Search

Tokom hronične faze infekcije helmint, Trichinella spiralis, komunicira sa imunskim sistemom domaćina posredstvom ekskretorno-sekretornih produkata (ESL1) mišićnih larvi i kreira sredinu u kojoj dominiraju Th2 i regulatorni tip imunskog odgovora. Međutim, mehanizmi koji leže u osnovi ovakve polarizacije imunskog odgovora još uvek nisu poznati. Ova studija je posvećena istraživanju molekula ESL1 antigena uključenih u interakciju sa receptorima za molekulske obrasce i signalnih puteva koji tom interakcijom bivaju pokrenuti u dendritskim ćelijama, a koji dovode do sledstvene polarizacije T ćelijskog odgovora. ESL1 antigeni, primenjeni intraperitonealno, statistički značajno povećavaju produkciju IL-4 i IL-10, a ne utiču na nivo produkcije TGF-β i IFN-γ in vivo. Promena ugljenohidratne strukture ESL1 antigena (perjodatom tretirani ESL1, pESL1) snažno smanjuje produkciju IL-4 i IL-10, što ukazuje na važnost glikana za pokretanje Th2 i anti-inflamatornog imunskog odgovora. In vitro eksperimenti sa ESL1 i njegovim komponentama: 7C2C5Ag (antigen koji sadrži 45, 49 i 53-kDa glikoproteine) i rTsp53 (rekombinantni p53) su pokazali da svi ispitivani antigeni dovode do nepotpunog sazrevanja dendritskih ćelija, koje je praćeno smanjenom produkcijom IL-12p70 i povećanom produkcijom IL-10 i kapacitetom da promovišu Th2 i regulatorni imunski odgovor. Modifikacija glikana ESL1 nije uticala na fenotip dendritiskih ćelija, ali je dovela do smanjenja produkcije citokina IL-12p70 i IL-10 u tretiranim dendritskim ćelijama, što je rezultiralo sniženom produkcijom IL-10 i TGF-β od strane T ćelija. Prisustvo intaktnih glikana je bitno za indukciju Th2 i regulatornog odgovora in vitro. Ispitivanjem interakcije receptora sličnih Toll proteinu (engl. Toll-like receptors, TLR) i ESL1 antigena, pokazano je da ESL1 antigeni angažuju TLR2 i TLR4, dok se 7C2C5Ag vezuje samo za TLR2 i da su te interakcije zavisne od prisustva intaktnih ugljenohidratnih struktura. ESL1, pESL1, rTsp53 i 7C2C5Ag dovode do aktivacije MAP kinaza ERK1/2 i p38 u signalnom putu koji biva pokrenut interakcijom dendritiskim ćelijama sа ovim T. spiralis antigenima, dok pESL1 dovodi do slabe aktivacije obe ispitivane MAP kinaze... The helminth Trichinella spiralis communicates with the host immune system through excretory-secretory products (ESL1). ESL1 antigens drive immune response towards Th2 and regulatory type. However, there is no information about mechanisms by which ESL1 influences such polarization. Here, we investigated the impact of ESL1 and its components on immune response, Pattern Recognition Receptors involved in the interaction with these antigens and subsequently provoked signaling events in dendritic cells . ESL1 antigens significantly increased the production of IL-4 and IL-10, while they did not affect the levels of TGF-β and IFN-γ in vivo. Changes in the structure of ESL1 glycans greatly reduced the production of IL-4 indicating their importance for Th2 immune response. In vitro experiments with ESL1 and ESL1 components: 7C2C5Ag (containing 45, 49, and 53-kDa glycoproteins) and rTsp53 (recombinant p53) resulted in the same semimature dendritic cell phenotype accompanied by reduced production of IL-12p70 and elevated production of IL-10 and the capacity to promote Th2 and regulatory responses. Modification of ESL1 glycans (periodate treated ESL1, pESL1) did not change dendritic cell phenotype but had an impact on cytokine production of dendritic cells (reduced IL-12p70 and IL-10). Dendritic cells treated with pESL1 provoked low production of IL-10 and TGF-β in T cells, indicating the importance of intact glycans for Th2 and regulatory response induction. Considering investigation of Toll-like receptors (TLR) involved in the interaction with ESL1 antigens, we have found that TLR2 is engaged by ESL1 and 7C2C5Ag, while TLR4 interacts only with ESL1. These interactions are impaired with changes in carbohydrate structure of ESL1. ESL1, 7C2C5Ag and rTsp53 transiently activated ERK1/2 MAP kinase, weakly activated p38 kinase and these activations were glycan dependent. This study indicates for the first time that some components of ESL1 (7C2C5Ag and rTsp53) possess immunomodulatory properties and that glycans on ESL1 are important for immune response polarization.

