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El manganismo es un desorden neurológico originado por exposición crónica almanganeso (Mn) que presenta características clínicas y vías de señales similares a las de laenfermedad de Parkinson Idiopática. Dentro del sistema nervioso central (SNC), el Mn seacumula preferentemente en los ganglios basales, generando una pérdida progresiva delas neuronas dopaminérgicas. A nivel celular, el Mn se acumula en las mitocondrias y loslisosomas, donde genera especies reactivas de oxígeno (ROS) que alteran la integridad deestas organelas. Como resultado final, el Mn activa mecanismos de muerte celular.Las células gliales pueden resultar activadas en respuesta a insultos en el SNC, entrelos cuales se encuentra la acumulación de Mn. En particular, la microglia puede producir yliberar altos niveles de especies reactivas del oxígeno y nitrógeno (RNS), y citoquinas proinflamatorias.En este sentido, la neuroinflamación puede exacerbar el daño neuronal. Enel contexto del manganismo, la activación de la microglia jugaría un papel importante en laneurotoxicidad inducida por Mn.En el presente trabajo se investigó la activación y vulnerabilidad de la microgliaexpuesta a Mn, las vías de muerte celular involucradas y el rol de la autofagia en lasupervivencia celular. Adicionalmente se estudió el efecto de los factores liberados por lamicroglia desafiada con Mn sobre la viabilidad de neuronas dopaminérgicas.Los estudios realizados en la línea BV-2 de microglia murina demostraron que laexposición a Mn2+ induce cambios morfológicos, moleculares y funcionales consistentescon la activación microglial. En particular, el Mn2+ promueve la producción de óxido nítrico(NO) y activa la síntesis de las citoquinas pro-inflamatorias TNF-α e IL-1β. En las mismascondiciones, el Mn2+ ejerce un efecto citotóxico mediado, en parte, por la generación deROS. Se demostró que el Mn2+ actúa sobre distintos blancos celulares, promoviendo laactivación de distintas vías relacionadas con la muerte celular: i) genera daño al ADN; ii)induce la permeabilización de la membrana lisosomal conduciendo a la liberación decatepsinas al citosol; iii) actúa sobre la mitocondria desencadenando la liberación de AIF yde citocromo c al citosol. En su conjunto, estos eventos favorecen la ejecución de la necrosis regulada (NR). En particular, se demostró que las vía lisosomal y parthanatosconstituyen los principales mecanismos intervinientes en la muerte inducida por Mn2+. Sibien en este contexto las caspasas resultan activadas, no desempeñan un rol en la muertecelular. Además, la exposición a Mn2+ promovió la activación de la autofagia. No obstante,en las condiciones ensayadas, este proceso no cumpliría un rol en la supervivencia celular.Por su parte, los estudios realizados en la línea de neuroblastoma humano SH-SY5Ydemuestran que los factores solubles producidos por las células BV-2 expuestas a Mn2+ soncitotóxicos, sugiriendo que la microglia activada contribuye a la muerte neuronal inducidapor el metal.En conjunto, nuestros resultados demuestran por primera vez que el Mn2+, además deinducir la activación de la microglia, promueve la ejecución de la muerte celular necróticaregulada con la participación de las vías lisosomal y parthanatos. Además, la microgliaexpuesta al metal produciría factores neurotóxicos que favorecen la muerte de lasneuronas. Los hallazgos obtenidos contribuyen al conocimiento de los efectos citotóxicosdel Mn, poniendo en evidencia la necesidad de investigar con mayor profundidad lacompleja relación que existe entre los mecanismos que desencadenan la activación y lamuerte microglial. A su vez, resulta fundamental comprender la interacción glia-neuronadurante la progresión del manganismo, con el fin de realizar una propuesta terapéuticaque contemple los mecanismos que subyacen a la muerte neuronal. Manganism is a neurological disorder induced by chronic manganese (Mn) overexposure with symptoms and signaling pathways resembling those of Idiopatic Parkinson’s Disease. In the central nervous system (CNS), Mn preferentially accumulates in the basal ganglia promoting the progressive loss of dopaminergic neurons. At the cellular level, Mn accumulates in mitochondria and lysosomes generating high levels of reactive oxygen species (ROS). This ROS accumulation induces organelle dysfunction leading to cell death. Glial cells become activated in response to several insults in the CNS, including Mn accumulation. Particularly, microglia produce and release pro-inflammatory cytokines and high levels of reactive oxygen and nitrogen species (RNS). Thus, neuroinflammation could exacerbate neuronal damage. In the context of manganism, microglial activation seems to play an important role in manganese-induced