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Chikungunya virus was detected in cases of acute chikungunya fever in renal tissue. However, chikungunya virus-related kidney injury still lacks characterization, and it is unknown whether the kidneys are reservoirs for the virus. We sought to detect histopathological changes and viral antigens in renal tissue, and to evaluate kidney injury markers in different phases of chikungunya fever.Two groups were evaluated in this exploratory study: patients with biopsy-proven kidney injury established after chikungunya fever, and patients with post-chikungunya fever chronic joint manifestations without known kidney injury, in whom we actively searched for kidney injury markers.In the first group, 15 patients had kidney injury 0.5-24 months after chikungunya fever. The most frequent histopathological diagnoses were glomerular lesions. No viral antigens were detected in renal tissue. High-risk genotypes were detected in patients with atypical hemolytic uremic syndrome and focal and segmental glomerulosclerosis. In the second group, 114 patients had post-chikungunya fever joint manifestations on average for 35.6 months. Mean creatinine and proteinuria were 0.9 mg/dl and 71.5 mg/day, respectively. One patient had isolated hematuria. There was no indication for renal biopsy in this group.Several histopathological features were found after chikungunya fever, without virus detection in renal tissue. These findings suggest that chikungunya virus may trigger kidney lesions with varying degrees of severity at different stages of infection. However, the probability that this virus replicates in the renal tissue seems unlikely.

APOL1 high-risk genotypes (HRG) are associated with increased risk of kidney disease in individuals of African ancestry. We analyzed the effects of APOL1 risk variants on an ethnically diverse Brazilian pediatric nephrotic syndrome (NS) cohort.Multicenter study including 318 NS patients, categorized as progressors to advanced CKD [estimated glomerular filtration rate (eGFR)]30 mL/min/1.73 mNineteen patients (6%) had an HRG. Of these, 47% were self-reported White. Patients with HRG manifested NS at older ages and presented higher frequencies of FSGS and SRNS. HRG patients progressed to advanced CKD more often than low-risk-genotype (LRG) children in the whole NS cohort (p = 0.001) and the three subgroups. In SRNS and biopsied patients, a single risk variant was associated with trends of higher CKD progression risk.Novel discoveries include a substantial prevalence of HRG among patients self-reported White, worse kidney outcomes in HRG versus LRG children in the FSGS subgroup, and a trend of higher CKD progression risk associated with a single risk variant in the SRNS cohort. These findings suggest APOL1-associated NS extends beyond patients self-reported non-White, the HRG effect is independent of FSGS, and a single risk variant may have a detrimental impact in children with NS.

Background Chagas disease caused by Trypanosoma cruzi (T. cruzi) affects approximately six million individuals worldwide. Clinical manifestations are expected to occur due to the parasite persistence and host immune response. Herein we investigated potential associations between IL1B, IL6, IL17A, or IL18 polymorphism profiles and cardiomyopathy or T. cruzi parasitemia, as well as the impact of HIV infection on cardiopathy. Methods Two hundred twenty-six patients and 90 control individuals were analyzed. IL1B rs1143627 T>C, IL6 rs1800795 C>G, IL17A rs2275913 G>A, IL18 rs187238 C>G, and IL18 rs1946518 C>A SNVs were analyzed by real-time PCR and T. cruzi parasitemia by PCR. Results Our data revealed association between a cytokine gene polymorphism and parasitemia never previously reported. The IL6 rs1800795 CG genotype lowered the risk of positive parasitemia (OR = 0.45, 95% CI 0.24–0.86, P = 0.015). Original findings included associations between IL17A rs2275913 AA and IL18 s1946518 AA genotypes with decreased risk of developing cardiomyopathy (OR = 0.27, 95% CI 0.07–0.97, P = 0.044; and OR = 0.35, 95% CI 0.14–0.87, P = 0.023, respectively). IL18 rs1946518 AA and IL1B rs1143627 TC were associated with reduced risk for cardiomyopathy severity, including NYHA (New York Heart Association) class ≥ 2 (OR = 0.21, 95% CI 0.06–0.68, P = 0.009; and OR = 0.48, 95% CI 0.24–0.95, P = 0.036, respectively) and LVEF (left ventricular ejection fraction)

Background/aims Autosomal dominant polycystic kidney disease (ADPKD) is characterized by progressive cyst formation and growth, leading to end-stage renal disease. A higher kidney volume is predictive of a more accelerated decline in renal function. This study aimed to examine the effects of caffeine, a phosphodiesterase inhibitor, on the progression of cystic kidney disease in a mouse model orthologous to human disease (Pkd1cond/cond:Nestincre). Methods Caffeine was administered to male cystic (CyCaf) and noncystic (NCCaf) mice (Pkd1cond/cond) from conception and at the postweaning period through 12 weeks of life (3 mg/d), while control animals consumed water (CyCtrl and NCCtrl). Renal ultrasonography was performed at 10 weeks of life to calculate total kidney volume and cystic index. At the end of the protocol, blood and urine samples were collected for biochemical analysis, and animals were euthanized. Kidneys were harvested to obtain renal tissue for determinations of adenosine 3´5´-cyclic monophosphate (cAMP) by an enzymatic immunoassay kit and phosphorylated extracellular signal-regulated kinase (p-ERK) by Western blotting. Renal fibrosis (picrosirius staining), renal cell proliferation (ki-67 immunohistochemistry) and apoptotic rates (TUNEL analysis) were also determined. Results At 12 weeks, CyCaf mice exhibited higher serum urea nitrogen, renal cystic index, total kidney volume, kidney cell proliferation, apoptosis and fibrosis compared with CyCtrl mice. Serum cystatin C was significantly higher in CyCaf than in NCCaf and NCCtrl mice. CyCaf mice had higher total kidney weight than all other groups but not higher heart and liver weight. The levels of cAMP and p-ERK did not differ among the groups. Conclusion Caffeine consumption from conception through 12 weeks led to increased cystic index and total kidney volume and worsened renal function in Pkd1-deficient cystic mice, suggesting that high consumption of caffeine may contribute to a faster progression of renal disease in ADPKD.

INTRODUÇÃO: A Doença Renal Policística Autossômica Recessiva (DRPAR) é uma causa importante de morbidade e mortalidade pediátricas, com um espectro variável de manifestações clínicas. MÉTODOS: A apresentação e evolução clínica de 25 pacientes (Pts) foram analisadas através da revisão de prontuários, aplicando-se os formulários propostos por Guay-Woodford et al. As morbidades associadas à doença foram avaliadas quanto à frequência e à idade de manifestação. RESULTADOS: A idade média de diagnóstico foi de 61,45 meses (0 a 336,5 meses), com distribuição similar entre os sexos (52% dos pts do sexo feminino). Houve histórico familiar da doença em 20% dos casos (5/25), com dois casos de consanguinidade. Na análise inicial, diagnosticou-se hipertensão arterial (HAS) em 56% dos Pts (14/25); doença renal crônica estágio > 2 (DRC > 2) em 24% (6/25); infecções do trato urinário (ITU) em 40% (10/25) e hipertensão portal (HP) em 32% dos casos (8/25). Das ultrassonografias abdominais iniciais, 80% demonstraram rins ecogênicos com cistos grosseiros e 64% detectaram fígado e vias biliares normais. Inibidores da ECA foram utilizados em 36% dos Pts, betabloqueadores em 20%, bloqueadores de canais de cálcio em 28% e diuréticos em 36% dos casos. Na análise final, após um tempo de acompanhamento médio de 152,2 meses (29,8 a 274,9 meses), HAS foi diagnosticada em 76% dos Pts, DRC > 2 em 44%, ITU em 52% e HP em 68%. CONCLUSÃO: As altas morbidade e mortalidade associadas à DRPAR justificam a construção de um banco de dados internacional, visando ao estabelecimento de um tratamento de suporte precoce. INTRODUCTION: Autosomal Recessive Polycystic Kidney Disease (ARPKD) is an important pediatric cause of morbidity and mortality, with a variable clinical spectrum. METHODS: The clinical presentation and evolution of 25 patients (Pts) were analyzed by clinical record review, according to the forms proposed by Guay-Woodford et al. Morbidities associated with the disease were evaluated with respect to their frequencies and age of onset. RESULTS: The median age at the diagnosis was 61.45 months (0 to 336.5 months), with similar gender distribution (52% of the patients were female). A family ARPKD history was found in 20% of the cases (5/25), two of them associated with consanguinity. On arrival, arterial hypertension (SAH) was diagnosed in 56% of the Pts (14/25); chronic kidney disease stage > 2 (CKD > 2) in 24% (6/25); urinary tract infection (UTI) in 40% (10/25); and portal hypertension (PH) in 32% of the cases (8/25). Eighty percent of the initial abdominal ultrasonograms detected echogenic kidneys with gross cysts and 64% demonstrated normal liver and biliary ducts. ACE inhibitors were used in 36% of the analyzed patients, beta-blockers in 20%, calcium channel blockers in 28%, and diuretics in 36% of them. In the final evaluation, after an average follow-up time of 152.2 months (29.8 to 274.9 months), SAH was detected in 76% of the cases, CKD > 2 in 44%, UTI in 52% and PH in 68%. CONCLUSION: The high morbidity and mortality associated with ARPKD justify the assembly of an international database, with the aim of establishing an early therapeutic support.

Autosomal Recessive Polycystic Kidney Disease (ARPKD) is an important pediatric cause of morbidity and mortality, with a variable clinical spectrum.The clinical presentation and evolution of 25 patients (Pts) were analyzed by clinical record review, according to the forms proposed by Guay-Woodford et al. Morbidities associated with the disease were evaluated with respect to their frequencies and age of onset.The median age at the diagnosis was 61.45 months (0 to 336.5 months), with similar gender distribution (52% of the patients were female). A family ARPKD history was found in 20% of the cases (5/25), two of them associated with consanguinity. On arrival, arterial hypertension (SAH) was diagnosed in 56% of the Pts (14/25); chronic kidney disease stage ≥ 2 (CKD ≥ 2) in 24% (6/25); urinary tract infection (UTI) in 40% (10/25); and portal hypertension (PH) in 32% of the cases (8/25). Eighty percent of the initial abdominal ultrasonograms detected echogenic kidneys with gross cysts and 64% demonstrated normal liver and biliary ducts. ACE inhibitors were used in 36% of the analyzed patients, beta-blockers in 20%, calcium channel blockers in 28%, and diuretics in 36% of them. In the final evaluation, after an average follow-up time of 152.2 months (29.8 to 274.9 months), SAH was detected in 76% of the cases, CKD ≥ 2 in 44%, UTI in 52% and PH in 68%.The high morbidity and mortality associated with ARPKD justify the assembly of an international database, with the aim of establishing an early therapeutic support.

Thin ascending limb cells from Henle's loop were studied with optical and video techniques to evaluate cell volume regulation in response to anisoosmotic media and its ionic dependence. Cell volume regulation was observed when these cells were exposed to hypoosmotic solutions. Under hyperosmotic conditions only an osmometric response was found, with no volume regulatory increase (VRI). The removal of Cl- or HCO3- abolished the volume regulatory decrease (VRD) normally observed during exposure to hypoosmotic solutions. Re-addition of these ions did not elicit the VRD response. The removal of K+ from hypoosmotic solutions abolished VRD but its re-introduction restored the volume regulatory response. In the absence of Na+, a partial inhibition of VRD was found; re-addition of Na+ completely restored the regulatory response. These indicate that cells from the thin ascending limb of Henle's loop regulate their volume under hypoosmotic conditions, and that this process is dependent upon Cl-, HCO3-, Na+ and K+, with different patterns of response being observed upon addition or deletion of these ions.

