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Glyphosate is the active ingredient of several herbicide formulations. Different reports suggest that glyphosate-based herbicides (GBHs) may act as endocrine disruptors. We evaluated the potential estrogenic effects of a GBH formulation using the uterotrophic assay. Adult ovariectomized rats were sc injected for 3 consecutive days with: saline solution (vehicle control), 2.10−5 g E2/kg/day (uterotrophic dose; UE2), 2.10−7 g E2/kg/day (nonuterotrophic dose; NUE2), or 0.5, 5, or 50 mg GBH/kg/day of the. Twenty-four hours after the last injection, the uterus was removed and weighed and processed for histopathology and mRNA extraction. Epithelial cell proliferation and height and expression of estrogen-responsive genes were evaluated (estrogen receptors, ERα and ERβ; progesterone receptor, PR; complement 3, C3). Uterine weight and epithelial proliferation were not affected by GBH. However, the luminal epithelial cell height increased at GBH0.5. ERα mRNA was downregulated by all GBH doses and E2 groups, whereas PR and C3 mRNA were diminished by GBH0.5. GBH5-, GBH50-, and UE2-treated rats showed downregulated ERα protein expression in luminal epithelial cells, while the receptor was upregulated in the stroma. GBH upregulated ERβ (GBH0.5–50) and PR (GBH5) expressions in glandular epithelial cells, similar effect to that of NUE2 group. These results indicate that, although the uterine weight was not affected, GBH modulates the expression of estrogen-sensitive genes. Fil: Varayoud, Jorgelina Guadalupe. Consejo Nacional de Investigaciones Científicas y Técnicas. Centro Científico Tecnológico Conicet - Santa Fe. Instituto de Salud y Ambiente del Litoral. Universidad Nacional del Litoral. Instituto de Salud y Ambiente del Litoral; Argentina Fil: Durando, Milena de Lourdes. Consejo Nacional de Investigaciones Científicas y Técnicas. Centro Científico Tecnológico Conicet - Santa Fe. Instituto de Salud y Ambiente del Litoral. Universidad Nacional del Litoral. Instituto de Salud y Ambiente del Litoral; Argentina Fil: Ramos, Jorge Guillermo. Consejo Nacional de Investigaciones Científicas y Técnicas. Centro Científico Tecnológico Conicet - Santa Fe. Instituto de Salud y Ambiente del Litoral. Universidad Nacional del Litoral. Instituto de Salud y Ambiente del Litoral; Argentina Fil: Milesi, Maria Mercedes. Consejo Nacional de Investigaciones Científicas y Técnicas. Centro Científico Tecnológico Conicet - Santa Fe. Instituto de Salud y Ambiente del Litoral. Universidad Nacional del Litoral. Instituto de Salud y Ambiente del Litoral; Argentina Fil: Ingaramo, Paola Inés. Consejo Nacional de Investigaciones Científicas y Técnicas. Centro Científico Tecnológico Conicet - Santa Fe. Instituto de Salud y Ambiente del Litoral. Universidad Nacional del Litoral. Instituto de Salud y Ambiente del Litoral; Argentina Fil: Muñoz de Toro, Monica Milagros. Consejo Nacional de Investigaciones Científicas y Técnicas. Centro Científico Tecnológico Conicet - Santa Fe. Instituto de Salud y Ambiente del Litoral. Universidad Nacional del Litoral. Instituto de Salud y Ambiente del Litoral; Argentina Fil: Luque, Enrique Hugo. Consejo Nacional de Investigaciones Científicas y Técnicas. Centro Científico Tecnológico Conicet - Santa Fe. Instituto de Salud y Ambiente del Litoral. Universidad Nacional del Litoral. Instituto de Salud y Ambiente del Litoral; Argentina

Studies regarding the effects of endocrine-disrupting chemicals (EDCs) on the reproductivefunctions of wild animals have raised increasing concern. Thus, here we evaluated theconsequences of in ovo exposure to endosulfan (END) and bisphenol A (BPA) in testes fromneonatal to juvenile (Juv) caimans (Caiman latirostris). Caiman eggs were collected from areaswith low to moderate anthropogenic intervention and incubated at male-producing temperature.At stage 20 of embryonic development (previous to gonad sex determination), eggs were exposedto either END (20 ppm) or BPA (1.4 ppm) and male gonad histomorphology examined in 10-day-old, 90-day-old, and Juv caimans. The relative seminiferous tubular area (RTA) was measuredin testes and the proliferation index and the expression of estrogen receptor alpha (ERa) werequantified in intratubular cells. Regardless of the treatment, all eggs resulted in male hatchlings.The testes of EDC-exposed caimans presented tortuous seminiferous tubules with empty tubularlumens. The RTA of 10-day-old caimans exposed to BPA was decreased. The percentage of cellsexpressing ERa was not different after in ovo treatment with EDCs (compared to the Controlgroup), although caimans exposed to END showed a different ERa distribution pattern. Theproliferation index was lower in 90-day-old caimans exposed to END, and higher in Juv caimansexposed to BPA. In ovo exposure to END or BPA modified sensitive parameters of C. latirostris malegonads. The alterations described here might compromise not only the sexual maturation but alsothe reproductive performance of adult caimans. Fil: Durando, Milena de Lourdes. Universidad Nacional del Litoral. Facultad de Bioquímica y Ciencias Biológicas. Departamento de Fisiología. Laboratorio de Endocrinología y Tumores Hormonodependientes; Argentina Fil: Canessini Guillermina. Universidad Nacional del Litoral. Facultad de Bioquímica y Ciencias Biológicas. Departamento