methane emission rates in higher termites is reflected in the high diversity, density and complex community structure of archaea in the termite hindguts. Higher termites host gut-specific archaeal communities different from those of lower termites and from other environments and these communities seem to co-evolve with the host termite probably with shift in feeding behavior. Higher termites harbor archaeal lineages which are specific to their gut environment and are different from communities from lower termites and from other environments. Methanogenic archaea are heterogeneously distributed in the highly compartmented gut. Density and diversity of archaea was highest in posterior gut compartments, which also harbored most of the methanogenic activities. The highly alkaline anterior gut compartments were preferentially colonized by Methanosarcinales. Archaeal community structure differed strongly among gut compartments, with communities in the more methanogenic posterior gut sections being distinct from those of the anterior sections, a phenomenon that is reflected in the different micro-environmental conditions in the compartments. Experimental stimulation of methanogenesis in isolated gut sections of soil-feeding termites revealed significant activities of hydrogenotrophic methanogens that are obligately dependent on methanol and formate. Our results suggest that community structure in the different microhabitats is shaped by exogenous factors, such as pH, oxygen status and the availability of methanogenic substrates. The recently discovered Methanoplasmatales are the seventh order of methanogenic euryarchaeota comprising methylotrophic lineages which colonizes higher termite guts and various other environments, and helps to explain the high methane emission rates in higher termites. The methylotrophic nature of termite-derived lineage demonstrates that substrates other than hydrogen drive methanogenesis in higher termites.

Feuchtgebiete stellen wichtige Quellen und Senken von klimawirksamen Treibhausgasen wie Kohlendioxid (CO2) und Methan (CH4) dar. Rhizodeposition von Pflanzen ist eine wichtige Kohlenstoff- und Nährstoffquelle für die im Boden lebenden Mikroorganismen und fördert den anaeroben Abbau von organischem Material durch hydrolytische, fermentative und methanogene Gemeinschaften. Bisher ist jedoch wenig über die biotischen und abiotischen Faktoren bekannt, die die Kohlenstoffumsetzung in der Rhizosphäre von Hydrophyten beeinflussen. Diese Arbeit befasst sich mit den Kohlenstoffflüssen im komplexen System Boden-Pflanze und den zugrundeliegenden biogeochemischen Prozessen um den Einfluss der mikrobiellen Vielfalt auf die Funktionen des Ökosystems zu erforschen. Das Mikrobiom der Reiswurzel wurde in gefluteten Mikrokosmen basierend auf einem Sand-Vermikulit-Gemisch durch Zugabe von sieben ausgewählten Böden aus verschiedenen Ökosystemen gezielt manipuliert. Mit Hilfe von 13C-Pulsmarkierung und molekularen Analysen wurde der Kohlenstofffluss zwischen Atmosphäre, Pflanze und Boden und die mikrobiellen Gemeinschaften in der Rhizosphäre untersucht. Die Translokation von Kohlenstoff (C) und die Emission von Methan wurden zu verschiedenen Wachstumsstadien der Reispflanze in italienischem Reisfeldboden mit reduziertem und sterilem Boden untersucht und die Bedeutung der Bodentypen auf die Biomasseproduktion und den Kohlenstoffzyklus bewertet. Die 13C-Pulsmarkierung von Reismikrokosmen ermöglichte es ausschließlich den aus der Pflanze stammenden Kohlenstoff zu markieren und dessen Dynamik im geschlossenen System zu studieren. Insgesamt verblieb unabhängig vom Bodentyp der überwiegende Teil des assimilierten Kohlenstoffs in oberirdischen Pflanzenorganen, etwa 10% wurden in die Wurzel eingebaut und weniger als 2% fanden sich im Boden wieder. Allerdings war in sterilem Boden die Verlagerung des assimilierten 13C unter die Bodenoberfläche deutlich geringer. Die Anreicherung an 13C in den verschiedenen Kohlenstoffpools wurde durch den Bodengehalt und das Wachstumsstadium der Pflanze bestimmt. Die Ergebnisse zeigen, dass wurzelbürtiger Kohlenstoff eine bedeutende Methanquelle darstellt, welche je nach Bodentyp bis zu 7% des in fünf Tagen emittierten Methans ausmachen kann. Zudem wurde die Biomasseproduktion der Reispflanzen durch den Bodentyp beeinflusst und korrelierte mit der Methanemission aus italienischem Reisfeldboden. Die Abundanz der Archaea veränderte sich mit fortschreitendem Entwicklungsstadium der Pflanze und stand im direkten Zusammenhang mit der Methanemission aus frischen Photosyntheseprodukten. Diese Ergebnisse weisen darauf hin, dass Wurzelausscheidungen und das zahlenmäßige Vorkommen von Mikroorganismen in der Rhizosphäre kritische Faktoren für die Methanemission insbesondere während der späten vegetativen und der reproduktiven Wachstumsphase der Pflanze sind. Die sieben Böden aus fünf verschiedenen Ökosystemen unterschieden sich nicht nur in ihren allgemeinen Bodeneigenschaften, sondern auch in ihrer archaeellen (16S rRNA) und methanogenen (mcrA) Gemeinschaft mit unterschiedlich stark ausgeprägten potentiellen Methanproduktionsraten. Multivariate Analysen zeigten, dass sich die archaeellen und methanogenen Populationsmuster in der Rhizosphäre veränderten, wenn die Böden zum Animpfen von Reismikrokosmen eingesetzt wurden. Das Mikrobiom der Wurzeln war durch eine diverse mikrobielle Gemeinschaft