As manifestações cardíacas da doença renal policística autossômica dominante (DRPAD) incluem aumento do índice de massa do ventrículo esquerdo e cardiomiopatia dilatada idiopática. Vários estudos recentes realizados com modelos animais deficientes em Pkd1 e Pkd2, por sua vez, apoiam um papel primário da redução de função da policistina-1 (PC1) ou policistina-2 (PC2) no desenvolvimento da cardiomiopatia associada à DRPAD. Envolvimento de anormalidades de cálcio intracelular, e possivelmente de apoptose, tem sido observado nesse processo, enquanto a supressão da expressão de galectina-3 (Gal-3) resgatou o fenótipo cardíaco em camundongos deficientes em Pkd1. No presente estudo, investigamos aspectos fundamentais do mecanismo pelo qual Gal-3 exerce seu efeito deletério em corações deficientes em Pkd1, utilizando camundongos não císticos haploinsuficientes para Pkd1 (HT) e camundongos com rins intensamente císticos devido à ausência de clivagem de PC1 (VV), nas idades de 15 e/ou 25 dias. Nossos dados revelaram que a expressão de Lgals3 e de Gal-3 estão aumentadas em corações VV e HT comparadas às de seus controles selvagens (WT) [expressão de Gal-3 0,67 UA (0,24-1,27) versus 0,26 (0,20-0,39), P=0,049; e 0,77 UA (0,15-1,03) versus 0,12 (0,10-0,49), P=0,031; respectivamente]. Esses achados se acompanharam de densidades aumentadas de células que expressam Gal-3 no miocárdio ventricular de ambos os modelos de camundongo deficientes em Pkd1. Estudos de citometria de fluxo também demonstraram que cardiomiócitos ventriculares normais podem expressar Gal-3 e que a fração dessas células que expressam essa proteína é maior em animais VV e HT que em WT [5,76% (4,76-6,63) e 2,31% (2,14- 3,62) versus 1,05 % (0,94-1,56), P < 0,001 e P=0,002, respectivamente]. Interessantemente, a fração de fibroblastos que expressa Gal-3 também se mostrou aumentada em tecido cardíaco ventricular VV e HT, e nossos dados revelaram que tais células, não macrófagos, constituem a principal fonte de Gal-3 em tais corações. É importante destacar que a falta de clivagem de PC1 determinou aumento da taxa de apoptose em cardiomiócitos [9,51% (6,76- 13,55) em VV versus 3,67% (2,32-4,85) em WT, P=0,014], um fenótipo que foi resgatado por knockout de Gal-3 [2,84% (1,82-7,41) em VVG- versus 9,51% (6,76-13,55) em VV, P=0,002]. Corações VV também exibiram expressão aumentada de marcadores inflamatórios. Nossos resultados proporcionam a elucidação inicial do efeito deletério de Gal-3 sobre o coração no contexto da deficiência de Pkd1, revelando respostas celulares específicas e sugerindo que fibroblastos possam se constituir no principal mediador celular desse processo. A natureza dos modelos de camundongo empregados sugere que esse mecanismo possa também se aplicar à DRPAD humana, trazendo um novo cenário para o entendimento do fenótipo cardíaco associado a esta doença Cardiac manifestations of autosomal dominant polycystic kidney disease (ADPKD) include increased left ventricular mass index and idiopathic dilated cardiomyopathy. Several recent studies with Pkd1- and Pkd2-deficient animal models, in turn, support a primary role for decreased polycystin-1 (PC1) or -2 (PC2) function in the development of ADPKD cardiomyopathy. Intracellular calcium abnormalities, and possibly apoptosis, have been shown to be involved in this process, while suppression of galectin-3 (Gal-3) expression rescued the heart phenotype in Pkd1-deficient mice. In the current study we have investigated fundamental aspects of the mechanism through which Gal-3 exerts its deleterious effect on Pkd1-deficient hearts, using 15- and/or 25-day-old non-cystic Pkd1- haploinsufficient (HT) and severely renal cystic mice, the later lacking PC1 cleavage (VV). Our data revealed that Lgals3 and Gal-3 expression are increased in VV and HT hearts compared to their wild-type (WT) controls [Gal-3 expression: 0.67 AU (0.24-1.27) versus 0.26 (0.20-0.39), P=0.049; and 0.77 AU (0.15-1.03) versus 0.12 (0.10-0.49), P=0.031; respectively]. These findings were accompanied by increased densities of Gal-3-expressing cells in ventricular myocardium of both Pkd1-deficient mouse models. Flow cytometry results also showed that normal ventricular cardiomyocytes can express Gal-3 and that the fraction of these cells that express this protein is higher in VV and HT than in WT animals [5.76% (4.76-6.63) and 2.31% (2.14-3.62) versus 1.05% (0.94-1.56), P < 0.001 and P=0.002, respectively]. Interestingly, the fraction of fibroblasts that express Gal-3 was also increased in VV and HT heart ventricular tissue and these cells, not macrophages, were shown to constitute the main source of Gal-3 in such hearts. Notably, lack of PC1 cleavage led to increased apoptotic rate in cardiomyocytes [9.51% (6.76-13.55) in VV versus 3.67% (2.32- 4.85) in WT, P=0.014], a phenotype that was rescued by Gal-3 knockout [2.84% (1.82-7.41) in VVG- versus 9.51% (6.76-13.55) in VV, P=0.002]. VV hearts also exhibited increased expression of inflammatory markers. Our findings provide the initial elucidation of the detrimental effect of Gal-3 on the heart in the setting of Pkd1 deficiency, revealing specific cell responses and suggesting that fibroblasts may be the main cell mediator of this process. The nature of the employed mouse models suggests that this mechanism may be also applicable to human ADPKD, bringing a new scenario to understand the heart phenotype associated with this disease

Objetivos: Diversos estudos avaliaram a significância prognóstica da invasão perineural (IPN) no câncer de boca e de laringe; entretanto, os resultados são inconclusivos. Portanto, conduzimos uma metanálise com o objetivo de identificar o valor prognóstico de IPN no câncer de boca e de laringe, separadamente. Métodos: Foi realizada uma revisão da literatura, com busca nas bases MedLine via Pubmed, Scielo, Lilacs, Cochrane e Websco. RevMan 5.4 foi utilizado para a análise estatística. Resultados: Um total de 19 estudos de câncer de laringe e um total de 56 estudos de câncer de boca foram incluídos. Os resultados indicam que IPN no câncer de boca tem uma incidência de 28% (IC 95% 24%- 31%); sobrevida em 5 anos com RR 0,67 (0,59- 0,75); sobrevida livre de doença em 5 anos RR 0,71 (0,68-0,75); recidiva locorregional RR 2,09 (1,86-2,35). IPN no câncer de laringe apresenta sobrevida em 2 anos com RR 0,71 (0,59- 0,86); sobrevida livre de doença RR 0,51 (0,14-1,95); e recidiva locorregional RR 1,71 (1,25-2,35). Conclusão: A IPN é um fator prognóstico negativo no câncer de boca e de laringe Objectives: Many studies have examined the prognostic significance of perineural invasion (PNI) in oral cancer and larynx cancer; however, the results are inconclusive. We therefore conducted a meta-analysis aiming to clarify the prognostic value of PNI in oral and larynx cancer patients. Methods: A literature search was conducted in the MedLine via Pubmed, Scielo, Lilacs, Cochrane and Websco databases. RevMan 5.4 was used for statistical analysis. Results: A total of 19 studies of larynx cancer and 56 studies of oral cancer were finally included. The results indicated that PNI in oral cancer has an incidence of 28% (IC 95% 24%- 31%); 5 yeas OS impact has a RR 0,67 (0,59- 0,75); 5 years DFS RR 0,71 (0,68-0,75); locoregional recurence RR 2,09 (1,86-2,35). PNI in larynx cancer has an 2 yeas OS RR 0,71 (0,59- 0,86); 2 years DFS RR 0,51 (0,14-1,95); locoregional recurence RR 1,71 (1,25-2,35). Conclusion: PNI is a negative independent prognostic factor in patients with oral and larynx cancer

Este estudo clínico, randomizado e cego teve como objetivo de avaliar a efetividade da laserterapia na prevenção de Herpes Labial Recorrente. Foram recrutados 158 voluntários, esses divididos de forma randômica em 3 grupos: Laser 1 (n=61), Laser 2 (n=50) e Placebo (n=47). Grupo Laser 1: Os parâmetros utilizados foram: 100mW, 808nm, 1J, 10 segundos por ponto, 33,33 J/cm². Foram realizados cerca de 50-60 pontos de irradiação, com distância de 1 cm entre eles, nos lábios do paciente e região perioral. O tratamento foi composto por 2 fases de irradiação: Fase 1 - Foram realizadas cerca de 2 à 3 sessões de irradiação por semana até completar 10 sessões, com intervalo de 48 horas entre elas (segunda, quarta e sexta-feira). Fase 2: Após 6 meses foram realizadas mais 5 sessões, da mesma forma com intervalo de 48 horas entre elas. Grupo Laser 2: A irradiação foi realizada do mesmo modo e com a mesma frequência descritos acima para o Grupo 1. Os parâmetros utilizados foram: 100mW, 810nm, 2J, 20 segundos por ponto, 66,66 J/cm². Grupo Placebo: O equipamento laser foi posicionado nos mesmos pontos e do mesmo modo que nos grupos Laser, no entanto a potência do equipamento foi 0mW e energia utilizada 0J, 0 J/cm². Os pacientes foram avaliados com relação a frequência e intensidade de recorrência do herpes labial previamente ao início do tratamento, por meio de questionários, previamente a Fase 2 e 6 meses após o término da Fase 2. A análise dos dados foi avaliada através de teste estatístico não paramétrico. Os resultados obtidos por meio dos dados recolhidos neste trabalho para avaliar a efetividade do tratamento preventivo de recorrências de herpes labial utilizando laserterapia de baixa potência mostraram que o Grupo 1 (1J) teve melhores resultados em número de lesões por ano e também em relação a severidade a longo prazo em relação ao Grupo 2 (2J). Ambos os Grupos Laser (G1 e G2) foram estatisticamente mais efetivos que o Grupo 3 - Placebo em todos os aspectos analisados. Dentre os pacientes do G1 e G2, 44% não apresentou mais lesões após 6 meses do final do tratamento, porém esse número caiu/foi menor no quarto questionário: 18% desses não apresentaram mais lesões; 14% deles não apresentaram lesões em nenhum momento da pesquisa. Já no G3 (placebo) 100% dos pacientes apresentaram lesões no decorrer do acompanhamento. Todos os pacientes que receberam tratamento com laser e tiveram recidivas, apresentaram melhora significativa na frequência e/ou na severidade das lesões. Nenhum paciente apresentou efeitos colaterais ao tratamento, mostrando que o laser de baixa potência é efetivo, não somente no tratamento das lesões de herpes labial, mas também na diminuição na frequência de recidivas e da severidade das lesões pós irradiação. The present study aims to evaluate the effectiveness of the application of lowintensity laser in the prevention of Herpes Simplex Labialis recurrences through a randomized controlled clinical trial. Until the present moment 158 volunteers were recruited to participate in the study, randomly divided into three study groups: Laser 1 (n = 61), Laser 2 (n = 50) and placebo (n = 47). Laser Group 1: The parameters used are: 100mW, 808nm, 1J, 10 seconds per point. There is about 40-50 irradiation points, with a distance of 1 cm between them on the lips of the patient, perioral skin and next to the nose. The treatment consists in two phases of irradiation: Phase 1 - consists in 10 sessions, 3 sessions per week, with an interval of 48 hours between them (Monday, Wednesday and Friday). Phase 2: After 6 months an additional 5 sessions are conducted, with an interval of 48 hours between them. Laser Group 2: Irradiation is performed in the same manner and with the same frequency as described above. The parameters used are: 100mW, 810nm, 2J, 20 seconds per point. Placebo: The laser is positioned at the same points and in the same manner as in the Laser groups, however the parameters used are: 0mW and 0J. The patients were evaluated according to frequency and labial herpes recurrence intensity prior to initiation of treatment, prior to Phase 2 and 6 months after the end of Phase 2. Data analysis was statistically evaluated by nonparametric statistical test. The results showed that Group 1 had better results in reduction of number of lesions per year and also in the severity of recurrences in long-term compared to Group 2. Both Laser Groups (G1 and G2) were statistically more efficient than Group 3 (Placebo) in all aspects analyzed. Among Group 1 and 2 patients, 44% had no further lesions 6 months after the end of treatment, but this number was reduced on the fourth questionnaire: 18% of these had no further lesions; 14% of them had no lesions at any time during the research. In Group 3 (placebo), 100% of the patients presented lesions during follow-up. All patients who received laser treatment (G1 and G2) and had recurrences had significant improvement in frequency and/or severity of lesions. No patient had side effects from treatment, showing that the low power laser is effective not only in the treatment of herpes labialis lesions but also in reduction of the frequency of recurrences and severity of post irradiation lesions.

O emprego de \"Total Genome Scan\" em modelos genéticos de doenças complexas tem sido fundamental para seleção de regiões cromossômicas envolvidas com traços complexos. Em nosso laboratório, identificamos cinco regiões cromossômicas associadas ao traço quantitativo pressão arterial (BP-QTL) que explicam 43% da variação da pressão arterial numa progênie obtida a partir de animais espontaneamente hipertensos (SHR) e \"Brown Norway\" (BN). Os BP-QTLs foram, então, validados por desenvolvimento de linhagens congênicas, incluindo uma para o cromossomo 4 (SHR.BN4) cuja substituição das sequências SHR pelo do animal BN levou a redução da pressão arterial sistólica basal (~14 mm Hg). O objetivo deste trabalho foi identificar as variantes genéticas candidatas neste intervalo cromossômico com base em diferenças no padrão de expressão gênica e na presença de alterações genéticas não sinônimas \"missense\" ou em regiões regulatórias conservadas que possam estar envolvidas na gênese da hipertensão. Identificamos 533 genes com expressão renal, dentre os 682 do intervalo, sendo que 28 apresentaram padrão de expressão diferente entre amostras de animais adultos (congênico vs. SHR) e seis apresentaram alterações não sinônimas \"missense\". É importante salientar que dos genes diferentemente expressos, encontramos alterações estruturais em regiões conservadas com potencial de participar na regulação em 11. Em conjunto, utilizamos uma plataforma integrada para selecionar 34 genes candidatos no cromossomo 4, dos quais 17 genes serão priorizados, para ser investigados quanto sua contribuição na hipertensão arterial do SHR e na hipertensão primária humana Total genome scan in genetic models of complex diseases have been instrumental to select candidate genes underlying complex traits. We previously mapped 5 blood pressure related quantitative trait loci (BP-QTLs) that explain about 43% of the BP variance in a progeny derived from Spontaneous Hypertensive Rat (SHR) and Brown Norway (BN) rats. The BP-QTLs were then validated by derivation of congenic strains, including one for chromosome 4 (SHR.BN4) in which a segment from BN replaced the SHR sequences reducing basal systolic BP (~14 mm Hg). The aim of this project is to identify the candidate genetic variants within the chromosome interval based on differences in renal gene expression patterns and structural changes in both non-synonymous missense or within adjacent regulatory sequences that may contribute to hypertension. We identified 533 genes with renal expression, out of 682 in the interval, in which 28 presented differences in expression pattern in adult samples (congenic vs. SHR) and six presented non-synonymous missense alterations. In addition, 11 out of 28 differentially expressed genes showed structural alterations in adjacent conserved regions that potentially contribute to gene regulation. Taken together, using the proposed combination of strategies, we selected 34 hypertensive candidate genes in chromosome 4, in which 17 will be prioritized, to be further explored to assess their contribution to hypertension in the SHR and to essential hypertension in humans.