de Fisiología. Laboratorio de Endocrinología y Tumores Hormonodependientes; Argentina Fil: Cocito, Laura Leilén. Universidad Nacional del Litoral. Facultad de Bioquímica y Ciencias Biológicas. Departamento de Fisiología. Laboratorio de Endocrinología y Tumores Hormonodependientes; Argentina Fil: Galoppo, Germán Hugo. Universidad Nacional del Litoral. Facultad de Bioquímica y Ciencias Biológicas. Departamento de Fisiología. Laboratorio de Endocrinología y Tumores Hormonodependientes; Argentina Fil: Zayas, Marcelo Alejandro. Universidad Nacional del Litoral. Facultad de Bioquímica y Ciencias Biológicas. Departamento de Fisiología. Laboratorio de Endocrinología y Tumores Hormonodependientes; Argentina Fil: Luque, Enrique Hugo. Universidad Nacional del Litoral. Facultad de Bioquímica y Ciencias Biológicas. Departamento de Fisiología. Laboratorio de Endocrinología y Tumores Hormonodependientes; Argentina Fil: Muñoz de Toro, Monica Milagros. Universidad Nacional del Litoral. Facultad de Bioquímica y Ciencias Biológicas. Departamento de Fisiología. Laboratorio de Endocrinología y Tumores Hormonodependientes; Argentina

Successful implantation is the result of complex molecular interactions between the hormonally primed uterus and a mature blastocyst. This very carefully synchronized interplay of hormonal signals and feedback loops is potentially vulnerable to chemicals such as endocrine disruptors that may disrupt endocrine signaling. Bisphenol A (BPA) is one of the highest-volume chemicals produced worldwide. This chapter describes the effects of brief postnatal exposure to BPA on female reproductive performance and specifically on the uterine adaptations during the preimplantation period. We propose that an early alteration in Hoxa10 gene expression affects the functional differentiation of the preimplantation uterus as part of an altered endocrine signal transduction pathway. These molecular alterations could explain, at least in part, the adverse effects of BPA on uterine implantation. Exposure to endocrine disruptors, such as BPA, could contribute to the impaired female fertility noted over the past decades. Fil: Varayoud, Jorgelina Guadalupe. Universidad Nacional del Litoral. Facultad de Bioquímica y Ciencias Biológicas. Departamento de Fisiología. Laboratorio de Endocrinología y Tumores Hormonodependientes; Argentina. Consejo Nacional de Investigaciones Científicas y Técnicas. Centro Científico Tecnológico Conicet - Santa Fe; Argentina Fil: Ramos, Jorge Guillermo. Universidad Nacional del Litoral. Facultad de Bioquímica y Ciencias Biológicas. Departamento de Fisiología. Laboratorio de Endocrinología y Tumores Hormonodependientes; Argentina. Consejo Nacional de Investigaciones Científicas y Técnicas. Centro Científico Tecnológico Conicet - Santa Fe; Argentina Fil: Muñoz de Toro, Monica Milagros. Universidad Nacional del Litoral. Facultad de Bioquímica y Ciencias Biológicas. Departamento de Fisiología. Laboratorio de Endocrinología y Tumores Hormonodependientes; Argentina Fil: Luque, Enrique Hugo. Universidad Nacional del Litoral. Facultad de Bioquímica y Ciencias Biológicas. Departamento de Fisiología. Laboratorio de Endocrinología y Tumores Hormonodependientes; Argentina. Consejo Nacional de Investigaciones Científicas y Técnicas. Centro Científico Tecnológico Conicet - Santa Fe; Argentina

Hormonally controlled vascular changes play a key role in endometrial development and in the differentiation process necessary for implantation. Vascular endothelial growth factor (VEGF) has emerged as one of the central regulators of the uterine vasculature. Hormonal perturbations during neonatal development may alter sex steroid-dependent regulation of VEGF and may ultimately affect fertility later in life. The aim of this study was to determine whether neonatal exposure to the environmental estrogenic chemical bisphenol A (BPA) affects the adult rat uterine response to hormonal stimuli. Newborn female rats were given s.c. injections of vehicle, BPA (0.05 mg/kg per day or 20 mg/kg per day) or diethylstilbestrol (0.2 μg/kg per day) on Postnatal Days 1, 3, 5, and 7. To evaluate the long-term effects, rats were ovariectomized at Postnatal Day 80 and submitted to hormonal replacement. Rats neonatally exposed to xenoestrogens showed a decreased induction of uterine endothelial proliferation and a decreased Vegf mRNA expression in response to ovarian steroid treatment. Also, although the estrogen receptor alpha (ESR1) expression was lower in subepithelial cells than in controls, a higher expression of silencing mediator of retinoic acid and thyroid hormone receptor (NCOR1, also known as SMRT) corepressor was evidenced in the same compartment. The results indicate that disturbed Vegf expression in BPA rats could be the result of changes in endocrine pathways, such as an altered induction of ESR1 and/or NCOR1 expression. Because of the importance of VEGF in the implantation process, our data suggest that neonatal BPA exposure might have negative consequences on female fertility. Fil: Bosquiazzo, Veronica Lis. Universidad Nacional del Litoral; Argentina Fil: Varayoud, Jorgelina Guadalupe. Universidad Nacional del Litoral; Argentina Fil: Muñoz de Toro, Monica Milagros. Universidad Nacional del Litoral; Argentina Fil: Luque, Enrique Hugo. Universidad Nacional del Litoral; Argentina Fil: Ramos, Jorge Guillermo. Universidad Nacional del Litoral; Argentina

