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Tetrahydrofolate (THF) derivatives, collectively termed folates or vitamin B9, are involved in almost all the metabolic processes that require the addition or removal of one-carbon units (C1 metabolism). C1-substituted folate coenzymes are thus involved in several major cellular processes, including the synthesis of nucleotides (purines and thymidylate) and amino acids (methionine, serine, glycine). Methionine serves as a methyl group donor through conversion to S-adenosylmethionine, the key biological methylating agent involved in dozens methyltransferase reactions. Plants, fungi and most micro-organisms are able to synthesize THF de novo whereas humans and animals in general lack this capacity and thus rely on dietary intake of vitamin B9. During plant development, the enzymatic capacity for THF synthesis, the pool of folates, and the demands for C1-units vary importantly. However, little is known about how folate homeostasis is controlled to match the supply of C1-units, and how C1-units are accurately distributed between the different anabolic routes. In this work, we identified different regulatory mechanisms that allow plants to respond to a limitation of the folate pool. First, we analyzed the genome-wide and metabolic response of Arabidopsis cells to folate depletion induced by the antifolate methotrexate. Surprisingly, no significant change in the expression of genes involved in cofactor synthesis, degradation or trafficking was observed. One major response to folate limitation concerned the composition of the cofactor pool. Thus, the transcriptional regulation of a limited number of genes coding enzymes manipulating C1-moieties in plastids was associated with a re-orientation of C1-units towards the synthesis of purines and thymidylate. These data suggest that the metabolic priority of Arabidopsis cells in response to folate limitation is to shuttle the available folate derivatives to the synthesis of nucleotides at the expense of methylation reactions. Second, because the efficiency of methylation reactions are likely affected by folate depletion, we investigated the relationships between the folate status, the methyl cycle activity, and the rate of chlorophyll synthesis, which relies at one step on a methylation reaction catalyzed by Mg protoporphyrin IX methyltransferase. Etiolated pea leaves treated with methotrexate displayed a reduced folate pool and a marked decrease in the methyl index. This resulted in a metabolic regulation (inhibition) of the Mg-protoporphyrin IX methyltransferase activity and to a decreased rate of chlorophyll synthesis. These results point out that an even moderate change in the folate status may affect essential physiological processes such as chloroplast biogenesis. Last, the analysis of Arabidopsis cells exposed to a long-term folate starvation revealed an original post-translational regulation of methionine synthesis. This process consists in the proteolytic cleavage of the N-terminal domain of cystathionine -synthase, the first specific enzyme for methionine synthesis. We suggest that an effector, to date unidentified, can modulate enzyme activity in vivo through an interaction with the N-terminal domain and that removal of this domain in folate-deficient cells can suppress this regulation.; Les dérivés du tétrahydrofolate (THF), plus connus sous le nom de folate(s) ou vitamine B9, sont des cofacteurs indispensables au métabolisme cellulaire puisqu'ils sont à la base des réactions de transfert d'unités monocarbonées, regroupées sous le terme de "métabolisme C1". Chez tous les organismes, ces réactions sont impliquées dans des processus cellulaires clés comme la synthèse des nucléotides (purines, thymidylate), la synthèse de certains acides aminés (sérine, glycine, méthionine) et, indirectement, dans la synthèse de S-adénosylméthionine. Cette dernière constitue le donneur universel de groupements méthyles et intervient donc dans l'ensemble des réactions de méthylation. Les plantes, les champignons et certains micro-organismes possèdent la capacité de réaliser la synthèse de novo de THF alors que les animaux en sont incapables et sont contraints de puiser cette vitamine dans leur alimentation. Lors du développement de la plante, la capacité de synthèse du THF, le pool global et la nature des folates ainsi que la demande en unités C1 varient de façon importante. Pourtant, la littérature reste succincte en ce qui concerne les mécanismes qui permettent de contrôler l'homéostasie en folates en fonction des besoins fluctuants en unités C1 de la plante et sur la manière dont sont distribuées ces unités entre les différentes voies utilisatrices. Le travail réalisé dans le cadre de cette thèse a permis de mettre en évidence différents niveaux de régulation du métabolisme C1 permettant à la plante de répondre à une diminution du pool de folates. Ainsi, l'étude transcriptomique de la réponse de cellules d'Arabidopsis à un traitement par un antifolate, le méthotrexate, a révélé une absence de processus de compensation de la baisse de la quantité de folates puisque les gènes impliqués dans la synthèse, le transport et la dégradation du THF ne présentent pas de modification de leur expression. La régulation transcriptionnelle mise en place suite à une limitation en folates concerne un nombre restreint de gènes qui vont influencer la composition en dérivés du THF et non l'abondance de ce cofacteur vitaminique. En effet, alors qu'en situation physiologique le flux d'unités C1 alimente majoritairement les réactions de méthylation, il se trouve que le déficit en folates provoque une réorientation de ce flux vers la synthèse des nucléotides. La diminution des méthylations cellulaires en situation de déficit en folates a été illustrée lors de l'étude d'une méthyltransférase particulière qui intervient dans la synthèse des chlorophylles, la Mg-protoporphyrine IX méthyltransférase. Des feuilles de pois déficientes en folates présentent une forte diminution de l'index de méthylation qui se traduit par une régulation métabolique de l'activité de la Mg-protoporphyrine IX méthyltransférase, conduisant ainsi à une baisse de la synthèse des chlorophylles. Cette étude démontre que le statut en folates influence, via les réactions de méthylations, des processus physiologiques essentiels comme la biogenèse de l'appareil photosynthétique. Ce travail de thèse a également mis en évidence un mécanisme de régulation post-traductionnelle de la synthèse de méthionine en situation de carence en folates. Ce mécanisme consiste en un clivage protéolytique de l'extrémité N-terminale de la première enzyme dédiée à la synthèse de méthionine, la cystathionine γ-synthase. L'élimination de ce domaine régulateur de l'enzyme permet, par un mécanisme encore inconnu, d'accroître la biosynthèse de méthionine en situation de déficit en folates.

In all organisms, control of folate homeostasis is of vital importance to sustain the demand for one carbon (C1) units that are essential in major metabolic pathways. In this study we induced folate deficiency in Arabidopsis cells by using two antifolate inhibitors. This treatment triggered a rapid and important decrease in the pool of folates with significant modification in the distribution of C1-substituted folate coenzymes, suggesting an adaptive response to favor a preferential shuttling of the flux of C1-units to the synthesis of nucleotides over the synthesis of methionine (Met). Metabolic profiling of folate-deficient cells indicated important perturbation of the activated methyl cycle because of the impairment of Met synthases that are deprived of their substrate 5-methyl-tetrahydrofolate. Intriguingly, S-adenosylmethionine (AdoMet) and Met pools declined during the initial period of folate starvation but were further restored to typical levels. Re-establishment of Met and AdoMet homeostasis was concomitant with a previously unknown post-translational regulation that consists in the removal of 92 amino acids at the N-terminus of cystathionine gamma-synthase (CGS), the first specific enzyme for Met synthesis. Rescue experiments and analysis of different stresses indicated that CGS processing is specifically associated with perturbation of the folates pool. Also, CGS processing involves chloroplastic serine-type proteases that are expressed in various plant species subjected to folate starvation. We suggest that a metabolic effector, to date unidentified, can modulate CGS activity in vivo through an interaction with the N-terminal domain of the enzyme and that removal of this domain can suppress this regulation.