Angiomiolipomas renais (AMLs) são tumores complexos com componentes vascular, gorduroso e muscular. Apresentam prevalência relativamente elevada na população geral, ocorrendo geralmente na forma esporádica. Em cerca de 10% dos casos, entretanto, AMLs associam-se com o complexo esclerose tuberosa (CET). Nesta doença, tais tumores acometem a maior parte dos pacientes e são geralmente múltiplos, bilaterais e precoces. AMLs podem ainda se associar com linfagioleiomiomatose pulmonar esporádica (LAM) e, raramente, se manifestar como lesões múltiplas isoladas. Sua principal complicação é hemorragia, de caráter potencialmente grave. Por essa razão, intervenções invasivas eram até recentemente indicadas para AMLs com alto risco de sangramento. Esses procedimentos, entretanto, associam-se a risco de perda significativa de massa renal funcional. Inibidores de mTOR, por sua vez, apresentam um importante efeito redutor de volume sobre AMLs. Seus efeitos específicos sobre os diferentes componentes tumorais, entretanto, não são conhecidos. Nesse cenário, investigamos os efeitos do sirolimo sobre os diferentes compartimentos do AML, e especificamente sobre as formações aneurismáticas/ectásicas intratumorais. Também analisamos seu papel potencial como terapia neoadjuvante em pacientes com AMLs submetidos a nefrectomia com preservação de massa renal. Analisamos 147 pacientes com AMLs associados a CET, LAM e múltiplos isolados. Observamos índices elevados de hipertensão arterial, albuminúria e malignidade para a idade avaliada na população estudada. Também detectamos associação entre a realização de nefrectomia e menor taxa de filtração glomerular estimada. Nefrectomia total constituiu preditor independente para doença renal crônica estágio 3 ou acima, enquanto nefrectomia parcial foi identificada como preditor independente para ocorrência de hipertensão arterial. Tratamento com sirolimo reduziu o tamanho dos AMLs, efeito que não diferiu entre pacientes com CET, LAM ou AMLs múltiplos isolados. Pacientes pré-tratados com sirolimo e submetidos a nefrectomia apresentaram elevações menores de creatinina sérica que pacientes nefrectomizados não pré-tratados, 48h e 7 meses após o procedimento cirúrgico. Não foram observados eventos adversos graves relacionados a este pré-tratamento. A análise de 23 tumores de pacientes com CET tratados com sirolimo mostrou redução do volume tumoral, um efeito primariamente determinado pela diminuição dos compartimentos com baixo teor de gordura. De fato, baixo teor de gordura mostrou-se um preditor independente de redução de pelo menos 50% do volume de AMLs em resposta a sirolimo. Interessantemente, o volume do compartimento rico em gordura aumentou em resposta ao sirolimo. Nesse cenário, alguns AMLs pobres em gordura evoluíram com lipossubstituição. Observamos também uma diminuição marcante dos compartimentos altamente vascularizados. Em sintonia com esse achado, detectamos redução maciça de formações aneurismáticas/ectásicas intratumorais em resposta ao inibidor de mTOR. Nosso estudo sugere, portanto, que sirolimo exerça uma ação renoprotetora seguindo-se a nefrectomia em pacientes com CET. Nossos achados sugerem, também, que inibidores de mTOR reduzam o risco de sangramento em AMLs, dada sua indução de redução marcante de vascularização e de vasos aneurismáticos/ectásicos intratumorais. Renal angiomyolipomas (AMLs) are complex tumors with vascular, fatty and muscular components. Their prevalence is relatively high in the general population, usually occurring in the sporadic form. In about 10% of cases, however, AMLs are associated with the tuberous sclerosis complex (TSC). In this disease, such tumors affect most patients and are usually multiple, bilateral and early onset. AMLs may also be associated with sporadic pulmonary lymphagioleiomyomathosis (LAM) and, rarely, manifest as multiple isolated lesions. Its main complication is hemorrhage, a potentially serious event. For this reason, invasive interventions were until recently indicated for AMLs with a high risk of bleeding. These procedures, however, are associated with a risk of significant loss of functional renal mass. mTOR inhibitors, in turn, have shown to exert an important volume-reducing effect on AMLs. Its specific effects on the different tumor components, however, are not known. In this scenario, we investigated the effects of sirolimus on the different compartments of the AML, and specifically on intratumoral aneurysmatic/ectatic formations. We also analyzed its potential role as neoadjuvant therapy in patients with AMLs undergoing nephrectomy with preservation of renal mass. We analyzed 147 patients with AMLs associated with TSC, LAM and multiple isolated lesions. We observed high rates of hypertension, albuminuria and malignancy for the assessed age in the analyzed population. We also detected association between nephrectomy and a lower estimated glomerular filtration rate. Total nephrectomy was an independent predictor for chronic kidney disease stages 3 or above, while partial nephrectomy was identified as an independent predictor for the occurrence of hypertension. Treatment with sirolimus reduced the size of AMLs, an effect that did not differ among patients with TSC, LAM and multiple isolated AMLs. Patients pretreated with sirolimus and undergoing nephrectomy had lower serum creatinine elevations than untreated nephrectomized patients, 48 hours and 7 months after the surgical procedure. There were no serious adverse events related to this pretreatment. Analyses of 23 tumors from TSC patients treated with sirolimus showed reduction in tumor volume, an effect primarily determined by decrease of compartments with low fat content. Low fat content, in fact, was shown to be an independent predictor of an at-least-50% reduction in AML volume in response to sirolimus. Interestingly, the fat-rich compartment volume not only did not decrease but increased in response to sirolimus. In this scenario, some low-fat AMLs evolved with liposubstitution. We also observed a marked decrease in highly vascularized compartments. In line with this finding, we detected a massive reduction of intratumor aneurysmal/ectatic formations in response to the mTOR inhibitor. Our study suggests, therefore, that sirolimus exerts a renoprotective action following nephrectomy in patients with TSC. Our findings also suggest that mTOR inhibitors reduce the bleeding risk in AMLs, given their induction of marked reduction in vascularization and intratumoral aneurysmatic/ectatic vessels.

Manifestações cardiovasculares são responsáveis por morbidade e mortalidade significativas na doença renal policística autossômica dominante (DRPAD). Associação entre cardiomiopatia dilatada idiopática e DRPAD, assim como um papel primário da deficiência de Pkd1 e Pkd2 nessa disfunção, foram recentemente descritos. Os mecanismos envolvidos na patogênese desse fenótipo, contudo, permanecem amplamente desconhecidos. Nesse cenário, o objetivo deste estudo foi investigar as bases metabólicas e celulares do fenótipo cardíaco associado à DRPAD. Para tanto, utilizamos como modelo experimental camundongos homozigotos para um alelo hipomórfico de Pkd1 (Pkd1V/V, VV), animais que apresentam disfunção cardíaca precocemente. Os corações de camundongos VV não desenvolveram hipertrofia, mas apresentaram apoptose e inflamação aumentadas em comparação a seus respectivos controles selvagens (WT). A expressão dos genes fetais Nppa e Acta1 mostrou-se aumentada em tecido cardíaco VV, revelando uma transição inadequada do perfil transcricional fetal para o perfil pós-natal. Corações VV apresentaram diminuição da expressão de PparAlfa, Pgc1Alfa/PGC1, AMPK total e fosforilada e ACCBeta fosforilada, resultados associados a diminuição da fosforilação oxidativa de ácidos graxos e aumento da oxidação de glicose. Diferentemente de resultados prévios obtidos em rins deficientes em Pkd1, corações VV apresentaram diminuição da atividade de mTORC1, a glicose não foi preferencialmente direcionada para glicólise aeróbica e a concentração de glutamina mostrou-se aumentada quando comparada à dos controles WT. Tais achados acompanharam-se de alterações mitocondriais, incluindo aumento da densidade volumétrica citoplasmática, aumento de fragmentação e aumento do consumo de oxigênio em resposta à glicose. Experimentos de ressonância magnética nuclear identificaram um perfil metabólico distinto em corações VV, caracterizado principalmente por diminuição dos níveis de glicose e aminoácidos (serina, alanina, tirosina, valina, prolina, metionina, glutamato, glicina, aspartato, isoleucina e histidina). Esses dados sugerem que glicose e aminoácidos possam estar sendo utilizados como substrato energético e, possivelmente, para sustentar a biossíntese de compostos envolvidos no metabolismo lipídico e no estresse oxidativo. Nossos achados consistem na primeira descrição de reprogramação metabólica cardíaca associada a deficiência de Pkd1, revelando aspectos comuns e diferentes dos descritos para rins com DRPAD. Nossos resultados constituem, portanto, um marco conceitual na elucidação da patogênese da disfunção cardíaca associada à deficiência de Pkd1, achados provavelmente aplicáveis ao fenótipo cardíaco na DRPAD humana Cardiovascular manifestations account for significant morbidity and mortality in autosomal dominant polycystic kidney disease (ADPKD). Association between idiopathic dilated cardiomyopathy and ADPKD as well as a primary role for Pkd1 and Pkd2 deficiency in this dysfunction have been recently described, however the pathogenic mechanisms remain largely unknown. In this scenario, the aim of this study was to investigate the metabolic and cellular basis of ADPKD-associated cardiac phenotype. We used a mouse homozygous for a Pkd1 hypomorphic allele (Pkd1V/V, VV) with early cardiac dysfunction as our experimental model. Dysfunctional VV hearts were not hypertrophic but displayed increased apoptosis and inflammation compared to wild-type controls. Expression of Nppa and Acta1 was increased in VV cardiac tissue, revealing inappropriate transcriptional transition to the mature state. Downregulation of PparAlpha, Pgc1Alpha/PGC1, total and phosphorylated AMPK and phosphorylated ACCBeta, in turn, was associated with abnormal lipid metabolism and increased glucose oxidation. Unlike Pkd1-deficient kidneys, mTORC1 is downregulated, glucose is not targeted for aerobic glycolysis and glutamine is increased in VV hearts. Such findings were accompanied by increased mitochondrial density with decreased size and increased oxygen consumption in response to glucose. NMR experiments identified a distinct metabolite profile in VV hearts, associated with decreased levels of glucose and amino acids (serine, alanine, tyrosine, valine, proline, methionine, glutamate, glycine, aspartate, isoleucine and histidine). These data suggest that glucose and amino acids may be used as energetic substrate and to sustain biosynthesis of metabolites likely involved in lipid metabolism and oxidative stress. Our findings are the first description of cardiac metabolic rewiring associated with Pkd1 deficiency, revealing a pattern just partially similar to the metabolic profile previously observed in the cystic kidney phenotype. Our results constitute, therefore, a conceptual marker in the elucidation of the heart dysfunction pathogenesis associated with Pkd1 deficiency, findings likely applicable to the cardiac phenotype in human ADPKD

A inibição temporária da síntese de NO através da administração de L-NAME associada a uma sobrecarga salina (HS) é um modelo de doença renal crônica caracterizado por hipertensão severa e lesão renal. Com a interrupção do tratamento a maioria das alterações se normaliza, porém o retorno à normalidade não é completo. Uma nefropatia progressiva se instala acompanhada por inflamação persistente. Investigamos se a imunidade inata, em particular o sistema NF-kB, está envolvida nesse processo. Ratos Munich- Wistar machos receberam sobrecarga salina e L-NAME (32 mg/Kg/dia) e ratos controles receberam apenas sobrecarga salina. O tratamento foi cessado após 4 semanas e 30 animais foram avaliados. Ratos adicionais foram avaliados com 8 semanas (N=30) e 28 semanas (N=30). Como esperado, HS+L-NAME promoveu hipertensão severa, albuminúria e lesões renais, enquanto a ativação da imunidade inata foi evidente. Após a interrupção do tratamento ocorreu uma redução parcial das lesões renais e da inflamação, porém a imunidade inata permaneceu ativada. Ao final das 28 semanas as lesões glomerulares se agravaram e a inflamação e imunidade inata persistiram. A administração de pirrolidina ditiocarbamato (PDTC), um inibidor do sistema NFkB, em concomitância com o tratamento temporário com HS+L-NAME preveniu o desenvolvimento de inflamação e lesões renais durante todo o estudo. A ativação precoce da imunidade inata pode ser crucial para o início das lesões renais no modelo HS+L-NAME e para a progressão autônoma da nefropatia crônica, mesmo após a interrupção do insulto inicial NO synthase inhibition by L-NAME plus high-salt diet (HS) is a model of Chronic Kidney Disease characterized by marked hypertension and renal injury. With the cessation of treatment, most of these changes subside, but progressive renal injury develops, associated with persistent low-grade renal inflammation. We investigated whether innate immunity, and in particular the NF-kB system, is involved in this process. Male Munich-Wistar rats received HS and L-NAME, 32 mg/Kg/d, while control rats received HS only. Treatment was ceased after 4 weeks when 30 rats were studied. Additional rats were studied at 8 weeks (N=30) and 28 weeks (N=30). As expected, HS+L-NAME promoted severe hypertension, albuminuria, and renal injury after 4 weeks of treatment, whereas innate immunity activation was evident. After discontinuation of treatments, partial regression of renal injury and inflammation occurred, along with persistence of innate immunity activation. At 28 weeks, glomerular injury worsened, while renal inflammation persisted and renal innate immunity remained activated. Administration of the NF-kB inhibitor pyrrolidine dithiocarbamate (PDTC) in concomitancy with the four-week HS+L-NAME treatment prevented the development of renal injury and inflammation, an effect that lasted throughout the 28-week period of observation. Early activation of innate immunity may be crucial to the initiation of renal injury in the HS+LNAME model, and to the autonomous progression of chronic nephropathy even after cessation of the original insult