Estrogen receptor a (ERa) gene has been demonstrated to be under complex hormonal control and its activity could be regulated by mRNA alternative splicing. Here we investigated the regulation of transcription and translation of ERa in the rat uterus by ovarian steroids. We examined whether ERa mRNA splice isoforms expression is hormonally regulated. Adult ovariectomized (OVX) female rats were treated daily with 17-bestradiol (E2) (0.05 mg or 5 mg), progesterone (P4) (1 mg) or a combination of both hormones for 4 days. Animals were killed 24 h after the last injection and uterine horns were removed. The ERa protein and mRNA were evaluated by immunohistochemistry and RT-PCR analysis, respectively. In controls ERa mRNA and protein levels were high, demonstrating a constitutive expression of the ERa gene in the OVX rat uterus. When animals received P4 or the high dose of E2, the uterus showed a significant decrease of ERa mRNA and protein. However, when rats were treated with the low dose of E2 the ERa protein just showed a down regulation. In addition to the full length ERa mRNA, OVX control rat uterus expressed three shorter transcripts: S3, S4 and S3,4 (lacking exon 3, 4 and 3,4 respectively). Surprisingly, treatments with P4 and/or the low dose of E2 completed abolished the S3 isoform expression. In summary, our results suggest a dose dependent relationship between E2 and the level of control in the ERa transcription-translation cascade. Moreover, the alternative splicing of the ERa primary transcript is influenced by the hormonal milieu, suggesting that these events could affect the estrogen responsiveness of the rat uterus. Fil: Varayoud, Jorgelina Guadalupe. Consejo Nacional de Investigaciones Científicas y Técnicas. Centro Científico Tecnológico Conicet - Santa Fe. Instituto de Salud y Ambiente del Litoral. Universidad Nacional del Litoral. Instituto de Salud y Ambiente del Litoral; Argentina Fil: Ramos, Jorge Guillermo. Consejo Nacional de Investigaciones Científicas y Técnicas. Centro Científico Tecnológico Conicet - Santa Fe. Instituto de Salud y Ambiente del Litoral. Universidad Nacional del Litoral. Instituto de Salud y Ambiente del Litoral; Argentina Fil: Monje, Lucas Daniel. Consejo Nacional de Investigaciones Científicas y Técnicas. Centro Científico Tecnológico Conicet - Santa Fe. Instituto de Salud y Ambiente del Litoral. Universidad Nacional del Litoral. Instituto de Salud y Ambiente del Litoral; Argentina Fil: Bosquiazzo, Veronica Lis. Consejo Nacional de Investigaciones Científicas y Técnicas. Centro Científico Tecnológico Conicet - Santa Fe. Instituto de Salud y Ambiente del Litoral. Universidad Nacional del Litoral. Instituto de Salud y Ambiente del Litoral; Argentina Fil: Muñoz de Toro, Monica Milagros. Consejo Nacional de Investigaciones Científicas y Técnicas. Centro Científico Tecnológico Conicet - Santa Fe. Instituto de Salud y Ambiente del Litoral. Universidad Nacional del Litoral. Instituto de Salud y Ambiente del Litoral; Argentina Fil: Luque, Enrique Hugo. Consejo Nacional de Investigaciones Científicas y Técnicas. Centro Científico Tecnológico Conicet - Santa Fe. Instituto de Salud y Ambiente del Litoral. Universidad Nacional del Litoral. Instituto de Salud y Ambiente del Litoral; Argentina

Fil: Dioguardi, Gisela Haydée. Universidad Nacional del Litoral. Facultad de Bioquímica y Ciencias Biológicas; Argentina. El objetivo de este trabajo fue desarrollar un modelo animal de exposición postnatal a un herbicida a base de glifosato (HBG) comparando la vía de exposición subcutánea con la vía oral. Corderas fueron expuestas desde el nacimiento hasta el día postnatal (DPN) 14 con solución fisiológica (control) o una formulación comercial de HBG en una dosis ambientalmente relevante de 2 mg de glifosato/kg/día. En el DPN45 se extrajeron y pesaron los ovarios y las corderas, se evaluaron el desarrollo folicular, la incidencia de Folículos Multiovulares (FMOs) y el porcentaje de folículos atrésicos. Por inmunohistoquímica para Ki67, se evalúo el índice de proliferación de granulosa y teca. En los DPN15 y DPN45 se tomaron muestras de suero para cuantificar los niveles circulantes de glifosato y su metabolito AMPA. En ambas vías de exposición a HBG no se modificó el peso de las corderas ni de los ovarios en el DPN45. Las corderas expuestas a HBG presentaron un menor porcentaje de folículos primordiales, mayor porcentaje de folículos de transición y primarios, mayor porcentaje de FMOs y folículos atrésicos y mayor porcentaje de proliferación en células de la granulosa y de la teca de folículos antrales pequeños. En corderas expuestas a HBG por ambas vías se detectó glifosato pero no AMPA en el DPN15, en el DPN45 no se detectó ni glifosato ni AMPA. No se observaron niveles de AMPA ni glifosato en animales controles en los periodos estudiados. En conclusión, la exposición neonatal a HBG alteró la dinámica folicular ovárica, lo que podría afectar la futura performance reproductiva de la hembra. The goal of this study was to develop an animal model of postnatal exposure to a glyphosate-based herbicide (GBH) comparing subcutaneous exposure route vs. oral route. Lambs were exposed from birth to postnatal day (PND) 14 with physiological solution (control) or a commercial formulation of glyphosate (GBH) at an environmentally relevant dose of 2 mg glyphosate / kg / day. In PND45, ovaries and lambs were weighed and follicular development, incidence of Multiovular Follicles (MOFs) and the percentage of atresic follicles were evaluated. Granulosa and theca cell proliferation were evaluated by immunohistochemistry (Ki67 expression). Serum samples were obtained from DPN15 and DPN45 to quantify circulating levels of glyphosate and its metabolite AMPA. In both routes of exposure to GBH, the weight of the lambs and ovaries did not change in PND45. Lambs exposed to GBH showed a lower percentage of primordial follicles, a higher percentage of transitional and primary follicles, a higher percentage of FMOs and atresic follicles, and a higher percentage of proliferation in granulosa and theca cells of small antral follicles. In lambs exposed to GBH by both routes, glyphosate was detected but not AMPA in DPN15, in DPN45 neither glyphosate nor AMPA was detected. No levels of AMPA or glyphosate were detected in control animals in the periods studied. In conclusion, neonatal exposure to GBH altered ovarian follicular dynamics and could affect the future reproductive performance of the female. Universidad Nacional de Lomas de Zamora

Fil: Alarcón, Ramiro. Universidad Nacional del Litoral. Facultad de Bioquímica y Ciencias Biológicas; Argentina. En el humano, la rata, la oveja, y otras especies animales, el desarrollo y la diferenciación del útero se completan posnatalmente. Este proceso es coordinado por diferentes moléculas y, durante este periodo crítico del desarrollo, la exposición a compuestos denominados perturbadores endócrinos (PE) puede alterar el desarrollo e inducir cambios en la funcionalidad uterina. Actualmente, muchos de los PE son agroquímicos, como el endosulfán o los herbicidas a base de glifosato (HBG), entre otros. Considerando lo antes expuesto, evaluamos los efectos de la exposición neonatal a endosulfan o a un HBG en dos modelos animales diferentes. Ratas hembra de la cepa Wistar fueron expuestas por vía subcutánea desde el día posnatal 1 (DPN1) al DPN7, cada 48hs, a una baja dosis de endosulfán (600 ug/kg/día). En el DPN90, se pusieron a preñar para evaluar: i) la diferenciación miometrial uterina en el periodo pre-implantatorio (día gestacional 5); ii) la activación miometrial durante el parto. Por otro lado, corderas de raza frisona fueron expuestas desde el DPN1 al DPN14, cada 24hs, a un HBG por vía oral o subcutánea (Roundup Full II; dosis: 2 mg/kg/día). En el DPN45 (periodo prepuberal), evaluamos los efectos sobre el desarrollo uterino. Los resultados de la presente tesis sugieren que la exposición a PE durante periodos críticos puede producir alteraciones en el desarrollo y la diferenciación uterina, con consecuencias adversas para la salud reproductiva. Asimismo, nuestros resultados contribuyen a comprender el potencial impacto de la exposición a PE sobre la cadena productiva de la industria pecuaria. Uterine development and differentiation begin prenatally and finishes postnatally in human, rodents, sheep, and other animals. This complex process is coordinated by several molecules. During critical developmental periods, the exposure to endocrine disruptor chemicals (EDCs) might alter the development and the differentiation and induce changes in uterine functionality. There are more than 185 compounds classified as EDCs, and many of them are agrochemicals like endosulfan or glyphosate-based herbicides (GBH). Taking this into account, our aim was to evaluate the effects of a neonatal exposure to endosulfan or GBH in two different animal models. First, Wistar female rats were subcutaneously exposed from postnatal day 1 (PND1) to PND7, every 48hs, to a low dose of endosulfan (600 ug/kg body weight/day). On PND90, the rats were mated to evaluate: i) uterine myometrial differentiation on gestational day 5 (GD5); ii) myometrial activation during labor (GD23). Secondly, Friesian ewe lambs were exposed to a subcutaneous or to an oral dose of GBH (Roundup Full II; dose of 2 mg glyphosate/kg body weight/day) or to saline solution (vehicle) every 24hs from PND1 to PND14. On PND45, we evaluated the neonatal exposure effects of a GBH on uterine development of ewe lambs during prepubertal period. To sum up, our results suggests that EDC exposure during critical periods of uterine development and differentiation might have adverse long-term effects, with detrimental consequences for reproductive health. We also consider that this thesis provides more comprehension of the potential impact of agrochemicals with EDC activity on livestock productive chains. Agencia Nacional de Promoción Científica y Tecnológica Consejo Nacional de Investigaciones Científicas y Técnicas Universidad Nacional del Litoral Universidad Nacional de Lomas de Zamora

