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Einleitung: Die chronische Graft-versus-Host-Krankheit (cGVHD) ist eine Komplikation nach allogener Stammzelltransplantation (allo-HSCT), die mit hoher Morbidität und Mortalität einhergeht. Die gegenwärtig verfügbaren Medikamente sind nicht nur mit ausgeprägten Nebenwirkungen verbunden, sondern oftmals unzureichend wirksam. Ein neuer und vielversprechender Behandlungsansatz besteht in dem adoptiven Zelltransfer natürlicher regulatorischer T-Zellen (nTreg-ACT). Durch die Eigenschaft von nTregs, konventionelle T-Zellen (Tconv) zu supprimieren, könnte ihr adoptiver Transfer positive Effekte auf die immunologische Dysregulation der cGVHD erzielen. Erste klinische Studien deuteten bereits einen sicheren und effektiven Einsatz von nTreg-ACTs an, dennoch bestehen weiterhin Herausforderungen in der Produktherstellung und Daten zu pädiatrischen Patienten sind fehlend. Ziel dieser Arbeit war es daher, die weitere Charakterisierung von nTreg-Zellprodukten zu erarbeiten und nTreg-ACTs als adjuvante Therapieoption bei pädiatrischer cGVHD zu evaluieren. Methodik: Zwei Kinder mit schwerer cGVHD wurden im Rahmen eines individuellen Heilversuchs mit 3,0x106 nTregs/kg behandelt. Nach Zelltransfer wurde an definierten Follow-Up-Zeitpunkten der klinische cGVHD-Status erhoben und 71 verschiedene Immunzelltypen im peripheren Blut durchflusszytometrisch analysiert. Zusätzlich wurden nTregs aus unbehandelten und G-CSF mobilisierten Stammzellspendern magnetisoliert und polyklonal expandiert. Neben dem Expansionsverhalten wurde durch Färbung von CD4, CD25, FoxP3, IFN-γ, TNF-α, IL-2, CD154 und CD137 die nTreg-Produktreinheit und CD154/CD137-Expression durchflusszytometrisch bestimmt. Die Suppressionskapazität der nTregs wurde durch Nutzung CFSE-basierter Proliferationsassays ermittelt. Ergebnisse: Die Zellkulturexperimente zeigten, dass sich durch dreiwöchige Expansion mit IL-2, Rapamycin und wiederholter Beadstimulation Expansionsraten von bis zu ~100.000-fach erzielen lassen. Die Zellprodukte zeigten eine hohe Reinheit und eine deutliche Tconv-Suppression in vitro. Der Vergleich von unbehandelten und G-CSF stimulierten nTreg-Linien ergab eine ähnliche Zellexpansion und Produktreinheit. Weitere Experimente zeigten, dass CD137 keinen geeigneten Selektionsmarker für polyklonale nTregs darstellt. Der klinische Einsatz von nTreg-ACTs erwies sich als gut verträglich und führte zu keiner quantitativen Beeinträchtigung der angeborenen Immunität. Nach dem Zelltransfer konnte entweder eine klinische Stabilisierung oder eine deutliche, langfristige Verbesserung der cGVHD erzielt werden. Die immunologischen Begleituntersuchungen zeigten nicht nur einen nTreg-Anstieg in vivo, sondern auch erstmalig eine Zunahme von naiven B- und T-Lymphozyten nach nTreg-ACT. Schlussfolgerung: Diese Arbeit zeigt, dass sich nTreg-Produkte mit hoher Reinheit und suffizienter Funktionalität herstellen lassen. Die klinische Anwendung erwies sich als gut verträglich und zeigte neben einer Reduktion der cGVHD-Aktivität auch eine verbesserte lymphozytäre Rekonstitution sowie einen nachhaltigen Anstieg von nTregs in vivo. Nun sind große systematische Studien nötig, um künftig die breite und evidenzbasierte Anwendung von nTreg-ACTs in der Behandlung der (pädiatrischen) cGVHD zu ermöglichen., Introduction: Chronic Graft-versus-Host-Disease (cGVHD) is a severe complication after allogeneic stem cell transplantation (allo-HSCT) and associated with a high morbidity and mortality rate. The efficacy of currently available drugs is limited and frequently related with significant adverse effects. A new and promising therapeutic approach is the adoptive cell transfer of natural regulatory T cells (nTreg-ACT). Due to the ability of nTregs to suppress activated conventional T cells (Tconv), their adoptive transfer could achieve positive effects on immune dysregulation in cGVHD. First clinical data already implied safety and efficacy of nTreg-therapy, yet challenges remain with respect to cell manufacturing and data from pediatric patients are lacking entirely. Thus, this work aims at establishing an advanced characterization of nTreg-products and evaluating nTreg-ACTs as an adjuvant therapy in pediatric cGVHD. Methods: As a case of compassionate care, two children with severe cGVHD received treatment with 3.0x106 nTregs/kg. After cell transfer the clinical cGVHD status was assessed and 71 different immune cell subsets analyzed via flow cytometry at specific follow-up-timepoints. Additionally, nTregs from untreated and G-CSF-mobilized donors were immunomagnetically isolated and polyclonally expanded. Apart from its cell expansion, the product’s purity and CD154/CD137 phenotype were assessed via staining of CD4, CD25, FoxP3, IFN-γ, TNF-α, IL-2, CD154 and CD137 and flow cytometry. nTregs’ suppressive capacity was obtained via CFSE-based proliferation assays. Results: The experiments showed that three-week cell culture with IL-2, rapamycin and repeated bead stimulation achieved up to ~100.000-fold expansion. The cells showed high purity and distinct Tconv suppression in vitro. Comparing untreated and G-CSF-stimulated nTregs showed equal cell expansion and purity. Further experiments revealed that CD137 represents no feasible selection marker for polyclonal nTregs. The clinical application of nTreg-ACTs was well-tolerated and did not provoke a quantitative impairment of the innate immunity. After nTreg-ACT, either a short-term clinical stabilization or a significant, long-term improvement of cGVHD could be achieved. Immunological follow-ups showed not only an increase of nTregs in vivo, but also, for the first time, an enhanced engraftment of both, the Naïve B- and T-cell compartment, after nTreg-ACT. Conclusion: This work shows that nTreg products of high purity and sufficient function can be manufactured. Clinical application showed good tolerability and revealed, apart from a reduction of cGVHD activity, an improved lymphoid reconstitution as well as a long-term increase of nTregs in vivo. Now systematic studies are required to enable the broad and evidence-based implementation of nTreg-ACTs in the treatment of (pediatric) cGVHD.