Um dos desafios recorrentes na prática clínica da Oncologia é o processo de repopulação, no qual células tumorais resistentes à terapia são capazes de proliferar e reconstituir o tumor. No entanto, os mecanismos envolvidos neste fenômeno ainda foram pouco explorados, sendo necessário melhor compreendê-los para evitar a falha terapêutica. Melanomas são bons modelos para estudar repopulação devido às baixas taxas de sobrevida livre de progressão e às altas taxas de resistência às terapias associadas a este tipo de tumor sólido. Sabe-se que a exposição de células tumorais a condições estressoras do microambiente, como hipóxia e hipóxia/reoxigenação, bem como ao próprio tratamento antitumoral, são pressões seletivas frequentemente encontradas em tumores sólidos que favorecem a resistência às terapias e a repopulação tumoral. Estudos prévios indicam que a sinalização mediada pelo Fator de Ativação de Plaquetas (PAF), um lipídio bioativo relacionado à diversas funções fisiológicas, e de seu receptor, PAFR, está associada com a resistência de células de melanoma aos tratamentos citotóxicos e com crescimento tumoral. Portanto, este trabalho teve como objetivo investigar o envolvimento da sinalização de PAFR frente às condições estressoras descritas acima no fenômeno de repopulação de melanomas. Os resultados de espectrometria de massa indicaram que hipóxia aumentou a geração de PAF nas linhagens de melanoma humano SKmel05 e A375, mas não na A375M, embora este aumento não tenha sido observado após a reoxigenação. Além disso, mostraram que SKmel37 exibiu os maiores níveis basais de PAF, aumentando substancialmente sua geração em diferentes tempos de exposição à hipóxia e hipóxia/reoxigenação. Investigamos também a geração de outros ligantes de PAFR, porém nenhum deles foi encontrado nas amostras. Os resultados de detecção de PAFR por Western Blot e/ou citometria de fluxo revelaram que os níveis proteicos não foram modulados por estas condições em nenhuma das linhagens e que, em termos basais, SKmel37 e SKmel05 apresentaram os maiores níveis. Estas linhagens foram, portanto, submetidas a ensaios de proliferação, os quais evidenciaram que frente ao tratamento com o antagonista de PAFR, WEB2086, em condições de hipóxia e hipóxia/reoxigenação, apenas as células SKmel37 tiveram sua proliferação reduzida e morfologia associada à morte. Ensaios de incorporação de iodeto de propídio indicaram que o tratamento destas células expostas à hipóxia/reoxigenação com WEB2086 levou a acúmulo em SG2M, morte celular e sensibilização à cisplatina. Além disso, imunofluorescência de cortes congelados de tumores induzidos com SKmel37 revelou que houve acúmulo de PAFR em áreas hipóxicas e em seu entorno. Em relação ao modelo de exposição à tratamentos antitumorais, por sua vez, curvas de concentração e tempo com Vemurafenib mostraram que SKmel37 e A375 foram resistentes à droga, ao passo que SKmel05 e UACC62 foram sensíveis. Além disso, WEB2086 potencializou o efeito de morte induzido por Vemurafenib nas linhagens sensíveis, mas não afetou as resistentes. Considerando os aspectos clínicos de resposta inicial com posterior desencadeamento de repopulação, seguimos com as linhagens sensíveis e verificamos por citometria que esta droga aumentou ROS em ambas as linhagens, mas só aumentou PAFR extracelular na SKmel05. O tratamento combinado potencializou a geração de ROS e levou a ativação de caspase3/7 apenas na SKmel05. Esta linhagem foi então submetida a ensaios clonogênicos cujos resultados mostraram que o tratamento com Vemurafenib reduziu o número de clones e que WEB2086 não potencializou este efeito. Assim, o conjunto de resultados apresentados evidencia que a sinalização de PAFR participa dos desfechos de sobrevivência frente à hipóxia/reoxigenação e/ou tratamentos antitumorais, podendo, de alguma forma, contribuir com a repopulação de melanomas One of the recurrent challenges in the clinical practice of Oncology is the process of repopulation, in which therapy-resistant tumor cells can proliferate and reconstitute the tumor. However, the mechanisms involved in this phenomenon were still little explored. The understanding of these events is, therefore, needed to avoid therapeutic failure. Melanomas are good models for studying repopulation due to the low rates of progression-free survival and the high rates of resistance to therapies associated to this type of solid tumor. It is known that the exposure of tumor cells to microenvironmental stress conditions, such as hypoxia and hypoxia/reoxygenation, as well as the exposure to antitumor treatment itself, are selective pressures frequently found in solid tumors that favor therapy resistance and tumor repopulation. Previous studies have indicated that the signaling mediated by the Platelet Activation Factor (PAF), a bioactive lipid related to various physiological functions, and its receptor, PAFR, is associated with resistance of melanoma cells to cytotoxic treatments and with tumor growth. Therefore, the aim of this study was to investigate the involvement of PAFR signaling upon the adverse conditions described above in the phenomenon of melanoma repopulation. Mass spectrometry results indicated that hypoxia increased the generation of PAF in human melanoma cell lines SKmel05 and A375, but not in A375M, although this increase was not observed after reoxygenation. In addition, they showed that SKmel37 exhibited the highest PAF basal levels, whose generation increased substantially after different times of hypoxia and hypoxia/reoxygenation exposure. We also investigated the generation of other PAFR ligands, but none were found in the samples. The results of PAFR detection by Western Blot and/or flow cytometry revealed that protein levels were not modulated by these conditions in any of the cell lines and that, at baseline, SKmel37 and SKmel05 showed the highest levels. These lines were therefore submitted to proliferation assays, which showed that the treatment with the PAFR antagonist, WEB2086, under conditions of hypoxia and hypoxia/reoxygenation, led to proliferation reduction and death-associated morphology in SKmel37 cells only. Propidium iodide incorporation studies indicated that the treatment of these cells exposed to hypoxia/reoxygenation with WEB2086 led to accumulation in SG2M, cell death and cisplatin sensitization. In addition, immunofluorescence of frozen sections of SKmel37-induced tumors revealed that PAFR was found accumulated in hypoxic areas and its surroundings. Regarding the model of exposure to antitumor treatments, concentration and time curves with Vemurafenib showed that SKmel37 and A375 were resistant to the drug, whereas SKmel05 and UACC62 were sensitive. In addition, WEB2086 potentiated the effect of Vemurafenib-induced death on sensitive cell lines but did not affect the resistant ones. Considering the clinical aspects of initial response with subsequent repopulation triggering, we continued using the sensitive cell lines and we verified by cytometry that this drug increased ROS in both cell lines but only increased extracellular PAFR in SKmel05. The combined treatment potentiated the generation of ROS and led to the activation of caspase3/7 in SKmel05 only. This cell line was then submitted to clonogenic assays whose results showed that treatment with Vemurafenib reduced the number of clones and that WEB2086 did not potentiate this effect. Thus, the set of results presented highlights that PAFR signaling participates in the survival outcomes upon hypoxia/reoxygenation and/or antitumor treatments, and may, in some way, contribute to the repopulation of mel

INTRODUÇÃO: Na última década surgiu uma nova técnica, o sequenciamento de nova geração, que, contrário ao método tradicional de Sanger, permite o sequenciamento em paralelo e em larga escala de múltiplos genes, ou até mesmo todos os genes humanos, a menor custo e com uma análise mais acelerada. Essa técnica possibilitou a descoberta de novos genes responsáveis por diversas doenças mendelianas, sendo rapidamente incorporada no contexto clínico. OBJETIVOS: comparar os resultados das técnicas de Sanger e sequenciamento de nova geração em amostras controle; introduzir a técnica de sequenciamento de nova geração no contexto clínico nas casuísticas de doenças ósseas genéticas e RASopatias; avaliar a sensibilidade diagnóstica desta técnica em amostras sem dados clínicos fornecidos. MÉTODOS: o sequenciamento de nova geração (sob a forma de um painel de genes customizado ou do exoma) foi realizado em amostras com mutações identificadas previamente por Sanger e em dois grupos de doenças mendelianas, 144 pacientes com doenças ósseas e 79 com RASopatias, além de 90 amostras sem dados clínicos conhecidos (45 casos e 45 controles). A técnica de Sanger foi aplicada em 29 amostras de doenças ósseas e em 81 amostras para confirmação de variantes identificadas pelo sequenciamento de nova geração. RESULTADOS: A sensibilidade da técnica de sequenciamento de nova geração foi estimada em 95,92% e a especificidade em 98,77%. Na casuística de doenças ósseas, a sensibilidade diagnóstica das amostras sequenciadas por Sanger foi de 69% (20/29), por painel customizado, 60% (75/125) e por exoma, 63% (12/19). Na casuística de RASopatias, a sensibilidade diagnóstica através do exoma foi de 46% (36/79). Como resultado deste trabalho, dois genes novos associados a RASopatias (LZTR1 e SOS2) e um associado a uma displasia esquelética (PCYT1A) foram identificados. Na análise das amostras sem conhecimento prévio da hipótese clínica foi obtida uma sensibilidade diagnóstica de 46,67% (21/45), mas que chegou a 73,08% (14/26) para as hipóteses de erros inatos do metabolismo. CONCLUSÕES: Foi demonstrado que a sensibilidade e a especificidade da técnica do sequenciamento de nova geração são altas e correspondentes a valores encontrados por outros grupos na literatura. Essa técnica foi considerada apropriada não apenas no contexto de pesquisa, demonstrado aqui pela descoberta de três novos genes associados a doenças mendelianas, como também para análises clínicas. Neste estudo a técnica foi aplicada com sucesso no contexto clínico, seja pelo painel customizado, seja pelo exoma, com uma positividade semelhante à encontrada pela técnica de Sanger. Mesmo na análise de amostras sem história clínica prévia foi possível identificar variantes patogênicas em quase metade dos casos, e numa porcentagem ainda maior quando a doença era um erro inato do metabolismo. Essa sensibilidade é comparável à obtida pela espectroscopia de massas em Tandem aplicada à triagem de múltiplas condições simultaneamente, o que sugere que a técnica do sequenciamento de nova geração poderá ser incorporada ao programa de triagem neonatal no futuro, ampliando o emprego de testes genéticos em complementaridade aos testes bioquímicos tradicionais INTRODUCTION: In the last decade a new technique, the next generation sequencing, has emerged, which, contrary to the traditional Sanger method, performs parallel and high-throughput sequencing of multiple genes, or even all human genes, at a lower cost and with a faster analysis. This technique allowed the discovery of new genes responsible for several Mendelian diseases and has been quickly incorporated into the clinical context. OBJECTIVES: to compare the results of Sanger technique and next generation sequencing in control samples; to apply the next generation sequencing technique in the clinical practice to the cases of genetic skeletal disorders and RASopathies; to evaluate the diagnostic yield of this technique in samples without clinical data provided. METHODS: Next generation sequencing (in the form of a customized gene panel or exome) was performed in samples with mutations previously identified by Sanger sequencing and in two groups of Mendelian diseases, 144 patients with skeletal disorders and 79 patients with RASopathies, besides 90 samples with unknown clinical data (45 cases and 45 controls). The Sanger technique was applied in 29 samples of skeletal disorders and in 81 samples for confirmation of variants identified by next generation sequencing. RESULTS: The sensitivity of the next generation sequencing technique was estimated at 95.92% and the specificity at 98.77%. In the case of skeletal disorders, the diagnostic yield of the samples sequenced by Sanger was 69% (20/29), by customized panel, 60% (75/125), and by exome, 63% (12/19). In the individuals with RASopathies, the diagnostic yield through exome sequencing was 46% (36/79). As a result of this study, two new genes associated with RASopathies (LZTR1 and SOS2) and one associated with a skeletal dysplasia (PCYT1A) were identified. In the analysis of the samples without previous knowledge of the clinical hypothesis, a total diagnostic yield of 46.67% (21/45) was obtained, but it was up to 73.08% (14/26) in the group with hypothesis of inborn errors of metabolism. CONCLUSIONS: It was demonstrated that the sensitivity and specificity of the next generation sequencing technique are high and are similar to values found by other groups in the literature. The technique was considered appropriate not only for research, as demonstrated here by the identification of three new genes associated to Mendelian diseases, but also for clinical analysis. In this study the technique was successfully applied in the clinical context, both by customized panel and by exome, with positivity similar to that obtained by the Sanger technique. Even in the analysis of samples with no previous clinical history, it was possible to identify pathogenic variants in almost half of the cases, and an even greater percentage was obtained when the disease was an inborn error of metabolism. This sensitivity is comparable to that obtained by Tandem mass spectroscopy applied to multi-condition screening, suggesting that the next generation sequencing technique may be incorporated in the future into the neonatal screening program, increasing the use of genetic testing in complementarity to the biochemical tests