La función de la glándula tiroides está regulada por la hormona estimulante de la tiroides (TSH), una hormona glicoproteica secretada por la hipófisis anterior. En respuesta principalmente a TRH, la TSH madura se libera a la circulación e induce la síntesis y secreción de las hormonas tiroideas: triyodotironina (T3) y tiroxina (T4), que son las hormonas metabólicamente activas. La secreción de TSH está regulada por TRH y por un ciclo de retroalimentación negativa en el que las hormonas T3 y T4 actúan a nivel pituitario e hipotalámico. Dado que el control por retroalimentación de la secreción de TSH es exquisitamente sensible a las hormonas tiroideas periféricas, la mayoría de los trastornos tiroideos pueden diagnosticarse midiendo los niveles de TSH y de las hormonas tiroideas. Por esta razón, para la toma de decisiones clínicas, la medición de TSH en suero humano ha sido establecida como la "primera línea" para el diagnóstico de la función tiroidea. La mayoría de los métodos actuales para la determinación de TSH utilizados en los laboratorios clínicos son inmunoensayos heterogéneos "sandwich" que implican (1) enzimas, (2) sustratos fluorométricos o (3) marcadores quimioluminiscentes. En comparación con los inmunoensayos competitivos tradicionales, como los radioinmunoensayos, los inmunoensayos heterogéneos para cuantificar TSH ofrecen (1) límites de detección más bajos, (2) tiempo de respuesta rápido y (3) un rango de medición lineal más amplio. En virtud de su obvia importancia para el diagnóstico clínico, se ha realizado un esfuerzo constante para desarrollar métodos analíticos con alta sensibilidad para TSH en fluidos corporales humanos. Aunque la sensibilidad y la reproducibilidad de los inmunoensayos de TSH han ido mejorando progresivamente en los últimos 30 años, existen discrepancias analíticas en las determinaciones cuantitativas de TSH entre los sistemas disponibles comercialmente. La mayor variabilidad entre métodos se encuentra a bajas concentraciones de la hormona (por debajo de 0,4 μUI/ml), debido a la menor capacidad de detección y a la sensibilidad analítica de los inmunoensayos en este rango de concentraciones. En 1992, Sano y col. crearon una técnica llamada inmuno-PCR (IPCR), en la que reemplazaron la enzima de detección del ELISA por una sonda de ADN conjugada a biotina. Esta sonda de ADN luego es amplificada mediante PCR para la generación de señal, siendo el número de amplicones producidos proporcionales a la cantidad antígeno detectado. Desde la aparición de esta técnica, diversas aplicaciones y estrategias de IPCR se han desarrollado para la detección de innumerables antígenos. A lo largo de los años, estos estudios han demostrado que un ensayo de IPCR puede mejorar el límite de detección de 10 a 10.000 veces más que el de un ensayo de ELISA homólogo.En este trabajo de tesis desarrollamos un ensayo de ELISA sandwich y uno de IPCR altamente sensible, específicos para la detección de la hormona estimulante de la tiroides humana (hTSH). Se generó un panel de anticuerpos monoclonales (MAbs) contra hTSH por tecnología de hibridomas y se seleccionaron racionalmente combinaciones de anticuerpos. Se establecieron las condiciones de ensayo óptimas para la determinación de la hormona por ELISA sandwich y se seleccionaron dos pares de MAbs (B-4 y B-9). Estos prototipos de ELISA se evaluaron frente a patrones calibrados con la 2ª preparación internacional de referencia de la Organización Mundial de la Salud (OMS) y en comparación con un kit ELISA comercial. Aunque el límite de detección (LD) fue de 0,1 μUI/ml en todos los casos, el prototipo de ELISA B-9 mostró un rendimiento analítico similar al kit de ELISA comercial. Por lo tanto, seleccionamos B-9 para desarrollar el ensayo de IPCR sandwich específico, utilizando el formato "Universal", en tubos de PCR estándar sin pretratamiento. La amplificación de la señal se logró a través de la interacción entre el MAb de detección biotinilado y la sonda de ADN mono-biotinilada, previamente autoensamblada con neutravidina. En comparación con los ELISAs evaluados, el ensayo de IPCR mostró un menor LD y un considerable aumento de la sensibilidad (pendiente), proporcionando una mejor resolución cuantitativa en el rango de bajas concentraciones de la hormona. La sensibilidad, facilidad de uso y el bajo costo de la técnica IPCR desarrollada ubican a esta metodología como una plataforma potencial para la detección cuantitativa de hTSH en muestras de suero humano. Además, el método de IPCR descripto (universal) demostró ser un formato práctico y versátil, realizado en tubos de PCR estándar. Nuestros resultados respaldan el potencial de la técnica para su aplicación en el diagnóstico de los estados tiroideos y para la medición confiable de niveles bajos clínicamente relevantes. Consideramos que el método propuesto puede posicionarse como alternativa metodológica para el análisis de hormonas. Fil: Abud, Julián Elías. Consejo Nacional de Investigaciones Científicas y Técnicas. Centro Científico Tecnológico Conicet - Santa Fe. Instituto de Salud y Ambiente del Litoral. Universidad Nacional del Litoral. Instituto de Salud y Ambiente del Litoral; Argentina

