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Nuclear-lipid droplets (nLD)—a dynamic cellular organelle that stores neutral lipids, within the nucleus of eukaryotic cells—consists of a hydrophobic triacylglycerol –cholesterol-ester core enriched in oleic acid (OA) surrounded by a monolayer of polar lipids, cholesterol, and proteins. nLD are probably involved in nuclear-lipid homeostasis serving as an endonuclear buffer that provides or incorporates lipids and proteins participating in signaling pathways, as transcription factors and enzymes of lipid metabolism and nuclear processes. In the present work, we analyzed the nLD proteome and hypothesized that nLD-monolayer proteins could be involved in processes similar as the ones occurring in the cLD including lipid metabolism and other cellular functions. We evaluated the rat-liver–nLD proteome under physiological and nonpathological conditions by GeLC-MS2. Since isolated nLD are highly diluted, a protein-concentrating isolation protocol was designed. Thirty-five proteins were identified within the functional categories: cytoskeleton and structural, transcription and translation, histones, protein-folding and posttranslational modification, cellular proliferation and/or cancer, lipid metabolism, and transport. Purified nLD contained an enzyme from the lipid-metabolism pathway, carboxylesterase 1d (Ces1d/ Ces3). Nuclear Carboxylesterase localization was confirmed by Western blotting. By in-silico analyses rat Ces1d/ Ces3 secondary and tertiary structure predicted would be equivalent to human CES1. These results—the first nLD proteome—demonstrate that a tandem-GeLC-MS2-analysis protocol facilitates studies like these on rat-liver nuclei. A diversity of cellular-protein function was identified indicating the direct or indirect nLD participation and involving Ces1d/Ces3 in the LD-population homeostasis., Instituto de Investigaciones Bioquímicas de La Plata, Facultad de Ciencias Exactas

Los lípidos en el núcleo, al igual que en el resto de la célula, son moléculas muy versátiles que poseen un activo metabolismo e importantes funciones biológicas que abarcan roles estructurales, energéticos, y en la regulación celular, en procesos de señalización actuando como segundos mensajeros. Los lípidos nucleares se encuentran en dos localizaciones muy contrastantes, la envoltura nuclear, más fluida que el interior nuclear y compuesta de glicerofosfolípidos (GPL), esfingolípidos (SL) y colesterol (C); y dentro del núcleo, en las Gotas Lipídicas Nucleares (nLD), donde se encuentran concentrados todos los triacilglicéridos (TAG) y éster de colesterol (CE) nucleares, organizados en un core hidrofóbico rodeado de una monocapa de lípidos polares (LP), C y proteínas asociadas. El objetivo de este trabajo fue dilucidar el metabolismo y las funciones biológicas de los lípidos nucleares. Determinar la proteómica y la topología de los dominios lipídicos nucleares. Se utilizó como modelo experimental el cultivo primario de hepatocitos de rata y las células HepG2, y se evaluó a las nLD en forma comparativa con las Gotas Lipídicas Citosólicas (cLD) en una misma célula. Se aislaron nLD y cLD por sedimentación en gradiente de sacarosa. Se cuantificaron parámetros morfológicos de nLD y cLD a partir de imágenes de microscopía de fluorescencia mediante el software Image-Pro plus. Se utilizó como estímulo externo del metabolismo lipídico y de las LD, al ácido oleico (AO) en distintos protocolos experimentales. La composición lipídica se determinó mediante análisis bioquímicos tradicionales. Se diseñó una importante herramienta metodológica para abordar el estudio de proteómica de las nLD mediante la técnica de GeLC-MS. La muestra de nLD debió ser previamente concetrada y fue necesario eliminar los interferentes presentes, ya que las nLD constituyen una muestra compleja con baja cantidad de proteínas, y están formadas por lípidos neutros, que son moléculas hidrofóbicas que dificultan su análisis. Algunas de las proteínas identificadas en el subproteoma de las nLD ya habían sido descriptas en asociación a las cLD, y otras fueron descriptas por primera vez en el núcleo celular. Dentro de las proteínas descriptas, algunas poseen funciones estructurales, enzimáticas, otras constituyen factores de transcripción y marcadores de cáncer. Se identificaron dos proteínas asociadas al metabolismo lipídico, Ces1d (Carboxilesterasa 1d) y ECHP (peroxisomal bifunctional enzyme), involucradas en los procesos de lipólisis y de β-oxidación lipídica, respectivamente, que