A isoforma 3 do trocador Na+ /H+ (NHE3), presente em membrana apical, é a proteína de transporte que medeia a maior parte da reabsorção de NaCl e NaHCO3- em túbulo proximal renal. A fosforilação direta do NHE3 por PKA na serina 552 é um dos mecanismos pelos quais a sua atividade pode ser inibida. A ligação da angiotensina II (Ang II) ao receptor AT1 (AT1R) em túbulo proximal estimula a atividade do NHE3 por diferentes vias de sinalização. Entretanto, não foram ainda bem estabelecidos os efeitos da ativação da via AT1R/Gi, com consequente diminuição nos níveis de cAMP, na regulação do NHE3. A Ang II pode ainda estimular a atividade do NHE3 por promover a sua translocação da base para o corpo das microvilosidades, entretanto, o papel da proteína motora miosina IIA nesta translocação em resposta à Ang II ainda não foi estabelecido. Sendo assim esta tese teve como objetivos: (1) testar a hipótese de que a Ang II diminui os níveis de fosforilação do NHE3 mediados pelo cAMP/PKA na serina 552 aumentando a sua atividade por reduzir os níveis de cAMP e (2) testar a hipótese de que a miosina IIA participa da redistribuição do NHE3 da base para o corpo das microvilosidades em túbulo proximal renal em condições de estímulo da reabsorção de sódio, como ocorre em resposta à Ang II. Visando avaliar os efeitos da ativação da via AT1R/Gi na regulação do NHE3, verificamos, por meio da técnica de recuperação do pH dependente de Na+, que, em condições basais, a Ang II estimulou a atividade do NHE3, mas não alterou a atividade da PKA e nem afetou os níveis de fosforilação do NHE3 na serina 552 em uma linhagem de células de túbulo proximal (OKP). Entretanto, na presença da forskolin (FSK), agente que eleva os níveis intracelulares de cAMP, a Ang II foi capaz de contrapor-se ao efeito inibitório da FSK sobre o NHE3 por promover redução na concentração de cAMP, diminuição da atividade da PKA e, consequentemente, diminuição nos níveis de fosforilação da serina 552. Todos os efeitos da Ang II foram bloqueados quando um pré-tratamento com Losartan, antagonista do receptor AT1, foi feito nas células OKP, destacando a contribuição da via AT1R/proteína Gi no aumento da atividade do NHE3 pela Ang II. Observamos que a inibição da proteína Gi com PTX (toxina pertussis) diminuiu a atividade do NHE3 em células OKP e que a PTX diminuiu a atividade do NHE3 assim como preveniu o efeito estimulatório da Ang II sobre a atividade do NHE3 em túbulo proximal de ratos Wistar. Adicionalmente, com a intenção de avaliar os efeitos da miosina IIA na redistribuição do NHE3, constatamos que a blebistatina, inibidor da miosina IIA, preveniu completamente o aumento de atividade do NHE3 mediado pela Ang II em ratos Wistar e que o uso da blebistatina foi capaz de prevenir o aumento do NHE3 na superfície de células OKP tratadas com Ang II. Em conjunto, nossos resultados sugerem que a Ang II contrapõe-se aos efeitos do cAMP/PKA sobre a fosforilação e a atividade do NHE3 pela ativação da via AT1R/Gi e que a miosina IIA desempenha um papel na mediação da regulação da atividade do NHE3 em túbulo proximal renal de ratos em resposta à Ang II. Sugerem ainda que a desfosforilação do NHE3 na serina 552 pode representar um evento chave na regulação do manuseio de sal tubular proximal pela Ang II na presença de hormônios natriuréticos que promovem o aumento dos níveis de cAMP e da fosforilação do transportador e que a miosina IIA está envolvida na regulação do tráfego do NHE3 em túbulo proximal renal The Na+/H+ exchanger isoform 3 (NHE3), expressed on the apical membrane, is responsible for most NaCl and NaHCO3 - reabsorption in the renal proximal tubule. Direct phosphorylation of NHE3 by PKA at serine 552 is one of the mechanisms by which its activity is inhibited. Binding of angiotensin II (Ang II) to the AT1 receptor (AT1R) in the proximal tubule stimulates NHE3 activity through multiple signaling pathways. However, the effects of AT1R/Gi activation and subsequent decrease in cAMP accumulation on NHE3 regulation are not well established. Ang II can also stimulate NHE3 activity by promoting its translocations from the base to the body of the microvilli, however, the role of the myosin IIA motor protein in this translocation in response to Ang II is not yet established. Therefore, the aims of this thesis are: (1) to test the hypothesis that Ang II decreases the cAMP/PKA-mediated NHE3 phosphorylation levels at serine 552 increasing its activity by reducing cAMP levels and (2) to test the hypothesis that myosin IIA participates in the NHE3 redistribution from the base to the body of the microvilli in the renal proximal tubule under conditions in which sodium reabsorption is stimulated, such as in response to Ang II. In order to evaluate the effects of AT1R/Gi pathway activation on NHE3 regulation, by means the intracellular pH recovery technique, we verified that under basal conditions, Ang II stimulated NHE3 activity but did not affect PKA-mediated NHE3 phosphorylation at serine 552 in opossum kidney (OKP) cells. However, in the presence of the cAMP-elevating agent forskolin (FSK), Ang II counteracted FSK-induced NHE3 inhibition, reduced intracellular cAMP concentrations, lowered PKA activity, and prevented the FSK-mediated increase in NHE3 serine 552 phosphorylation. All effects of Ang II were blocked by pretreating OKP cells with the AT1R antagonist Losartan, highlighting the contribution of the AT1R/Gi pathway in Ang II-mediated NHE3 upregulation under cAMP-elevating conditions. We also verified that Gi protein inhibition by pertussis toxin treatment decreased NHE3 activity both in vitro and in vivo and, more importantly, prevented the stimulatory effect of Ang II on NHE3 activity in Wistar rat proximal tubules. Additionally, we assessed the effects of myosin IIA on NHE3 redistribution, and found that blebbistatin, a myosin IIA inhibitor, completely prevented the increase of Ang II-mediated NHE3 activity in Wistar rats and that blebbistatin was able to prevent the increase of NHE3 on the Ang II-treated OKP cells surface. Collectively, our results suggest that Ang II counteracts the effects of cAMP/PKA on NHE3 phosphorylation and inhibition by activating the AT1R/Gi pathway and that myosin IIA plays a role in mediating the NHE3 activity regulation in the rat renal proximal tubule in response to Ang II. Furthermore, these findings support the notion that NHE3 dephosphorylation at serine 552 may represent a key event in the regulation of renal proximal tubule sodium handling by Ang II in the presence of natriuretic hormones that promote cAMP accumulation and transporter phosphorylation, and that myosin IIA is involved in NHE3 trafficking regulation in the renal proximal tubule

As imunodeficiências primárias são um grupo heterogêneo de doenças hereditárias do sistema. Aqui nós descrevemos 4 famílias (2 Turcas e 2 Brasileiras), que apresentaram infecções recorrentes desde os primeiros dias de vida. Após uma análise clínica bem detalhada, combinamos as técnicas de sequenciamento de alta geração para identificar novos defeitos genéticos que levam ao fenótipo de IDP. Finalizamos com a identificação e caracterização de três IDP, sendo que duas inéditas. A primeira identificada (P1) foi causada por uma mutação bialélica no sítio de splice do gene PRKCD (c.1352+1G>A). A segunda (P2 e P3) foi causada por uma mutação bialélica no gene que codifica NIK (c. C1694G; p. Pro565Arg). A terceira (P4) foi causada uma mutação no gene IL7Rα (c.G353A). Finalizamos a análise da P5, mas nenhum dos genes candidatos foi confirmado. A análise genética e a identificação do defeito genético, permite que nossos pacientes possam ter uma melhor sobrevida, podendo realizar um tratamento correto e permite o aconselhamento genético na família. Primary immunodeficiencies are a heterogeneous group of inherited diseases of the immune system. Here we describe 5 patients from 4 families (2 Turks and 2 Brazilian), all patients had recurrent infections since the firsts days of life. After a very detailed clinical analysis, we applied the Next Generation Sequencing to identify new genes that could be lead to PID phenotype. We finished with the identification and characterization of 3 PID, where 2 of them was new. The first identified (P1) was a biallelic mutation in the splice site of the gene PRKCD (c.1352 + 1G>A). The second (P2 and P3) was a biallelic mutation in the gene encoding NIK (MAP3K14; c.C1694G;. p.Pro565Arg). The third (P4) has a mutation in the gene IL7Rα (c.G353A). We finished the analysis of P5, but no candidate gene was confirmed to be the defect cause. Genetic analysis and identification of the genetic defect allows our patients may have a better survival and can perform a proper treatment and genetic counseling allows the family.

Introdução: A miastenia gravis (MG) é uma doença autoimune caracterizada por diminuição da força nos músculos voluntários, que se agrava com o esforço, podendo evoluir com alterações de voz e deglutição. Objetivo: Caracterizar as manifestações laríngeas da MG. Métodos: Foi realizado um estudo transversal por meio da avaliação de 37 pacientes portadores de MG, no período de maio de 2015 a novembro de 2016. Os pacientes foram recrutados no Ambulatório de Neurologia do Hospital das Clínicas da Faculdade de Medicina da Universidade de São Paulo, São Paulo/SP. Além dos dados clínicos e demográficos, todos os pacientes foram analizados pelo Índice de Desvantagem Vocal-10 (IDV-10), análise perceptivo-auditiva da voz, videolaringoestroboscopia e videoendoscopia da deglutição. Resultados: Na avaliação de voz, foi identificada disfonia em 89,2% dos sujeitos, sendo 59,5% de grau discreto e 29,7% moderado a grave. A autopercepção da desvantagem vocal foi significativamente maior nos pacientes diagnosticados com algum grau de disfonia. Foram identificadas alterações anatômicas em 8 pacientes à videolaringoestroboscospia. Ao comparar o grau da doença com as variáveis contração faríngea e sensibilidade laríngea na VED, observou-se maior ocorrência nos sujeitos com doença mais avançada e comprometimento bulbar. A associação entre as alterações de sensibilidade laríngea e estase indicou que os pacientes com ausência de sensibilidade tiveram estase para saliva, líquido e principalmente para purê e sólido. Conclusões: Portadores de MG apresentam alterações de voz e deglutição relacionadas à doença. A disfonia causa um impacto na vida do paciente com diagnóstico de MG. As alterções da deglutição estiveram presentes em pacientes com acometimento generalizado e maior evolução da doença Introduction: Myasthenia gravis (MG) is an autoimmune disease characterized by a reduction in the strength of the voluntary muscles, aggravated by effort, with the possibility of developing with voice and deglutition disorders. Objective: Characterize the laryngeal manifestations of MG. Methods: A tranversal study was carried out by evaluating 37 patients with MG in the period between May 2015 and November 2016. Patients were recruited in the Neurology outpatient center at the Hospital das Clínicas, \"Faculdade de Medicina, Universidade de São Paulo\". Besides clinical and demographic data, all patients were analyzed according to the Vocal Disadvantage Index-10 (VDI-10), auditory-perceptual voice analysis, videolaryngostroboscopy and videoendoscopy of swallowing. Results: In the voice evaluation, dysphonia was identified in 89.2% of patients, 59.5% with a discreet degree and 29.7% from moderate to severe. Self-perception of the vocal disadvantage was significantly greater in patients diagnosed with some degree of dysphonia. Anatomical changes were identified in 8 patients through viodeolaryngostroboscospy. When comparing the degree of the disease with the variables pharyngeal contraction and laryngeal sensitivity in the VED, a greater incidence in patients with a more advanced disease and bulbar involvement was noticed. The association between the changes in laryngeal sensitivity and stasis showed that patients with a lack of sensitivity had stasis for saliva, liquid and mainly for purée and solids. Conclusions: MG patients present changes in voice and deglutition related to the disease. Dysphonia causes a great impact in the life of the patient diagnosed with MG. Changes in deglutition were present in patients with generalized involvement and greater progression of the disease

O objetivo do trabalho foi determinar o pHi, a capacidade tamponante do citosol na ausência de CO2/HCO3- (βi) de neurônios dos gânglios das raízes dorsais e investigar a expressão de trocadores Na+/H+ e sua função na regulação do pHi. O pHi foi estimado com o indicador fluorescente BCECF. A operação do trocador era quantificada na recuperação da acidose intracelular induzida experimentalmente. Na ausência do tampão CO2/HCO3- a taxa de alcalinização (k) deve-se, por hipótese, ao transporte de H+ pelo trocador. A hipótese foi confirmada pela ação de agentes farmacológicos, e.g., amiloride. Em soluções tamponadas por CO2/HCO3- as células tem pHi de 7,24 e, em soluções tamponadas com HEPES, 7,04. A βi foi de 8,17 mM/pH. As células se recuperam da acidose com k médio de 0,0138 s-1. O efeito inibitório do amiloride em concentração de 1 mM deve-se ao fato dos fenótipos celulares expressarem diferentes isoformas do trocador. Segundo RT-PCR, todas as 5 isoformas do trocador são expressas e a quantidade de RNAm, avaliada por qPCR, é maior para a NHE1, seguida de NHE5. The objective here was to determine intracellular pH (pHi), cytosolic buffering power in CO2/HCO3- free medium (βi) of neurons from dorsal root ganglia and to investigate the functional expression of the Na+/H+ exchangers in the regulation of pHi. pHi was estimated with fluorescence indicator BCECF. Exchanger operation was quantified during recovery from intracellular acidification induced experimentally. In CO2/HCO3- free medium the alkalinization rate (k) is due, hypothetically, H+ extrusion by the exchanger. This assumption was confirmed by action of pharmacologic agents, e.g., amiloride. In medium buffered with CO2/HCO3- cells have pHi of 7.24 and, in medium buffered with HEPES, 7.04. βi calculated was 8.17 mM/pH. Cells recovery from acidosis with mean k of 0.0138 s-1. Inhibitory effect of amiloride in 1 mM concentration is due to cellular phenotypes expressing different Na+/H+ exchanger isoforms. According to RT-PCR, all the five exchanger isoforms are expressed and mRNA quantity, evaluated by qPCR, is greater to NHE1, followed by NHE5.

