Submitted by Alison Souza (alisonsouza@ufgd.edu.br) on 2019-03-28T21:43:40Z No. of bitstreams: 1 CleideAdrianeSignorTirloni.pdf: 6603867 bytes, checksum: 633df5bb39c9e666378db07f5f0c79b7 (MD5) Made available in DSpace on 2019-03-28T21:43:40Z (GMT). No. of bitstreams: 1 CleideAdrianeSignorTirloni.pdf: 6603867 bytes, checksum: 633df5bb39c9e666378db07f5f0c79b7 (MD5) Previous issue date: 2018-05-11 As doenças cardiovasculares estão entre as principais causas de mortes no mundo e as plantas medicinais podem ser alternativas viáveis para o desenvolvimento de novos medicamentos para o controle destas doenças. O objetivo deste trabalho foi investigar as espécies medicinais Acanthospermum hispidum, Luehea divaricata e Talisia esculenta, utilizadas popularmente na região do Pantanal sul-mato-grossense, para o tratamento de doenças que afetam o sistema cardiovascular e renal. Primeiramente realizamos uma avaliação morfológica e histoquímica para identificar adequadamente as três espécies em estudo. Após devidamente identificadas, foram coletadas as partes aéreas da A. hispidum e as folhas da L. divaricata e T. esculenta. Infusões (100 g/1000 mL água filtrada) foram preparadas com as três espécies, os infusos foram filtrados e tratados com etanol, o sobrenadante etanólico (ES) foi utilizado. Os extratos purificados da A. hispidum (ESAH), L. divaricata (ESLD) e T. esculenta (ESTE) foram analisados fitoquímicamente. Todos os extratos apresentaram compostos fenólicos. Estudos de toxicidade foram conduzidos com ratos da linhagem Wistar (machos e fêmeas). Diferentes grupos de animais receberam 5, 50, 300 e 2000 mg/kg (dose única, v.o.) dos extratos ou água filtrada (5 mL/100g). No 15° dia o experimento foi encerrado e amostras de sangue e tecidos foram obtidas para análises bioquímicas e histológicas. Nenhum extrato promoveu sinais de toxicidade, então estudos farmacológicos foram conduzidos. Primeiramente verificamos os possíveis efeitos diuréticos em diferentes grupos de ratos após tratamento com diferentes doses dos três extratos (30, 100 e 300 mg/kg, v.o.). Após 1, 2, 4, 6, 8 e 24 horas (tratamento agudo) ou diariamente por sete dias (tratamento prolongado) o volume urinário foi determinado. Adicionalmente, nas amostras de urina resultante, o sódio, o potássio, o cloreto, o pH e a densidade foram mensurados. Baseado nos resultados da diurese aguda, somente o ESLD foi avaliado por sete dias. Em um segundo momento, analisamos os efeitos dos três extratos sobre a pressão arterial siastólica (PAS), pressão arterial diastólica (PAD), pressão arterial média (PAM) e taxa cardíaca (batimentos por minuto- BPM) em ratos normotensos. Para isto, os animais foram anestesiados com cetamina/xilasina (100/20 mg/kg, i.m.) e um cateter de polietileno foi introduzido na artéria carotídea direita. Em seguida, realizamos a medida da pressão arterial (PA). Os extratos, nas mesmas doses da diurese, foram administrados diretamente no duodeno dos animais. Hidroclorotiazida (HCTZ 25 mg/kg) e água filtrada (5 mL/kg) foram utilizados como controle. O ESAH não apresentou atividade diurética, entretanto apresentou atividade hipotensora (reduziu a PAS e a PAM na dose de 30 mg/kg). A partir destes dados, investigamos o papel do óxido nítrico (ON), das prostaciclinas (PGI2) e o envolvimento dos canais de potássio (K + ) nesta atividade. Diferentes grupos de ratos foram infundidos continuamente pela veia femoral com L-NAME (7 mg/kg/min., inibidor não seletivo da óxido nítrico sintase), indometacina (3 mg/kg/min., inibidor não seletivo das cicloxigenases), azul de metileno (150 nmol/kg/min., inibidor da glanilato ciclase) ou TEA (400 µmol/kg/min., inibidor não seletivo dos canais de K + sensíveis ao Ca + ). Em seguida, administrou-se o ESAH (30 mg/kg, i.d.). Constatamos que a via do ON estava envolvida na atividade hipotensora do ESAH, como também os canais