Okratoksin A (OTA) pripada skupini mikotoksina, sekundarnih metabolita nekoliko vrsta plijesni. OTA uzrokuje tubulointersticijsko oštećenje bubrega čovjeka i životinja, te se smatra mogućim etiološkim čimbenikom endemske nefropatije, progresivne bolesti koja vodi ka bubrežnom zatajenju i smrti. U našim smo istraživanjima ispitivali ulogu apoptoze u razvoju nefropatije koju potiče OTA. Ispitivanja smo vršili na LLC-PK1 bubrežnim stanicama svinje. Tretiranje stanica s 5  M OTA tijekom 48 sati uzrokovalo je smanjenje stanične vijabilnosti za 30.8% te je potaknulo apoptozu u 15% stanica. Ipak, nismo uspjeli detektirat aktivaciju kaspaze-3. Opazili smo kratkotrajnu aktivaciju kinaza reguliranih izvanstaničnim signalima (ERK) i snažnu aktivaciju kinaza koje fosforiliraju N-kraj transkripcijskog faktora c-Jun (JNK) i p38 proteinskih kinaza aktiviranih mitogenima (MAPK) nakon 12- i 24-satnog tretiranja s 5  M OTA. OTA nije utjecao na ekspresiju proteina toplinskoga šoka 72 (Hsp72), koji se smatra inhibitorom apoptotičkih putova. U dosadašnjim istraživanjima je predloženo da mehanizam nefrotoksičnosti OTA uključuje umiranuje stanica proksimalnih tubula bubrega nekrozom. Ipak, naši rezultati ukazuju da bi umiranje stanica procesom apoptoze moglo biti značajno u razvoju nefrotoksičnosti koju uzrokuje OTA.

Different biological functions of hematopoietic cells are regulated by signals cells receive from their environment that may come from interactions with other cells or from soluble growth factors and cytokines. Although the effects of hematopoietic regulators are well described, the exact intracellular signaling cascades leading to various cellular responses are not fully elucidated. All hematopoietic growth factors and cytokines seem able to activate all the major signal transduction pathways simultaneously, and it appears that the same network of signaling proteins may coordinate numerous cellular functions. However, the differences that lead to the unique biological events of the particular cytokine, as well as the differences that determine lineage-specific blood cell differentiation are only gradually being uncovered. With the help of specific inhibitors of known signal transduction pathways, we have examined the contribution of particular signaling molecules of Jak/Stat, MAP kinase and PI-3 kinase pathways, as well as the activation of nuclear factor kappaB (NFkB) transcription factor on the proliferation and differentiation of murine bone marrow granulocyte-macrophage (CFU- GM) and erythroid (BFU-E and CFU-E) progenitors. Preliminary results demonstrated that the effects of the inhibitors on the hematopoietic colony formation were lineage-dependent, as well as dependent on erythroid progenitors' stage of differentiation. The obtained differences suggest that different signal transduction intermediates regulate erythroid and myeloid progenitor cell proliferation and differentiation. Differences in the susceptibility of the progenitor cells to the inhibitors used were also observed. The data is consistent with other evidences indicating that different threshold levels are one of the mechanisms by which the signaling specificity may be achieved. Mnogobrojne funkcije hematopoetskih ćelija u toku procesa hematopoeze, regulisane su brojnim signalima koje ćelije primaju iz svoje okoline i to kako od drugih ćelija tako i od brojnih regulatornih molekula. Iako su biološki efekti regulatora hematopoeze uglavnom dobro opisani, putevi prenošenja signala unutar ćelija na koje deluju nisu još uvek u potpunosti razjašnjeni. Savremena istraživanja ukazuju da gotovo svi poznati hematopoetski regulatori mogu da aktiviraju gotovo sve bitne puteve prenošenja signala unutar ćelija, što sve upućuje da ista mreža signalnih komponenti može da koordinira brojne ćelijske funkcije. Međutim, razlike u transdukciji signala koje dovode do jedinstvenog biološkog dejstva svakog citokina, kao i razlike u prenosu signala kojom se određuje lozno-zavisna diferencijacija krvnih ćelija nisu još poznati. Naša istraživanja započela su određivanjem učešća pojedinih komponenti JAK/STAT puta signalizacije, MAP kinazne kaskade i PI-3 kinaznog puta, kao i aktivacije transkripcionog faktora NFKB, u proliferaciji i diferentovanju opredeljenih matičnih ćelija granulocitno-monocitne (CFU-GM) i eritrocitne (BFU- E i CFU-E) loze kostne srži normalnih miševa. Početni rezultati ovih ispitivanja su ukazali na postojanje kako lozno-zavisnih razlika u odgovoru matičnih ćelija hematopoeze na pojedine inhibitore, tako i na zavisnost odgovora od stepena zrelosti matičnih ćelija u okviru iste loze. Dobijene razlike upućuju da su različiti učesnici signalnih puteva uključeni u regulaciju proliferacije i diferencijacije eritrocitnih i granulocitno-monocitnih progenitora. Ovo je jedan od mogućih načina kojim se možda omogućava selektivna ekspanzija ćelija određenih krvnih loza u zavisnosti od potreba organizma. Takođe, uočene su i razlike u pragu osetljivosti različitih kategorija opredeljenih matičnih ćelija hematopoeze na ispitivane inhibitore signalnih puteva, što ide u prilog podacima da su različiti pragovi osetljivosti jedan od mogućih mehanizama kojim se najverovatnije ostvaruje specifičnost delovanja signalnih puteva.