A doença renal policística autossômica dominante (DRPAD) constitui-se na enfermidade humana monogênica com risco de óbito mais frequente, responsabilizando-se por 4,4 a 10,0% dos casos de doença renal terminal em diferentes populações. Na quase totalidade dos pacientes, a doença é causada por mutação em um de dois genes: PKD1 (polycystic kidney disease 1) ou PKD2 (polycystic kidney disease 2). Tais genes codificam, respectivamente, as proteínas policistina-1 (PC1) e policistina-2 (PC2). Mutações em PKD1, por sua vez, respondem pela ampla maioria dos casos de DRPAD. Camundongos haploinsuficientes para Pkd1 (Pkd1+/-), o gene ortólogo a PKD1 neste animal, consistem num modelo não cístico de deficiência de atividade deste gene. Em um estudo anterior, mostramos que animais Pkd1+/- apresentam lesão renal mais severa que camundongos selvagens (Pkd1+/+) quando submetidos a isquemia/reperfusão (I/R) renal. Esse estudo sugeriu, portanto, que a capacidade de regeneração renal pós-I/R esteja prejudicada em camundongos Pkd1+/- e em pacientes com DRPAD. O insulto por I/R constitui-se em uma causa importante de indução de estresse de retículo endoplasmático (ER), podendo ativar as vias UPR (unfolded protein response) e ERAD (ER-associated degradation). Além disso, a ativação de vias envolvidas no ER determinado por I/R exerce um efeito de agravamento da lesão decorrente deste insulto. O ER pode, ainda, ativar e ser induzido pela resposta inflamatória. Estudos prévios revelaram que as policistinas também se relacionam com este processo. A expressão de PC2 pode ser superregulada pela ativação de um dos braços da via UPR, enquanto a ativação da via ERAD estimula sua degradação. A superexpressão de XBP1, por sua vez, atenua o fenótipo cístico em camundongos deficientes em Pkd1, revelando que a ativação da via UPR pode mitigar a formação cística. Para analisar a relação entre ER e suscetibilidade aumentada a I/R na deficiência de Pkd1, avaliamos diferentes marcadores de ER em camundongos Pkd1+/- e Pkd1+/+ submetidos a um insulto leve por I/R renal associado a 32 min de isquemia. A razão de expressão renal dos mRNAs Xbp1s/Xbp1u mostrou-se menor em camundongos Pkd1+/- que Pkd1 +/+ 48 h após I/R, enquanto a expressão proteica de XBP1s foi maior em rins Pkd1+/- comparados a Pkd1+/+ após o insulto. Não detectamos diferença na expressão renal do gene Hspa5 e de seu produto BIP/GRP78, assim como na expressão de Ddit3, gene que codifica CHOP, após intervenção sham e após I/R. Também não observamos diferenças entre os níveis renais e séricos de IL1beta, IL6, IL10, TNFalfa e RANTES entre camundongos Pkd1+/- e Pkd1+/+ pós-procedimento sham e pós-I/R, embora tendências não significantes de elevação de MCP1 tenham sido detectadas nos rins submetidos ao insulto para ambos os genótipos. As variações em sentidos opostos de XBP1s e Xbp1s/Xbp1u determinadas por I/R em rins Pkd1+/- são consistentes com uma maior suscetibilidade destes animais à indução de ER. Esses achados sugerem que a indução de ER em resposta a um insulto leve por I/R possa aumentar a atividade de PC1 e exercer um efeito de atenuação sobre a maior suscetibilidade de camundongos deficientes em Pkd1 a I/R renal Autosomal dominant polycystic kidney disease (ADPKD) is the most common life-threatening monogenic disease in humans, accounting for 4.4 to 10.0% of the end-stage kidney disease cases in different populations. In almost all patients, this disorder is caused by a mutation in one of two genes: PKD1 (polycystic kidney disease 1) or PKD2 (polycystic kidney disease 2). These genes encode, respectively, the proteins polycystin-1 (PC1) and polycystin-2 (PC2). Mutations in PKD1, in turn, are responsible for the large majority of ADPKD cases. Pkd1- haploinsufficient mice (Pkd1+/-), the gene orthologous to PKD1 in this animal, constitute a noncystic model of this gene\'s deficiency. In a previous study, we showed that Pkd1+/- animals develop a more severe renal injury than wild-type mice (Pkd1+/+) when submitted to renal ischemia/reperfusion (I/R). This study suggested, therefore, that the capacity of renal regeneration following I/R is impaired in Pkd1+/- mice and in ADPKD patients. The I/R insult is an important cause of endoplasmic reticulum stress (RS) induction, potentially leading to activation of the UPR (unfolded protein response) and ERAD (ER-associated degradation) pathways. The activation of pathways involved in RS determined by I/R exerts an aggravating effect on the injury resulting from the insult. In addition, RS can activate and be induced by the inflammatory response. Previous studies revealed that polycystins also relate to this process. PC2 expression can be upregulated by the activation of one of the UPR pathway branches, while activation of the ERAD pathway stimulates its degradation. XBP1 overexpression, in turn, attenuates the cystic phenotype in Pkd1-deficient mice, revealing that activation of UPR can mitigate cyst formation. To analyze the relationship between RS and the increased susceptibility to I/R associated to Pkd1 deficiency, we evaluated different RS markers in Pkd1+/- and Pkd1+/+ mice submitted to a mild I/R insult determined by 32-min ischemia. The renal expression ratio of mRNA Xbp1s/Xbp1u was lower in Pkd1+/- than Pkd1+/+ mice 48 h after I/R, while the XBP1s protein expression was higher in Pkd1+/- compared to Pkd1+/+ kidneys after the insult. We have not detected differences in renal expression of the Hspa5 gene and its product BIP/GRP78, as well as in Ddit3 expression, the gene that encodes CHOP, postsham intervention and post-I/R. We have also not observed differences in the renal and serum levels of IL1beta, IL6, IL10, TNFalfa and RANTES between Pkd1+/- e Pkd1+/+ mice post-sham procedure and post-I/R, although non-significant trends of MCP1 increase have been detected in kidneys submitted to the insult for both genotypes. The variations in different directions of XBP1s and Xbp1s/Xbp1u induced by I/R in Pkd1+/- kidneys are consistent with a higher susceptibility of these animals to RS induction. These findings suggest that the RS induction in response to a mild I/R insult can increase PC1 activity and exert an attenuating effect on the increased susceptibility of Pkd1-deficient mice to renal I/R

O objetivo desse estudo foi avaliar o efeito do tratamento com a aldosterona (Aldo), por 21 dias, sobre a função e a morfologia renal de ratos, procurando correlacionar as alterações com a expressão do EGFR e da ERK1/2 fosforilados. A Aldo não alterou os parâmetros fisiológicos, a PA e a função renal dos ratos, mas verificou-se uma tendência para o aumento das concentrações plasmáticas de K+. No córtex e na medula renal, a Aldo aumentou a expressão do EGFR e da ERK1/2 fosforilados, sendo que este efeito foi abolido pelo tratamento concomitante com a espironolactona ou o RU 486 (antagonistas dos receptores da Aldo). O tratamento hormonal também induziu um aumento na marcação imuno-histoquímica para essas proteínas no córtex e medula; contudo, este efeito foi reduzido, principalmente, com o tratamento conjunto com a espironolactona. Observou-se um aumento na área glomerular e na porcentagem da área intersticial, após o tratamento com a Aldo. As alterações na morfometria renal foram parcialmente reduzidas pelo tratamento com a espironolactona ou o RU 486. Esses resultados indicam que a Aldo pode induzir alterações morfológicas no rim, aparentemente, de maneira dependente dos receptores MR e GR e da via do EGFR-ERK1/2, mas sem o comprometimento da função renal. The purpose of this study was to evaluate the effect of 21 days of treatment with aldosterone (Aldo) in the renal function and morphology of rats, correlating changes with the expression of EGFR and ERK1/2 phosphorylated. The Aldo did not alter physiological parameters, blood pressure and renal function of rats, but there was a tendency to increased K+ plasma concentrations. In renal cortex and medulla, Aldo increased the expression of EGFR and ERK1/2 phosphorylated and this effect was abolished by treatment Aldo plus spironolactone or RU 486 (Aldo receptor antagonists). Hormonal treatment also induced an increase in immunohistochemical staining for these proteins in the cortex and medulla; however, this effect was limited mainly to treatment Aldo plus spironolactone. There was an increase in glomerular area and the percentage of interstitial area after treatment with Aldo. Changes in renal morphology were partially reduced by treatment Aldo plus spironolactone or RU 486. These results indicate that Aldo may induce morphological changes in the kidney of dependent manner of MR and GR receptors and EGFR-ERK1/2 signaling, but without the impairment of renal function.

O parálogo 3 do trocador Na+/H+ (NHE3) é essencial para a reabsorção de HCO3- nos túbulos proximais renais e sua expressão e função adaptam-se às diferentes condições ácido-base do organismo. O objetivo desta tese foi avaliar quais as diferenças entre os efeitos da acidose metabólica (AM) e respiratória (AR) sobre a regulação do NHE3 e identificar variáveis responsáveis pelas respostas adaptativas observadas. Em células OKP, a AM foi simulada diminuindo a [HCO3-] do meio de cultura e a AR aumentando a pCO2 ambiente por 24 h. Foram observados os efeitos das acidoses sobre o RNAm-Nhe3, a presença da proteína-NHE3 na membrana celular e a atividade promotora do gene do Nhe3. Concluiu-se que o pH extracelular não é a variável físico-química responsável por estimular a expressão do NHE3, contudo é um importante candidato à variável responsável por regular o tráfego da proteína para a membrana. Além disso, a região de -471 a -153 pb em relação ao sítio de início de transcrição do promotor do gene do Nhe3 contém prováveis reguladores positivos que atuam em resposta à AM. The Na+/H+ exchanger 3 (NHE3) is essential for HCO3- reabsorption in renal proximal tubules and its expression and function must adapt to acid-base conditions. The goal of the presente study was to evaluate whether there are differences between metabolic (MA) and respiratory acidosis (RA) with regard to NHE3 modulation and to identify variables that may trigger these distinct adaptive responses. In OKP cells, MA was achieved by lowering [HCO3-] in the cell culture medium and RA by increasing pCO2 in the incubator chamber for 24 h. The effects of both acidosis on Nhe3 mRNA levels, cell-surface NHE3 expression and promoter activity were evaluated. In summary, it was concluded that low extracellular pH is not the physical-chemical variable that up-regulates NHE3 expression, however, extracellular pH is a candidate for the variable related to the NHE3 displacement to the apical membrane. Moreover, the Nhe3 gene promoter region spanning from -471 to -153 base pairs upstream from the transcriptional start site contains putative enhancers regulated in response to MA.