de K + sensíveis ao Ca + . O ESLD apresentou atividade diurética, salurética e hipotensora nos tratamentos agudos e as duas primeiras atividades se mantiveram por sete dias. A partir destes resultados realizamos o fracionamento deste extrato com solventes de diferentes polaridades. O ESLD (15 g.) foi solubilizado em água (500 mL) e fracionado sequencialmente com clorofórmio, butanol e acetato de etila gerando as frações ChloroFr, ButFr e AceFr, respectivamente. O resíduo aquoso gerou a fração aquosa (AqueFr). Estas frações foram avaliadas quanto aos efeitos diuréticos e hipotensores agudos. As frações AceFr (6 mg/kg), AqueFr (128 mg/kg) e ButFr (65 mg/kg) apresentaram atividade diurética após 24 horas, as duas últimas frações foram também hipotensoras, sendo que a ButFr apresentou também atividade salurética. Então, investigamos o envolvimento do ON e das PGI2 na atividade diurética da ButFr. Diferentes grupos de animais receberam, uma hora antes, L-NAME (60 mg/kg, v.o.) e indometacina (5 mg/kg, v.o). Em seguida, foram tratados com ButFr (65 mg/kg, v.o.). O volume urinário foi mensurado após 8 e 24 horas. As duas vias estavam envolvidas com a atividade diurética desta fração. Avaliamos também se o efeito diurético, salurético e hipotensor da ButFr (65 mg/kg, v.o) se manteriam após tratamento prolongado (diariamente por sete dias), o que também se confirmou. Apoiados nestes dados, analisamos esta fração em órgãos isolados. Para isto, ratos foram anestesiados e seus leitos mesentéricos e seus rins foram retirados e perfundidos com solução adequada, em seguida a PA destes órgãos foi analisada. Após a estabilização da PA, os órgãos receberam diferentes concentrações da ButFr. As concentrações mais efetivas da ButFr (0,01; 0,03 e 0,1 mg) foram analisadas quanto ao envolvimento do ON e das PGI2 nas atividades diuréticas e hipotensoras apresentadas. Retiramos novos órgãos e perfundimos com os inibidores L-NAME (100 µmol) e indometacina (1 µmol), em seguida administramos as diferentes concentrações da ButFr. Observamos que as duas vias estavam envolvidas. E por fim, como a AqueFr (128 mg/kg) apresentou uma atividade hipotensora nos estudos anteriores, traçamos um perfil fitoquímico da mesma e identificamos a isovitexina como seu principal metabólito. Analisamos o efeito da AqueFr e a isovitexina em leitos mesentéricos isolados de ratos e os mecanismos envolvidos na hipotensão. Pesquisamos o envolvimento do ON, PGI2 e dos canais de K + (sensíveis ao Ca + , à voltagem e ao ATP). Leitos mesentéricos foram isolados, perfundidos com os inibidores L-NAME (100 µmol), indometacina (1 µmol), KCl (40 mM), TEA (1 mM), 4-aminopiridina (10 µmol- inibidor dos canais de K + sensíveis à voltagem) e glibenclamida (10 µmol- inibidor seletivo dos canais de K + sensíveis ao ATP- Kir6.1) e administramos diferentes concentrações da AqueFr (0,01- 0,1 mg) e da isovitexina (100- 1000 nmol). Ambos os tratamentos apresentaram atividade hipotensora pela via do ON e por estimular os canais de K + sensíveis ao Ca + e ao ATP. E finalmente, o ESTE não apresentou atividade diurética significativa e nem atividade hipotensora. Avaliamos se ESTE apresentava atividade antioxidante in vitro através de sua capacidade de eliminar os radicais livres DPPH e de impedir a hemólise oxidativa ocasionada em eritrócitos humanos pelo 2,2-Azobis (2-amidinopropano) dihydrochloride (AAPH). Apesar de o ESTE não apresentar atividade diurética e hipotensora, demonstrou ter uma interessante atividade antioxidante. Desta forma, concluímos que a A. hispidum não foi diurética, porém apresentou atividade hipotensora, a L. divaricata apresentou atividade diurética, salurética e hipotensora e a T. esculenta não foi diurética nem hipotensora, entretanto apresentou atividade antioxidante. Os efeitos diuréticos e saluréticos da L. divaricata se mantiveram por sete dias. Suas frações