no habían sido descriptas hasta el momento en el núcleo celular. Teniendo en cuenta que Ces1d aun no ha sido cristalizada, se realizó un estudio in silico, y se predijo su estructura 3-D utilizando como molde su ortólogo humano CES1. El 95% de los residuos de Ces1d fueron modelados con más de un 90% de confianza. Mediante el alineamiento de secuencias, fue posible predecir además, la posición de potenciales sitios de interés asociados a la función, localización y estructura de Ces1d. En este trabajo se demostró que las nLD constituyen un dominio nuclear dinámico cuyas características morfológicas y composición responden en forma reversible a estímulos externos, como el ácido oleico. Estos resultados implican que las nLD estarían participando activamente en procesos que se desarrollan dentro del núcleo. En particular, se demostró que las células frente al estímulo externo de AO responden activando las rutas anabólicas que determinan un aumento en el número y tamaño de las LD en las poblaciones de cLD y nLD, a través de mecanismos de incorporación de lípidos neutros sintetizados de novo y de fusión de gotas existentes de menor tamaño. El fenotipo anabólico desencadenado por el AO se revierte al eliminar el estímulo del medio y se activan entonces, los procesos catabólicos de la célula que involucran un mecanismo de fisión de gotas grandes en gotas de menor tamaño. Estos procesos catabólicos incluirían la lipólisis y posterior oxidación de los lípidos neutros (LN) de las LD que disminuirían de tamaño por reducción de sus componentes y se iniciarían con la translocación de la Ces1d desde el citosol y la matriz nuclear hacia las cLD y nLD, respectivamente. La Ces1d presente en las nLD y las cLD, posee un activo rol en este proceso, hidrolizando TAG y CE. Los ácidos grasos (FA) liberados de la hidrólisis de los lípidos de las nLD por acción de la Ces1d, se unirían a la L-FABP (liver fatty acid binding protein) en la matriz nuclear, y translocarían a sitios de β-oxidación nuclear y/o citosólicos, y finalmente serían oxidados. Así mismo, los FA liberados en la matriz nuclear podrían unirse como ligandos, a factores de transcripción nucleares y participar en la regulación de estos mismos procesos. Las nLD no serían estructuras inmóviles nucleares sino que podrían desplazarse utilizando actina y miosina, actuando así como un sistema de delivery y de recepción de lípidos y de proteínas dentro del núcleo. A partir de los resultados de este trabajo, las nLD deben ser consideradas como un importante dominio nuclear a tener en cuenta, ya que seguramente están participando en muchos de los eventos que se desarrollan en el núcleo, además de los directamente relacionados con la homeostasis lipídica, tanto en condiciones normales como patológicas., Facultad de Ciencias Exactas

Neutral lipids - involved in many cellular processes - are stored as lipid droplets (LD), those mainly cytosolic (cLD) along with a small nuclear population (nLD). nLD could be involved in nuclear-lipid homeostasis serving as an endonuclear buffering system that would provide or incorporate lipids and proteins involved in signalling pathways as transcription factors and as enzymes of lipid metabolism and nuclear processes. Our aim was to determine if nLD constituted a dynamic domain. Oleic-acid (OA) added to rat hepatocytes or HepG2 cells in culture produced cellular-phenotypic LD modifications: increases in TAG, CE, C, and PL content and in cLD and nLD numbers and sizes. LD increments were reversed on exclusion of OA and were prevented by inhibition of acyl-CoA synthetase (with Triacsin C) and thus lipid biosynthesis. Under all conditions, nLD corresponded to a small population (2-10%) of total cellular LD. The anabolism triggered by OA, involving morphologic and size changes within the cLD and nLD populations, was reversed by a net balance of catabolism, upon eliminating OA. These catabolic processes included lipolysis and the mobilization of hydrolyzed FA from the LD to cytosolic-oxidation sites. These results would imply that nLD are actively involved in nuclear processes that include lipids. In conclusion, nLD are a dynamic nuclear domain since they are modified by OA through a reversible mechanism in combination with cLD; this process involves acyl-CoA-synthetase activity; ongoing TAG, CE, and PL biosynthesis. Thus, liver nLD and cLD are both dynamic cellular organelles., Instituto de Investigaciones Bioquímicas de La Plata, Facultad de Ciencias Médicas, Facultad de Ciencias Exactas