Os receptores medeiam a maioria das respostas fisiológicas em resposta a diversidade de estímulos. A ativação da sinalização mediada pelo receptor de angiotensina II tipo 1 é o principal responsável pelos efeitos do hormônio angiotensina II (Ang II) nos tecidos alvo. No rim concentrações fisiológicas de Ang II aumentam a atividade no túbulo proximal da isoforma 3 do trocador de Na+/H+ (NHE3). Este efeito é crucial para a manutenção do volume extracelular e pressão arterial. Evidências recentes mostraram que a ativação seletiva da sinalização enviesada da beta-arrestina/ receptor AT1 induz diurese e natriurese independentemente da sinalização via proteína G. Neste estudo testamos a hipótese de que a sinalização enviesada do receptor AT1/ beta-arrestina inibe a atividade do NHE3 no túbulo proximal, bem como investigar os possíveis mecanismos moleculares que medeio este efeito. Para tal, nós determinamos os efeitos do composto TRV120023, que se liga ao receptor AT1, bloqueando o acoplamento da proteína G e estimulando a sinalização da beta-arrestina, na função do NHE3 in vivo e in vitro. A atividade do NHE3 foi medida quer em túbulo proximal nativo, por meio de microperfusão estacionária, bem como em uma linha celular de túbulo proximal de gamba (OKP), por meio de recuperação de pH intracelular dependente de Na+. Os nossos resultados mostram que o TRV120023 na concentração de 10-7 M inibe marcadamente a atividade do NHE3 em túbulo proximal quer in vivo quer in vitro, sendo que este efeito é completamente abolido nas células silenciadas para a beta-arrestina 1 e 2 através de RNA de interferência. Adicionalmente, a estimulação do NHE3 pela Ang II é completamente suprimida pelo TRV120023 quer in vivo quer in vitro. A inibição do NHE3 pelo TRV120023 foi associada com a diminuição do NHE3 expresso na superfície da membrana plasmática em células OKP e com a redistribuição entre o corpo e a base das microvilosidades em túbulo proximal de rato. A diminuição do NHE3 na superfície da membrana plasmática em células OKP estava associado com um aumento na internalização do NHE via endocitose mediada por clatrina. A inibição do NHE3 mediada pela beta-arrestina não envolve a sinalização do receptor AT2, cAMP/ PKA, Akt e ERK1/2. Estes achados indicam que a sinalização enviesada do receptor AT1/beta-arretina inibe a atividade do NHE3 em túbulo proximal, pelo menos em parte, devido a alterações na localização subcelular do NHE3 Cell surface receptors mediate most of our physiological responses to an array of stimulus. The triggering of the angiotensin II type I (AT1) receptor signaling is the major control point in the regulation of the ultimate effects of the peptide hormone angiotensin II (Ang II) on its target tissue. In the kidney physiological concentrations of Ang II upregulate the activity of proximal tubule Na+/H+ exchanger isoform 3 (NHE3). This effect is crucial for maintenance of extracellular fluid volume homeostasis and blood pressure. Recent findings have shown that selective activation of the betaarrestin-biased AT1 receptor signalingpathway induces diuresis and natriuresis independent of G-protein mediated signaling. This study tested the hypothesis that activation of this AT1 receptor/beta-arrestin signaling inhibits NHE3 activity in proximal tubule as well as investigate the underlying molecular mechanisms mediating this effect. To this end, we determined the effects of the compound TRV120023, which binds to the AT1R, blocks G protein coupling, and stimulates beta-arrestin signaling, on NHE3 function in vivo and in vitro. NHE3 activity was measured in both native proximal tubules, by stationary microperfusion, and in opossum proximal tubule (OKP) cells, by Na+-dependent intracellular pH recovery. Our results showed that 10-7 MTRV120023 remarkably inhibited proximal tubule NHE3 activity both in vivo and in vitro, and the effect was completely abolished in OKP cells silenced for beta-arrestin 1 and 2 by small interference RNA. Additionally, stimulation of NHE3 by Ang II was completely suppressed by TRV120023 both in vivo as well as in vitro. Inhibition of NHE3 activity by TRV120023 was associated with a decrease in NHE3 surface expression in OKP cells and with a redistribution from the body to the base of the microvilli in the rat proximal tubule. The decreased surface NHE3 in OKP cells was associated with an increase in NHE3 internalization via clathrin mediated endocytic. Beta-arrestin mediated NHE3 inhibition did not involve AT2 receptor, cAMP/ PKA, Akt and ERK1/2 signaling. These findings indicate that biased signaling of the AT1 receptor/beta-arrestin pathway inhibits NHE3 activity in the proximal tubule at least in part due to changes in NHE3 subcellular localization

A vasculopatia crônica do transplante constitui um dos principais obstáculos para o sucesso do transplante de órgãos a longo prazo. Caracteriza-se pela formação de uma camada neoíntima, que culmina no estreitamento da luz do vaso com consequente isquemia e falência do órgão transplantado. Embora diversos mecanismos imunológicos tenham sido descritos, a patogênese da vasculopatia crônica do transplante ainda não foi esclarecida e continua sem tratamento específico. Neste contexto, estratégias com alvos imunomodulatórios são de extrema importância. Dentre estas possíveis estratégias destaca-se a talidomida, uma droga que apresentada potentes propriedades anti-inflamatórias e imunomodulatórias e que recentemente voltou a ter indicações clínicas. Assim, os objetivos do presente estudo foram: 1) Padronizar o modelo experimental de vasculopatia crônica do transplante no modelo experimental de transplante de aorta, pois este modelo mimetiza as principais características observadas na parede do vaso durante o processo de rejeição; 2) Analisar o efeito da talidomida sobre as alterações morfológicas vasculares (histologia para Verhoeff), componentes celulares (expressão de a-actina, atividade proliferativa, número de macrófagos e linfócitos T, através de imuno-histoquímica), além da participação da apoptose (técnica de TUNEL); 3) Avaliar o potencial efeito anti-inflamatório e imunomodulador da talidomida neste modelo, através da análise da expressão de mediadores da resposta imune (TNF-a, IL-1b, IL-6, IL-2, INF-g, IL-4 e IL-10), bem como a atividade do NFkB e o envolvimento das subunidades p50 e p65 no enxerto vascular. Foram utilizados ratos machos das linhagens isogênicas específicas, Fisher 344 e Lewis, distribuídos em 3 diferentes grupos (32 por grupo): ISO (transplante isogênico de aorta, Fisher para Fisher); ALO (transplante alogênico de aorta, Fisher para Lewis); ALO+TALID (transplante alogênico de aorta tratado com talidomida (200mg/Kg/dia/gavagem)). Os animais foram acompanhados por um período de 30 dias e, em seguida, sacrificados. Os resultados obtidos demonstraram que a padronização do modelo experimental de transplante de aorta foi viabilizada dentro de uma sequência metodológica extremamente precisa e reprodutível. Como esperado, os animais do grupo ISO não apresentaram sinais de rejeição no enxerto vascular, mantendo íntegra a arquitetura das camadas do vaso. Por outro lado, animais do grupo ALO desenvolveram vasculopatia crônica do transplante caracterizada pelo espessamento das camadas íntima e adventícia. Na camada média evidenciou-se diminuição das VSMC e acentuado rompimento das fibras elásticas. Além disso, os animais do grupo ALO apresentaram aumento da expressão de a-actina acompanhada de intensa atividade proliferativa celular, particularmente nas camadas neoíntima e adventícia, provavelmente pela migração das VSMC para a camada íntima. A análise por IH revelou intenso infiltrado de macrófagos, linfócitos T, além de apoptose presente em todas as camadas do aloenxerto. A expressão gênica e a concentração tecidual dos mediadores da resposta imune TNF-a, IL-1b, IL-6, IL-2, INF-g e IL-10 também foram significativamente aumentadas no grupo ALO. Esses achados associaram-se com a ativação do NFkB, bem como o envolvimento dos dímeros p50 e p65. O tratamento com talidomida promoveu um efeito vasculoprotetor através da redução da camada neoíntima e da inflamação local. Além disso, induziu diminuição da expressão gênica e da concentração tecidual dos mediadores TNF-a, IL-1b, IL-6, IL-2, INF-g, bem como aumento da IL-4 e IL-10. A talidomida também diminuiu a ativação do NFkB. Conclusão: os resultados do presente estudo indicam que o modelo experimental de vasculopatia crônica do transplante constitui um modelo adequado para estudar as alterações nas camadas do vaso durante o processo de rejeição ao aloenxerto. A talidomida exerceu um efeito vasculoprotetor, atenuando a formação da neoíntima e do processo inflamatório local, bem como dos mediadores da resposta imune, provavelmente devido as suas propriedades anti-inflamatórias e imunomodulatórias Chronic transplant vasculopathy is a major obstacle for the long-term success of organ transplantation. It is characterized by the formation of neointimal layer that culminate in the narrowing of the vessel lumen with consequent ischemia and failure of the transplanted organ. Although several immunological mechanisms have been described, the pathogenesis of chronic transplant vasculopathy remains unclear and continues without specific treatment. In this context, immunomodulatory strategies are extremely important. Among these possible strategies stands out thalidomide, a drug that display a potent antiinflammatory and immunomodulatory properties and recently have returned to clinical indications. The aims of this study were: 1) To standardize the experimental model of chronic transplant vasculopathy, induced in an experimental model of aortic transplantation, because this model mimics the key features observed in the vessel wall during the rejection process; 2) To analyze the effects of thalidomide on vascular morphological (Verhoeff staining), cellular components (a-actin expression, proliferative activity, number of macrophages and T lymphocytes by immunohistochemistry), and the participation of apoptosis (TUNEL assay); 3) To evaluate the antiinflammatory and immunomodulatory potential effects of thalidomide in this model by analyzing the mediator expression of the immune response (TNF-a, IL-1b, IL-6, IL-2, INF-g, IL-4 e IL-10), as well as the NFkB activity and involvement of p50 and p65 subunits in the vascular graft. We used male rats from the specific inbred strains, Fisher 344 and Lewis, divided into 3 different groups (32 per group). ISO (isogeneic aortic transplantation, Fisher to Fisher); ALO (allogeneic aortic transplantation, Fisher to Lewis); ALO+THALID (allogeneic aortic transplantation treated with thalidomide (200mg/Kg/day/gavage)). The animals were followed during a period of 30 days and then sacrificed. The results showed that the standardizing of the experimental model of aortic transplantation was possible within a sequence highly accurate and reproducible methodology. As expected, the animals of the ISO showed no sign of graft rejection keeping the entire layered architecture of the vessel. On the other hand, the ALO group developed chronic transplant vasculopathy characterized by thickness of the intima and adventitia. Furthermore, ALO group animals showed increase of a-actin expression accompanied by an intense cellular proliferative activity, particularly in the neointima and adventitia layers, probably due to VSMC migration to the intima. Analysis by IH revealed intense infiltration of macrophages and T lymphocytes, as well as apoptosis in all layers of the allograft. The gene expression and tissue concentrations of the mediators of immune response TNF-a, IL-1b, IL-6, IL-2, INF-g, and IL-10 were also significantly higher in the ALO group. These findings were associated with the NFkB activation, as well as the involvement of p50 and p65 dimers. Treatment with thalidomide promoted a vascular protective effect by reducing the neointimal formation and local inflammation. Moreover, induced a decrease in the gene expression and tissue concentration of the inflammatory mediators TNF-a, IL-1b, IL-6, IL-2, INF-g, as well as increase of IL-4 and IL-10. Thalidomide also decreased the NFkB activation. Conclusion: the results of this study indicate that experimental model of chronic transplant vasculopathy is an appropriate model to study changes in the vessel layers during the process of allograft rejection. Thalidomide promoted a vascular protective effect, attenuating neointimal formation and local inflammation, as well as mediators of immune response, probably due to its anti-inflammatory and immunomodulatory properties

Sabe-se que algumas alterações nutricionais maternas durante o período perinatal estão associadas com doenças metabólicas na vida adulta das proles, tais como diabetes melito tipo 2, resistência à insulina, obesidade e hipertensão arterial. O período da gestação em que estas alterações nutricionais influenciam a prole na idade adulta ainda não está elucidado. Modificações epigenéticas têm sido propostas como mecanismos responsáveis por estas desordens metabólicas. Ratas Wistar de doze semanas de idade foram alimentadas com dieta com conteúdo baixo (HO - 0,15% NaCl) ou normal (NR - 1,3% NaCl) de sódio desde o primeiro dia de gestação até o nascimento da prole ou HO durante a primeira (HO10) ou segunda (HO20) metade da gestação. O peso corpóreo e a ingestão de água e ração foram avaliados semanalmente durante a gestação. Teste de tolerância à insulina (ITT) e à glicose (GTT) e HOMA-IR foram realizados nas proles adultas. Expressão gênica por qRT-PCR e metilação do DNA na região promotora dos genes foram mapeadas utilizando tratamento com bissulfito de sódio e avaliadas por pirosequenciamento. O ganho de peso materno foi menor no HO e HO20 na terceira semana de gestação em comparação com NR e HO10. O peso ao nascimento da prole foi menor em machos e fêmeas dos grupos HO e HO20 em relação ao NR e HO10. O HOMA-IR foi maior nos machos com 12 semanas de idade do grupo HO em comparação com NR e com 20 semanas de idade do grupo HO10 em comparação com NR e HO20. Nas fêmeas com 12 semanas de idade o HOMA-IR foi maior no HO10 comparado com HO. Os níveis de insulina no soro foram maiores tanto nos machos com 20 semanas de idade do grupo HO10 comparado com NR quanto nas fêmeas com 12 semanas de idade do grupo HO10 comparado com HO. A área sob a curva do GTT indicou intolerância à glicose nos machos do grupo HO. A porcentagem de metilação das ilhas CpG no promotor dos genes de Igf1, Igf1r, Ins1, Ins2 e Insr no fígado de machos e fêmeas neonatais e no fígado, tecido adiposo branco e músculo em machos com 20 semanas de idade foi influenciada pela baixa ingestão de sal durante a gestação. Nenhuma destas alterações foi identificada nas fêmeas com 20 semanas de idade. Em conclusão, a baixa ingestão de sal na segunda metade da gestação é responsável pelo baixo peso ao nascimento em ambos os sexos. A intolerância à glicose observada na prole adulta ocorreu somente se a dieta hipossódica é dada durante a gestação inteira. Por outro lado, a resistência à insulina em resposta ao consumo de dieta hipossódica durante a gestação está relacionada com o momento em que ocorre este insulto e com o envelhecimento da prole. Também foi observado que alterações na metilação do promotor do gene Igf1 está correlacionado com o baixo peso ao nascimento em resposta a ingestão de dieta hipossódica durante a gestação It is known that some maternal nutritional alterations during pregnancy are associated with metabolic disorders in adult offspring, such as insulin resistance, type 2 diabetes mellitus, obesity and arterial hypertension. The period of pregnancy in which these nutritional alterations influence adult offspring remains uncertain. Epigenetic changes are proposed to underlie these metabolic disorders. Twelve-week-old female Wistar rats were fed a low-salt (LS - 0.15% NaCl) or normal-salt (NS - 1.3% NaCl) diet since the first day of gestation until delivery or LS during the first (LS10) or second (LS20) half of gestation. Body weight, food and water intake were weekly evaluated during gestation. Blood glucose, insulin (ITT) and glucose (GTT) tolerance tests, HOMA-IR were performed in adult offspring. Gene expression and DNA methylation were mapped using bisulfite treatment evaluated by pyrosequencing in the male and female neonates and adult offspring. Weight gain was lower in LS and LS20 dams than in NS and LS10 dams in the third week of pregnancy. Birth weights were lower in male and female LS20 and LS rats compared with NS and LS10 neonates. HOMA-IR was higher in 12-week-old LS males compared with NS and in 20-week-old male LS10 rats compared with NS and LS20 rats. In 12-week-old LS10 females, HOMA-IR was higher than in LS. Serum insulin levels were higher in 20 week-old LS10 male compared with NS rats and in 12-week-old LS10 female compared to LS rats. The area under the curve of GTT indicated glucose intolerance in 12- and 20-week-old LS male. Methylation of CpG islands of the Insr, Igf1, Igf1r, Ins1 and Ins2 genes in liver in neonates male and female offspring and liver, white adipose tissue and muscle in 20-week-old male offspring were influenced by low-salt intake during pregnancy. None of these alterations was identified in 20-week-old females. In conclusion, low-salt diet consumption in the second half of pregnancy can result in low birth weights in the males and females offspring. Glucose intolerance observed in adult offspring occurred only if low salt intake was given throughout pregnancy. However, insulin resistance in response to low salt intake during pregnancy is related to the time at which this insult occurs and to the age of the offspring. Alterations in the DNA methylation of Igf1 were observed to be correlated with low birth weight in response to low salt feeding during pregnancy