AqueFr e ButFr também apresentaram atividade diurética e hipotensora, seus mecanismos de ação foram elucidados em órgãos isolados sendo que atuam pela via do ON e das PGI2, agindo em diferentes canais de K + . A L. divaricata apresentou melhores efeitos farmacológicos do que as outras duas espécies. Seus efeitos diuréticos e hipotensores corroboram o uso popular no Pantanal sul-mato-grossense podendo ser uma espécie potencial para o desenvolvimento de novos fármacos. Cardiovascular diseases are among the leading causes of death worldwide. Medicinal plants can be viable alternatives to the development of new drugs to control these diseases. The aim of this work was to investigate Acanthospermum hispidum, Luehea divaricata and Talisia esculenta, which are medicinal plants popularly used for the treatment of diseases affecting the cardiovascular and renal systems in the Pantanal region of Mato Grosso do Sul state, Brazil. First, we performed a morphological and histochemical evaluation to adequately identify the three species under study. After being properly identified, the aerial parts of A. hispidum and leaves of L. divaricata and T. esculenta were collected. By the infusion method (100 g/1000 mL filtered water) we prepared the crude extract with the aerial parts of A. hispidum and with the leaves of the L. divaricata e T. esculenta. Ethanol (PA) was used to purify the extract and the ethanolic supernatant (ES) was used for the tests. The phytochemical profile of the ESAH, ESLD e ESTE was revealed and all extracts presented phenolic compounds. Male and female Wistar rats were used for the pharmacological and acute toxicity studies. By the acute toxicity test, different groups of male and female rats received 5, 50, 300 e 2000 mg/kg (single dose, v.o.) of the three extracts or filtered water (5 mL/100g). On the 15 th day, blood and tissue samples were obtained for biochemical and histological analyzes. Extracts promoted no signs of toxicity and, therefore, pharmacological studies were conducted. First, we analyzed the diuretic effects in different groups of rats (30, 100 and 300 mg/kg, v.o.). After 4-24 hours (acute treatment) or daily for seven days (prolonged treatment) the urinary volume was determined. Furthermore, sodium, potassium, chloride, pH and density were measured in urine samples. In a second moment, we analyzed the effects of the three extracts on systolic blood pressure (SBP), diastolic blood pressure (DBP), mean arterial pressure (MAP) and heart rate (HR) in normotensive rats. For this, animals were anesthetized with ketamine/xilasin (100/20 mg/kg, i.m.). A polyethylene catheter was introduced into the right carotid artery, and blood pressure (BP) was then measured. The extracts, at the same doses of diuresis, were administered directly into the duodenum of animals. Hydrochlorothiazide (HCTZ 25 mg/kg) and filtered water (5 mL/kg) were used as controls. ESAH did not induce diuresis, however, it presented hypotensive effect (reduced SBP and MAP at the dose of 30 mg/kg). Based on these results, we analyzed the role of nitric oxide (NO), prostacyclin (PGI2) and K-channel involvement in this activity. Different groups of rats were continuously infused through the femoral vein with L-NAME (7 mg/kg/min, NO synthase inhibitor), indomethacin (3 mg/kg/min., a non-selective cyclooxygenase inhibitor), methylene blue (150 nmol/kg/min, glanilate cyclase inhibitor) or TEA (400 μmol/kg/min., a non-selective calcium-sensitive K + channel bloker (KCa)). ESAH (30 mg/kg, i.d.) was then administered. We observed that the ON pathway was involved in the ESAH hypotensive activity, as well as the Ca + sensitive K + channels. ESTE showed no significant diuretic or hypotensive activity. We then evaluated if ESTE presented in vitro antioxidant activity through its ability to eliminate free radical DPPH and to prevent oxidative