Fil: Santamaría, Clarisa Guillermina. Universidad Nacional del Litoral. Facultad de Bioquímica y Ciencias Biológicas; Argentina. En esta tesis doctoral nuestra hipótesis general postula que la exposición a químicos clasificados como xenoestrógenos en períodos hormono-sensibles del desarrollo induce alteraciones en procesos críticos del desarrollo normal de las gónadas y el tracto reproductor femenino, impactando negativamente en la capacidad reproductiva en la vida adulta. Entre los xenoestrógenos más utilizados estudiamos al Bisfenol A (BPA) y al Dietilestilbestrol (DES). En el Capítulo 1: Disfunciones ováricas en ratas adultas nacidas de madres tratadas con bajas dosis de BPA por vía oral, nuestros resultados muestran que el BPA es capaz de afectar los estadíos tempranos del desarrollo ovárico con consecuencias en la edad adulta. En el Capítulo 2: Efectos del BPA sobre la respuesta ovárica al tratamiento con gonadotrofinas exógenas en ratas, demostramos que la exposición perinatal a BPA, condiciona la capacidad de respuesta del ovario a un tratamiento con gonadotrofinas exógenas. En el Capítulo 3: Acción del BPA en el ensamblado folicular en cultivos de ovarios enteros, demostramos que tanto en ratas como en ratones OCT4-GFP, el BPA es capaz de impactar de forma directa sobre el ensamblado folicular. Finalmente en el Capítulo 4: demostramos que la exposición neonatal a xenoestrógenos altera la respuesta ovárica al tratamiento con gonadotrofina en corderas. Los resultados detallados en esta tesis doctoral fundamentan la preocupación mundial por la creciente exposición a estrógenos ambientales, y demuestran que el desarrollo folicular y la síntesis esteroidogénica ováricas son un blanco de acción constante de los mismos. In this doctoral thesis our general hypothesis postulates that exposure to chemicals classified as xenoestrogens in hormone-sensitive developmental periods induces alterations in critical processes of the normal development of the gonads and the female reproductive tract, negatively impacting reproductive capacity in adulthood. We studied two of the most used xenoestrogens, Bisphenol A (BPA) and Diethylstilbestrol (DES). In Chapter 1: Ovarian dysfunctions in adult rats born to mothers treated with low doses of oral BPA, our results show that BPA is able to affect the early stages of ovarian development with consequences in adulthood. In Chapter 2: Effects of BPA on ovarian response to treatment with exogenous gonadotrophins in rats, we demonstrated that perinatal exposure to BPA, conditions the ovary's responsiveness to treatment with exogenous gonadotrophins. In Chapter 3: Action of BPA on follicular assembly in whole ovary cultures, we demonstrated that in both rats and OCT4-GFP mice, BPA is able to directly impact the follicular assembly. Finally in Chapter 4: we demonstrate that neonatal exposure to xenoestrogens alters the ovarian response to treatment with gonadotrophin in lambs. The results detailed in this doctoral thesis are based on the worldwide concern about the increasing exposure to environmental estrogens, and demonstrate that the follicular development and steroidogenic ovarian synthesis are a constant target of the xenoestrogens. Consejo Nacional de Investigaciones Científicas y Técnicas

Fil: Vigezzi, Lucía. Universidad Nacional del Litoral. Facultad de Bioquímica y Ciencias Biológicas; Argentina. En el presente trabajo de tesis estudiamos los efectos de la exposición perinatal a bajas dosis de Bisfenol A (BPA) sobre la diferenciación funcional uterina en ratas adultas en distintas edades reproductivas y en un modelo de rata ovariectomizada tratada con estrógenos. Los resultados presentados nos permitieron concluir que la exposición perinatal a BPA altera el desarrollo del útero con consecuencias adversas a largo plazo en la histología y la diferenciación funcional uterina de ratas de distintas edades reproductivas. Observamos importantes cambios en el compartimento glandular del útero, lo que sugiere que el BPA podría alterar la funcionalidad de las glándulas uterinas. También demostramos que la exposición perinatal a BPA altera la respuesta uterina al estradiol (E2) en ratas adultas de edad avanzada. Esto fue evidenciado por alteraciones en la histología y en la expresión de proteínas implicadas en la diferenciación funcional de las glándulas uterinas; y por cambios en la expresión de receptores hormonales y de moléculas asociadas a las interacciones estroma-epitelio mediadas por E2. En esta tesis se presentan evidencias experimentales de efectos adversos de la exposición perinatal a BPA sobre la diferenciación funcional del útero y en consecuencia, la salud reproductiva de la hembra. Estos resultados deberían contribuir a la toma de conciencia para promover la elaboración de normas que regulen/eviten la exposición a químicos clasificados como perturbadores endocrinos que contaminan el medio ambiente y que afectan la salud animal y de los seres humanos. In the present work we investigated the long-term effects of perinatal exposure to low doses of Bisphenol A (BPA) on the uterine functional differentiation in adult rats at different reproductive stages; and in ovariectomized adult rats treated with Estrogen. The results presented here demonstrate that perinatal exposure to low doses of BPA alters the histology and uterine functional differentiation of rats from different reproductive ages. We observed significant changes in uterine glands, suggesting that BPA could alter the glandular function. We also demonstrated that perinatal exposure to BPA alters the uterine response to estradiol (E2) in aged rats. This was evidenced by alterations in the histology and the expression of proteins involved in the glandular functional differentiation; and by changes in the expression of hormonal receptors and molecules involved in stromal-epithelial interactions mediated by E2. In this thesis we presented experimental evidence showing adverse effects of perinatal exposure to BPA on the uterine functional differentiation and therefore, the female reproductive health. These results should contribute to promote the elaboration of future norms that will regulate the degree of human and wild life exposure to chemicals classified as endocrine disruptors. Consejo Nacional de Investigaciones Científicas y Técnicas