O complexo esclerose tuberosa (CET) e as doenças renais policísticas autossômica dominante (DRPAD) e autossômica recessiva (DRPAR) são doenças monogênicas associadas a cistogênese renal. Os produtos dos genes mutados nessas enfermidades, respectivamente tuberina e hamartina para CET, policistina-1 (PC1) e policistina-2 para DRPAD, e poliductina/fibrocistina para DRPAR, modulam proliferação, diferenciação, apoptose, crescimento e/ou migração celular. Neste estudo empregamos um sistema tridimensional de cultura de células IMCD para caracterizar os perfis de expressão dessas proteínas durante a tubulogênese. Usando uma matriz de colágeno tipo I/Matrigel e fator de crescimento de hepatócito (HGF), a formação de estruturas alongadas se iniciou dois dias após o plaqueamento in vitro (2 DIV), ao passo que o desenvolvimento de lúmen ocorreu entre 10-14 DIV. A marcação para caspase-3 ativa foi mais intensa nas fases iniciais da tubulogênese, enquanto a marcação para Ki-67 foi uniformemente pronunciada em estágios mais tardios. A tuberina e a hamartina apresentaram expressão citoplasmática e co-localização acentuada em 6 e 12 DIV. A PC1 apresentou maior expressão nas porções ramificadas dos túbulos que nas não ramificadas no 12 DIV, um padrão não verificado para a PC2. Estas proteínas exibiram expressão citoplasmática, assim como expressão ocasional e pontual na membrana plasmática. PD1 também apresentou expressão citoplasmática. Nossos dados sugerem que a apoptose e a ciclagem celular sincrônica durante a tubulogênese in vitro são mais acentuadas, respectivamente, em fases mais precoces e mais tardias da formação tubular. Nossos achados demonstram, além disso, que as proteínas relacionadas ao CET e às DRPs são expressas in vitro durante a tubulogênese, apoiando um papel importante para a interação tuberina-hamartina na formação tubular, e são consistentes com o padrão de expressão diferencial da PC1 observado durante a nefrogênese Tuberous sclerosis complex (TSC) and autosomal dominant and recessive polycystic kidney diseases (ADPKD and ARPKD) are monogenic diseases associated with renal cystogenesis. The products of the genes mutated in these disorders, respectively tuberin and hamartin for TSC, and polycystin-1 (PC1), polycystin-2 (PC2) and polyductin/fibrocystin (PD1) for PKD, modulate cell proliferation, differentiation, apoptosis, growth and/or migration. We have employed an IMCD tridimensional cell culture system to characterize their expression profiles along tubulogenesis. Using a type I collagen/Matrigel matrix and hepatocyte growth factor (HGF), the formation of elongated structures initiated 2 days after in vitro plating (2 DIV) while lumen developed between 10-14 DIV. Active caspase-3 labeling was more intense in initial phases of tubulogenesis while Ki-67 staining was uniformly pronounced in later stages. Tuberin and hamartin showed cytoplasmic expression and marked co- localization at 6 and 12 DIV. PC1 displayed higher expression in branching than non- branching portions of the tubules at 12 DIV, a pattern not verified for PC2. These proteins presented cytoplasmic and occasional, punctate membrane expression. PD1 also showed cytoplasmic expression. Our data suggest that apoptosis and synchronous cell cycling during in vitro tubulogenesis are more remarkable, respectively, in early and later steps of tubule formation. In addition, our findings demonstrate that the TSC and PKD proteins are expressed in vitro during tubulogenesis, supporting an important role for tuberin-hamartin interaction in tubular formation, and are consistent with the differential PC1 expression pattern observed during nephrogenesis

O desenvolvimento de hipertensão arterial (HAS) ocorre dez anos mais cedo em pacientes com doença renal policística autossômica dominante (DRPAD) comparados à população geral, estando presente em ~60% dos indivíduos afetados antes da perda de função renal. Déficit de concentração renal também se constitui em um achado precoce nesses pacientes. Atualmente se propõe que o sistema renina angiotensina desempenhe um papel central na HAS relacionada à DRPAD, enquanto diferentes explicações têm sido levantadas para justificar o defeito de concentração. Realizamos um cruzamento envolvendo um alelo floxed de Pkd1 com uma linhagem com expressão de nestina-Cre, de modo a gerar camundongos machos císticos viáveis (Pkd1cond/cond:Balcre, CI) com TFG preservada. Estes animais foram avaliados sistematicamente para uma série de parâmetros renais funcionais, morfológicos, celulares e moleculares. Análises paralelas foram conduzidas em camundongos haploinsuficientes para Pkd1 (Pkd1+/-, HT), os quais não desenvolvem cistos renais visíveis. Camundongos CI mostraram-se significantemente hipertensos na idade de 10-13 semanas, um fenótipo não observado em controles não císticos (Pkd1cond/cond, NC) e em animais haploinsuficientes para Pkd1. As frações de excreção de Na+ e K+ mostraram-se reduzidas e a concentração sérica de uréia discretamente elevada em camundongos CI, sugerindo reabsorção tubular de solutos aumentada. A expressão gênica de angiotensinogênio foi significantemente maior em rins CI que NC, enquanto análises imunoistoquímicas revelaram expressão da enzima conversora de angiotensina e do receptor AT1 em epitélio cístico renal. A excreção urinária de NO2 também se mostrou diminuída em camundongos CI, acompanhando-se de taxas aumentadas de proliferação celular e apoptose renais. A osmolalidade urinária máxima foi mais baixa em animais CI, um déficit não encontrado nos controles HT e NC. Interessantemente, uma tendência de níveis plasmáticos mais elevados de vasopressina foi observada em camundongos CI. Tomados em conjunto, esses resultados apoiam a hipótese de que a formação e o crescimento de cistos desempenham um papel importante no desenvolvimento de HAS na DRPAD e de que a ativação do sistema renina-angiotensina intrarrenal constitui-se em um mecanismo fundamental nesse processo. Nossos achados também sugerem fortemente que a expansão cística seja essencial para o desenvolvimento do déficit de concentração renal nessa doença, e são consistentes com a existência de áreas focais de compressão vascular e perfusão diminuída em rins com DRPAD. Hypertension (SAH) develops ten years earlier in autosomal dominant polycystic kidney disease (ADPKD) patients compared with the general population, being present in ~60% of affected individuals before the loss of renal function. Renal concentrating deficit is also an early finding in these patients. It has been proposed that the renin-angiotensin system plays a central role in ADPKD-related SAH, while different explanations have been raised to justify the concentrating impairment. We bred a floxed allele of Pkd1 with a nestin Cre expressing line to generate viable, adult male cystic mice (Pkd1cond/cond:Balcre, CY) with preserved GFR. These animals were systematically evaluated for a series of renal functional, morphological, cellular and molecular parameters. Parallel analyses were carried out in Pkd1-haploinsuficient mice (Pkd1+/-, HT), which do not develop visible renal cysts. CY mice were significantly hypertensive by 10-13 weeks of age, a phenotype not seen in non-cystic controls (Pkd1cond/cond, NC) and Pkd1-haploinsufficient animals. The fractional excretion of Na+ and K+ were reduced and SUN slightly elevated in the CY mice, suggesting increased tubular solute reabsorption. Angiotensinogen gene expression was significantly higher in CY than NC kidneys, whereas immunohistochemical analyses revealed angiotensin-converting enzyme and AT1 receptor expression in renal cyst epithelia. Urine excretion of NO2 was also diminished in CY mice, along with increased rates of renal cell proliferation and apoptosis. Maximum urine osmolality was decreased in CY animals, a deficit not found in HT and NC controls. Interestingly, a trend toward increased serum vasopressin levels was observed in the CY mice. Taken together these results support the hypothesis that cyst formation and growth play an important role in the development of SAH in ADPKD and that activation of the intrarenal reninangiotensin system is a fundamental mechanism in this process. Our findings also strongly suggest that renal cyst expansion is essential for the development of renal concentrating deficit in this disease, and are consistent with the existence of focal areas of vascular compression and reduced perfusion in ADPKD kidneys.

Introdução: A doença renal crônica continua sendo um desafio no campo da pesquisa médica. Atualmente um interesse crescente tem surgido no intuito de avaliar o potencial de células tronco em retardar o avanço de doenças crônicas progressivas. Material e Métodos: Para determinar o efeito dessas células em um modelo de progressão de doença renal crônica foram usadas células linhagem negativa (Lin ) separadas magneticamente e injetadas em ratos submetidos à injúria renal. Ratos singênicos Fischer 344 foram submetidos à nefrectomia 5/6 (Nx) e divididos em 3 grupos: Nx (não tratados); NxSC1 (submetidos à infusão de 2 106 células Lin no 15º dia de pós-operatório); e NxSC3 (submetidos à infusão de 2 106 células Lin no 15º, 30º e 45º dias de pós-operatório). No 60º dia de pós-operatório clearance de inulina, imunohistoquímica e immunoblotting foram realizados. Resultados: Os animais submetidos à nefrectomia apresentaram redução do clearance de inulina (0,33 ± 0,02 ml/min/100g peso corpóreo), proteinúria (12 ± 0,5 mg/24hs) , anemia e hipertensão (145 ± 7,7 mmHg) compatíveis com doença renal crônica. A infusão de células Lin- resultou em atenuação da proteinúria (p

O gene PKHD1, mutado na doença renal policística autossômica recessiva, apresenta um padrão de splicing complexo associado a múltiplos transcritos alternativos. Neste trabalho estudamos o perfil de expressão de seu produto, poliductina. Análises por western blot revelaram produtos putativos de membrana de > 440 kDa e ~230 kDa, e de ~140 kDa em frações solúveis de rim, fígado e pâncreas. Estudos imunoistoquímicos mostraram marcação em ductos coletores renais e porção ascendente espessa da alça de Henle, em epitélios ductais biliar e pancreático e, no período embrionário, em broto ureteral, ductos biliar e pancreático e glândula salivar. Análises por imunofluorescência e microscopia imunoeletrônica sugerem que poliductina se localize em cílio apical primário, membrana apical e citoplasma de células do ducto coletor. Nossos resultados indicam que PKHD1 codifica isoformas de membrana e solúveis PKHD1, the gene mutated in autosomal recessive polycystic kidney disease, presents a complex splicing pattern, associated with multiple alternative transcripts. In this work we have studied the expression profile of its product, polyductin. Western blot analysis revealed putative membrane products of > 440 kDa and 230 kDa, and of ~140 kDa in soluble fractions in kidney, liver and pancreas. Immunohistochemistry studies showed staining in renal collecting duct and thick ascending limb of Henle, in biliary and pancreatic ductal epithelia and, in the embryonic period, in ureteric bud, biliary and pancreatic ducts and salivary gland. Immunofluorescence and immunoelectron microscopy studies suggest that polyductin localizes to primary apical cilium, apical membrane and cytoplasm of collecting duct cells. Our data indicate that PKHD1 codifies membrane and soluble isoforms