hemolysis caused in human erythrocytes by AAPH. Although ESTE presented no diuretic and hypotensive activity, it has been shown to have an interesting antioxidant activity. Finally, based on the initial results where ESLD presented diuretic, saluretic and hypotensive effects, and the first two activities were maintained for seven days, we performed the fractionation of this extract with solvents with different polarities. The ESLD (15 g.) was solubilized in water (500 mL) and sequentially fractionated with chloroform, butanol and ethyl acetate resulting in fractions ChloroFr, ButFr and AceFr, respectively. The aqueous residue generated the aqueous fraction (AqueFr). These fractions were evaluated for diuretic and acute hypotensive effects. The fractions Acefr (6 mg/kg), AqueFr (128 mg/kg) and ButFr (65 mg/kg) presented diuretic activity after 24 hours. The last two fractions were also hypotensive, besides the saluretic activity presented by ButFr. From this result, we investigated the involvement of ON and PGI2 in the diuretic activity of ButFr. Different groups of animals received, one hour earlier, L-NAME (60 mg/kg, v.o.) and indomethacin (5 mg/kg, v.o). They were then treated with ButFr (65 mg/kg, v.o.). Urinary volume was measured after 8 and 24 hours. The two pathways were involved with the diuretic activity of this fraction. We also investigated whether the diuretic, saluric and hypotensive effect (ButFr (65 mg/kg)) would be maintained after prolonged treatment (daily for seven days), which was also confirmed. Based on these data, we decided to analyze this fraction in isolated organs. For this, rats were anesthetized and their mesenteric beds and kidneys were removed and perfused with adequate solution and arterial pressure was measure. After stabilization of the arterial pressure, the organs received different concentrations of ButFr. The most effective concentrations of ButFr (0.01-0.1 mg) were analyzed for ON and PGI2 involvement in the diuretic and hypotensive activities presented. We perfused new beds and kidneys with the inhibitors L-NAME (100 μmol) and indomethacin (1 μmol) and then administered different concentrations of ButFr. Two paths were involved. Finally, since AqueFr (128 mg/kg) presented a hypotensive activity in previous studies, we elucidated its phytochemical profile and identified isovitexin as its main metabolite. We investigated AqueFr and isovitexin in mesenteric beds isolated from rats and the mechanisms involved in hypotension. We verified the involvement of ON, PGI2 and K + channels (sensitive to Ca + , voltage and ATP). We isolated the beds, perfused with the inhibitors L-NAME (100 μmol), indomethacin (1 μmol), KCl (40 mM, K + ), TEA (1 mM), 4-aminopyridine (10 μmol- a voltage-dependent (KV) K + channels bloker) and glibenclamide (10 μmol- a seletive Kir6.1 ATP-sensive K + channels bloker) and administered different concentrations of AqueFr (0.01-0.1 mg) and isovitexin (100-1000 nmol). Both treatments presented hypotensive activity via NO and stimulated K + channels sensitive to Ca + and ATP. Thus, we conclude that although A. hispidum was not diuretic, it had hypotensive activity, T. esculenta was neither diuretic nor hypotensive but presented antioxidant activity and L. divaricata presented diuretic, salinetic and hypotensive activity. The diuretic and saluretic effects of L. divaricata were maintained for seven days. Its fractions (AqueFr and ButFr) presented diuretic and hypotensive activity and the mechanisms of action were elucidated in isolated organs, acting through the ON and PGI2 pathways acting on different K + -channels. L. divaricata presented better pharmacological effects than the other two species and its diuretic and hypotensive effects corroborate the popular use in Pantanal. Therefore, it can be considered a potential species for the development of new drugs.