Kadherini su transmembranske molekule koje se sa svojim izvanstaničnim domenama povezuju s kadherinima susjednih stanica, a s citoplazmatske strane su vezane uz niti aktinskog citoskeleta pomoću molekula katenina. U normalnom epitelnom tkivu međustanična adhezija posredovana E-kadherinom povezuje susjedne stanice i daje im epitelnu organizaciju. U mnogim karcinomima, poremećena je ekspresija E-kadherina, što vodi promjeni morfologije stanica u fibroblastični oblik, ekspresije mezenhimalnih biljega, reorganizacije citoskeleta, te pojačane sposobnosti migracije. Reorganizacija citoskeleta, utječe na aktivnost mnogih gena, među kojima je vrlo važan urokinazni plazminogen aktivator (uPA). uPA je serinska proteaza koja im ključnu ulogu u fibrinolizi i razgradnji izvanstaničnog matriksa, te u invaziji i metastaziranju tumorskih stanica. U karcinomima mokraćnog mjehura gubitak funkcije E-kadherina upućuje na invazivne oblike tumora i na lošiju prognozu bolesnika. Ispitivali smo seriju staničnih linija karcinoma mokraćnog mjehura čovjeka različitih morfoloških karakteristika i ekspresije E-kadherina. Povećana ekspresija uPA korelirala je s gubitkom funkcije E-kadherina, fibroblastičnim fenotipom stanica, ekspresijom N-kadherina, ekspresijom izoforme katenina p120 od 120 kDa, te promjenama u organizaciji aktinskih niti. Transkripcija uPA gena bila je značajno povećana u stanicama fibroblastične morfologije (poput SW800 i J82), i do 20 puta u odnosu na stanične linije epitelne morfologije (poput SCaBER, RT112, 575A). Inhibitor aktivnosti ERK1 i 2 MAP kinaza, smanjivao je i aktivnost i ekspresiju uPA u svim staničnim tipovima bez obzira na morfologiju stanica. U SW800 i J82 staničnim linijama razina aktivnog c-Jun proteina povišena i do 8 puta u odnosu na epitelne stanice. Kurkumin, inhibitor JNK MAP kinaze smanjivao je izvanstaničnu aktivnost uPA, ali bez učinka na njegovu ekspresiju. Inhibitor p38 MAP kinaza nije imao učinka na ekspresiju uPA, niti na njegovu proteolitičku aktivnost. Egzogenom ekspresijom E-kadherina i palkoglobina u invazivnu staničnu liniju SW800 liniju pokušali smo uspostaviti adhezijske veze posredovanje E-kadherinom, te na tom modelu izučiti signalne puteve koji reguliranu transkripciju uPA. Dobiveni klonovi stanica pokazali su visoku ekspresiju adhezijskih molekula, te njihov smještaj na staničnoj membrani. Usprkos tome što su stanice formirale adhezijske komplekse na staničnoj membrani, kompleksi nisu bili funkcionalni, jer nije došlo do njihovog povezivanja s aktinskim nitima. Na taj način je izostala reorganizacija aktinskih niti i trajna promjena morfologije u epitelni oblik. Zaključili smo da u staničnim linijama karcinoma mokraćnog mjehura čovjeka uPA ekspresija korelira s funkcijom E-kadherina. Za ekspresiju je nužna aktivnost ERK MAP kinaza. U SW800 staničnoj liniji postoji negativni regulatorni mehanizam koji ne dozvoljava funkcionalnost E-kadherina, odnosno njegovo povezivanje s nitima aktina.

Mitogen-activated protein (MAP) kinase cascades represent one of the major signal systems used by eukariotic cells to transduce extracellular signals into cellular responses. Activation of the MAP kinases plays an important role in many cellular processes such as cell proliferation, differentiation and cell death. Bisperoxovanadate-1,10-phenanthroline (bpV) is a strong insulin mimetic and potent protein-tyrosine-phosphatase inhibitor and activator of insulin receptor kinase. The effect of bpV on the level and activity of MAP kinases (p38, JNK 1, ERK 1 and ERK 2) in PC-12 cells (rat adrenal pheochromocytoma) was observed using different time of incubation and doses of bpV. To determine the levels of MAP kinases, cell extracts were fractionated by 12% SDS polyacrylamide gel electrophoresis, the separated proteins were probed with mentioned antibodys for MAP kinases. To examine kinase activity, the cell extracts were immunoprecipitated with antibodys for MAP kinases, separated and probed with anti-phospho-tyrosine antibody. The blots were determined using the enhanced chemiluminiscence reaction. The same steady-state level of p38, JNK 1, ERK 1 and ERK 2 were determined in control and treated cultures without regard to time of incubation and doses of bpV. The tyrosine phosphorylation of JNK 1, ERK 1 and ERK 2 was observed after 20 minutes, and of p38 after one houre, with 100 mM bpV.

Vidi zbornik.