Fil: Rivera, Oscar Edgardo. Universidad Nacional del Litoral. Facultad de Bioquímica y Ciencias Biológicas; Argentina. El término perturbador endocrino (PE) refiere a sustancias con capacidad de imitar o antagonizar a las hormonas endógenas. Entre los más utilizados y estudiados podemos mencionar a dos xenoestrógenos sintéticos: Bisfenol A (BPA) y dietilestilbestrol (DES). El objetivo de esta tesis fue determinar si la exposición postnatal temprana a DES ó BPA altera el desarrollo del ovario de oveja lo que podría provocar consecuencias reproductivas durante la vida adulta. Se realizaron 3 experimentos:1) Se estudió mediante IHQ la ontogenia de los receptores de hormonas esteroides (REalfa, REbeta, RA) en muestras de ovario de corderas en los días postnatales 1, 5, 10 y 30. 2) Se determinaron los efectos de la exposición a los xenoestrógenos sobre el desarrollo del ovario en el día postnatal 30.Se evaluó: el peso del ovario; parámetros que determinan el desarrollo folicular (dinámica folicular, reserva total de ovocitos, incidencia de FMOs y porcentaje de folículos atrésicos. 3) Fue diseñado para investigar si la exposición postnatal a xenoestrógenos afecta la funcionalidad ovárica. Resultados: a) Las corderas expuestas a DES y BPA presentaron una disminución de la reserva de folículos primordiales y un aumento del desarrollo folicular. b) La exposición a BPA redujo el peso ovárico e incrementó la incidencia de FMOs. c) Las corderas expuestas a BPA o DES desarrollaron un menor número de folículos ≥2 mm y menor número de folículos atrésicos en respuesta al tratamiento con oFSH. La exposición postnatal a dosis bajas de BPA y DES alteró tanto el desarrollo como la funcionalidad ovárica en el modelo utilizado. The term endocrine disruptor (ED) refers to those substances which have the ability to imitate or antagonize endogenous hormones. Among most used and studied EDs we can mention two synthetic xenostrogens: Biphenol A (BPA) and dietilstylbestrol (DES). The objective was determine whether early postnatal exposure to DES or BPA affects the development of the sheep’s ovary and may cause reproductive consequences during adulthood. The work was divided into 3 experiments: 1) By IHQ, the ontogeny of the receptors of steroid hormones (REalpha, REbeta, RA) on samples of lambs ovaries on postnatal days 1, 5, 10 and 30 was studied. 2) We determined the effects of the exposure to xenostrogens on the development of the ovary on postnatal day 30. 3) It was designed to study whether the postnatal exposure to xenostrogens affects the ovarian functionality. Results: a) Lambs neonatally exposed to DES and BPA showed a decrease in primordial follicles reserves and an increase of follicular development. b) The exposure to BPA reduced the ovarian weight and raised the incidence of MOFs. c) Lambs neonatally exposed to DES and BPA developed a lower number of follicles ≥ 2 mm and a lower number of atretic follicles in response to oFSH treatment. Postnatal exposure to low doses of BPA and DES altered both the development and ovarian functionality in the model used. Universidad Nacional de Lomas de Zamora

Fil: Durando, Milena de Lourdes. Universidad Nacional del Litoral. Facultad de Bioquímica y Ciencias Biológicas; Argentina. Los perturbadores endocrinos (PE) son sustancias que alteran las funciones del sistema endocrino provocando efectos adversos en la salud de un organismo intacto o su progenie. Bisfenol A (BPA), es un PE liberado de selladores odontológicos, envases de bebidas y alimentos. En roedores, la exposición prenatal a BPA produjo efectos profundos y duraderos en tejidos hormonodependientes. La exposición a dosis bajas de BPA durante períodos críticos de organogénesis/diferenciación genera cambios histomorfológicos en la glándula mamaria (GM) que modificarían la regulación endocrina y aumentarían la susceptibilidad a un carcinógeno químico. Ratas Wistar preñadas fueron expuestas a BPA (25 o 250 μg/kg/día) o vehículo. Sub-grupos de crías hembras recibieron una dosis subcarcinogénica de NMU en día postnatal (DPN) 50. Se obtuvieron muestras de suero y GM de crías hembras sacrificadas en DPN 30, 50, 110 ó 180. La exposición prenatal a BPA modificó la histoarquitectura de la GM, promovió el desarrollo de lesiones pre-neoplásicas y aumentó la susceptibilidad carcinogénica frente a NMU administrado finalizada la exposición. La exposición prenatal a BPA indujo, en la GM de ratas ciclando, respuesta fibrosa en el estroma asociada con reclutamiento de mastocitos, promovió angiogénesis y repuestas mediadas por REalfa. La exposición prenatal a dosis bajas, ambientalmente relevantes de BPA puede aumentar el riesgo de desarrollar tumores mamarios. Estos resultados enfatizan la implicancia de adhesión al “Principio de Precaución” respecto a contaminación ambiental con PE y refuerzan conceptos que asocian esta evidencia a la mayor incidencia de tumores hormonodependientes en humanos en las últimas décadas. Humans are routinely exposed to bisphenol A (BPA), a xenoestrogen that leaches from dental materials, food and beverage containers. Prenatal exposure