gekennzeichnet, wobei bestimmte archaeelle und methanogene Gruppen charakteristisch für die Rhizosphäre der Reispflanzen waren. Da diese Mikroorganismen nicht in den ursprünglichen Böden detektierbar waren, könnten sie entscheidend für die unterschiedlichen Methanemissionsraten aus wurzelbürtigem Kohlenstoff sein. Eine Kanonische Korrespondenzanalyse ergab, dass die Unterschiede in der methanogenen Rhizosphärengemeinschaft hauptsächlich auf den Kohlenstoff- und Nährstoffgehalt der verschiedenen Böden sowie die Pflanzenbiomasse zurückzuführen waren. Die Ergebnisse deuten darauf hin, dass sowohl die Pflanze als auch der Bodentyp die Zusammensetzung des Mikrobioms der Reiswurzel und die Methanemission aus Photosyntheseprodukten steuern. Zusammenfassend zeigte die Arbeit, dass sowohl das Wachstumsstadium der Pflanze, als auch der Bodengehalt und der Bodentyp die Verteilung von frisch assimiliertem Kohlenstoff in überschwemmten Reispflanzen, die Kohlenstofftranslokation in die Rhizosphäre und die Gasemission in die Atmosphäre entscheidend prägten. Die im Boden lebenden Mikroorganismen als treibende Kraft der globalen Stoffkreisläufe beeinflussen nachhaltig den Kohlenstofffluss in Feuchtgebieten und die Produktion der klimarelevanten Spurengase CO2 und CH4., Wetlands are important sources and sinks of effective greenhouse gases including carbon dioxide (CO2) and methane (CH4). Rhizodeposition by plants plays an essential role in carbon and nutrient supply for the soil microbiota and stimulates anaerobic decomposition of organic material by hydrolytic, fermenting and methanogenic microorganisms. However, little is known about the biotic and abiotic factors influencing the carbon turnover in the rhizosphere of wetland plants. This thesis focuses on the biogeochemical processes involved in carbon cycling of complex plant-soil systems to link microbial community structure to ecosystem functioning. Flooded rice microcosms were generated based on sand-vermiculite inoculated with seven soils from different ecosystems to manipulate the root microbiome. Using 13C pulse-labeling and molecular analyses, the carbon translocation from the atmosphere through the plant into the soil and back to the atmosphere as well as the microbial communities were studied in order to explore the impact of rice growth stages on C translocation and CH4 emission in Italian paddy soil in comparison to reduced soil content and sterile soil, and to evaluate the effect of the seven soils on plant biomass production and carbon cycling. The application of isotopic pulse-labeling allowed tracing the carbon that exclusively derived from recent plant photosynthates. Overall, the majority of freshly assimilated C remained in aboveground plant biomass, about 10% was allocated into the roots and less than 2% was recovered in soil organic matter independently from the soil type; however, sterile soil strongly inhibited belowground 13C translocation. The 13C enrichment in the different C pools was affected by the soil content and the plant growth stage and revealed that recently plant-assimilated carbon was an important source for methanogenesis accounting for up to 7% of the total CH4 emitted within five days depending on soil type. Rice biomass production was affected by the soil type and was positively correlated with CH4 emission in Italian paddy soil. The abundance of archaeal communities changed in response to plant developmental growth stage and was correlated with the amount of emitted 13CH4 that was exclusively derived from fresh photosynthates. These findings indicate that rhizodeposition and microbial abundances in the rhizosphere were critical for the emission of methane especially during the late vegetative and reproductive stages of rice plants. The seven soils covering five different ecosystem types not only differed in the main soil characteristics, but also contained distinct archaeal (16S rRNA) and methanogenic (mcrA) populations and exhibited different CH4 production potentials. Multivariate analyses demonstrated that the archaeal and methanogenic fingerprints were also distinct in the rice rhizosphere when soils were used for generating rice-planted microcosms. The root microbiome was characterized by a highly diverse community where characteristic archaeal and methanogenic groups were detected in the rice rhizosphere. These microorganisms were not detected in the original soils and thus could be critical for the different rates of emitted 13CH4 observed. Canonical correspondence analysis indicated that the differences in methanogenic communities colonizing the rice rhizosphere were mainly attributed to the carbon and nutrient content of the inoculated soils and to the plant biomass. These results suggest that plant and soil factors cooperatively shape the root microbiome and affect methane emission from fresh photosynthates. Collectively, the study revealed that allocation of freshly assimilated carbon in submerged rice plants, C translocation into the rhizosphere and gas emission to the atmosphere were affected by both the plant growth stage, and also by the amount and type of soil in which the rice plants grew. The soil-inhabiting microorganisms as principle drivers of global nutrient cycles have an important impact on carbon translocation between hydrophytic plants and wetland soils and influence the emission of the climate-relevant trace gases CO2 and CH4.