to BPA has produced long-lasting and profound effects on rodent hormone-dependent tissues that are manifested 1–6 months after the end of exposure. To examine if in utero BPA exposure modifies: mammary gland (MG) development and angiogenesis; the expression of steroid receptors and its co-regulators; the susceptibility to the carcinogen N-nitroso-N-methylurea (NMU). Pregnant Wistar rats were exposed to BPA (25 or 250 μg/kg/day) or to vehicle. Female offspring were sacrificed on postnatal day (PND) 30, 50, 110, or 180 and MGs were obtained. On PND 50 a group of rats received NMU (25 mg/kg) and they were sacrificed on either PND 110 or 180. BPA advanced puberty and increased the proliferation/apoptosis ratio in MG on PND 50. At PND 110 and 180, BPA-exposed animals showed an increased number of hyperplastic ducts and augmented stromal nuclear density, which showed signs of desmoplasia with an increased number of mast cells, suggesting a heightened risk of neoplastic transformation. 250 BPA animals showed an increased ERalpha and a decreased SRC-3. BPA-treated animals had lower levels of progesterone at PND 50. The relative vascular area on BPA groups was increased regardless of VEGF expression by the epithelial cells. Prenatal exposure to BPA perturbs MG histoarchitecture, changes the endocrine environment and its angiogenic process. In utero BPA exposure increases the carcinogenic susceptibility to NMU administered after BPA exposure ended. Consejo Nacional de Investigaciones Científicas y Técnicas Agencia Nacional de Promoción Científica y Tecnológica Universidad Nacional del Litoral

Fil: Bosquiazzo, Verónica Lis. Universidad Nacional del Litoral. Facultad de Bioquímica y Ciencias Biológicas; Argentina. The objective of this thesis was to evaluate the angiogenic process and its possible mechanism of regulation in the pregnant rat uterus and cervix. In addition, investigate the influence of neonatal exposure to xenoestrogenic substances on the development of the uterine vascular compartment and in the female reproductive performance. Results: 1) Using intact pregnant rats, we have demonstrated that the vascular tree of the uterine cervix is an active cellular compartment showing striking changes in the relative area occupied by vessels, endothelial proliferation and vascular maturation. These modifications were associated with changes in vascular endothelial growth factor (VEGF) expression. 2) The mast cells degranulation could be a necessary process to control the normal angiogenesis of the rat cervix during pregnancy and we suggest that the effect occur via a VEGF dependent pathway. 3) Neonatal exposure to xenoestrogen altered the normal steroid hormone-responsiveness in the uterus of adult female rats, showing a fail in VEGF gene activation and a decrease in endothelial cell proliferation. In parallel, changes in estrogen and progesterone receptors expression were found at a time where an abnormal overexpression of the corepressor SMRT was showed, suggesting that neonatal xenoestrogen exposure alters the transcriptional machinery of steroid-dependent genes. 4) Finally, in addition to mentioned effects, females exposed to xenoestrogens were subfertile. The results obtained with this Thesis aspire to contribute to the understanding of angiogenesis as a necessary physiological process for a successful labor. In addition, provide experimental evidences about the effects of xenoestrogen exposure on reproductive health. En la presente tesis nos propusimos evaluar en el cérvix y útero de la rata durante la gestación el proceso de angiogénesis y los posibles mecanismos involucrados en su regulación. Investigar la repercusión de la exposición neonatal a sustancias xenoestrogénicas sobre el desarrollo del compartimiento vascular uterino y su potencial influencia en la eficiencia reproductiva. Los resultados obtenidos fueron: 1) El cérvix uterino de la rata durante la gestación presenta importantes cambios en el área vascular, la proliferación de células endoteliales y la maduración vascular. Estas modificaciones fueron asociadas con cambios en la expresión del factor de crecimiento del endotelio vascular (VEGF). 2) La degranulación de mastocitos sería un proceso necesario para controlar la angiogénesis normal del cérvix uterino, posiblemente a través de un camino dependiente del VEGF. 3) La exposición neonatal a xenoestrógenos altera la respuesta normal a esteroides ováricos en el útero de las ratas hembras adultas, con fallas en la activación del gen del VEGF y una menor proliferación de células endoteliales. Además, observamos cambios en la expresión receptores de estrógeno y progesterona asociados a una sobre-expresión anormal de un corepresor (SMRT), sugiriendo que la exposición neonatal a xenoestrógenos altera la maquinaria transcripcional de genes dependientes de esteroides. 4) Finalmente, sumado a los efectos mencionados, las hembras intactas expuestas a xenoestrógenos fueron subfértiles. Los resultados obtenidos contribuyen al conocimiento de la angiogénesis como un proceso fisiológico necesario para una adecuada gestación y demuestran efectos adversos de la exposición a xenoestrógenos sobre la salud reproductiva de la hembra. Agencia Nacional de Promoción Científica y Tecnológica Universidad Nacional del Litoral Consejo Nacional de Investigaciones Científicas y Técnicas