neurotoxicity. In the present work, we investigated the activation and vulnerability of microglia exposed to Mn, the cell death pathways involved in cytotoxicity and the role of autophagy in cell survival. Additionally, we studied the effect of Mn-exposed microglia-derived factors on dopaminergic neuron viability. Results obtained employing the murine microglial BV-2 cell line shown that Mn2+ exposure induced morphological, molecular and functional changes consistent with microglial activation. Particularly, Mn2+ promotes nitric oxide production and activates the synthesis of pro-inflammatory cytokines TNF-α and IL-1β. In the same conditions, Mn2+ exerts a cytotoxic effect partially due to ROS generation. We demonstrated that Mn2+ influences different cellular structures promoting the activation of several cell death pathways: i) induces DNA damage; ii) promotes lisosomal membrane permeabilization leading to cathepsins release into the cytosol; iii) acts on mitochondria causing AIF and cytochrome c release. Altogether these events contribute to the execution of regulated necrosis (NR). Particularly, we demonstrated that lysosomal cell death pathway and parthanatos are the main mechanisms involved in Mn2+ -induced cytotoxicity. Although caspases are activated in our model, they play a non-apoptotic role. Furthermore, Mn2+ exposure activates autophagy; however, this process is not functional to cell survival. On the other hand, results obtained with the human neuroblastoma SH-SY5Y cell line shown that Mn2+ -induced microglia-derived soluble factors are cytotoxic, suggesting that activated microglia contributes to Mn2+ -induced neuronal cell death. Taken together, our results demonstrate for the first time that, in addition to induce microglial activation, Mn2+ also promotes the execution of NR in which lysosomal and parthanatos cell death pathways are involved. In addition, we show that microglia exposed to Mn2+ release neurotoxic factors that enhance neuronal cell death. These findings contribute to the knowledge of the mechanisms involved in Mn toxicity. The relevance of understanding both the complex relationship between microglial activation and cell death and glia-neuron interaction in manganism, is highlighted. This comprehension will make it possible to propose novel therapeutic strategies for the treatment of manganism and possibly other associated neurodegenerative diseases. Fil: Porte Alcon, Soledad. Consejo Nacional de Investigaciones Científicas y Técnicas. Oficina de Coordinación Administrativa Ciudad Universitaria. Instituto de Química Biológica de la Facultad de Ciencias Exactas y Naturales. Universidad de Buenos Aires. Facultad de Ciencias Exactas y Naturales. Instituto de Química Biológica de la Facultad de Ciencias Exactas y Naturales; Argentina. Universidad de Buenos Aires. Facultad de Ciencias Exactas y Naturales. Laboratorio de Disfunción Celular en Enfermedades Neurodegenerativas y Nano-medicina; Argentina

El manganismo es un desorden neurodegenerativo originado por la sobreexposición crónica a Mn, cuyo cuadro clínico y vías de señales se asemejan a los de la Enfermedad de Parkinson Idiopática. El Mn se acumula preferentemente en los ganglios basales y en particular, en las mitocondrias y lisosomas, donde puede generar especies reactivas de oxígeno y afectar las membranas de estas organelas. La permeabilización de la membrana lisosomal (PML) conduce a la liberación de hidrolasas al citosol y a la apoptosis y puede también comprometer la degradación autofágica. En el presente trabajo se investigó el daño lisosomal inducido por Mn y el impacto de este evento en la muerte de las células C6 de glioma de rata. Parte de los resultados obtenidos fueron trasladados a un modelo in vivo de intoxicación aguda con Mn. Por lo tanto, el enfoque estuvo dirigido al estudio de la posible participación de la vía lisosomal en la apoptosis inducida por Mn y al rol potencial de la autofagia en este contexto celular. Los ensayos in vitro se realizaron empleando células expuestas a MnCl2 en distintas condiciones de incubación. Se demostró que el Mn induce un aumento en el tamaño de las vesículas ácidas que puede ser totalmente prevenido por preincubación con antioxidantes. Asimismo, la exposición al metal genera PML y liberación de Catepsina D (CatD) al citosol, procesos que tienen lugar rio arriba de la injuria a la mitocondria. El estudio del rol de las catepsinas en la vía de muerte celular apoptótica demostró que las CatD y B regulan los niveles de expresión de FasL, intervienen en el clivaje de caspasa-8 y Bid y en la activación de la vía de muerte mitocondrial. En este contexto, el Mn activó la autofagia como un mecanismo de supervivencia celular. Los estudios in vivo sugieren que los efectos tóxicos del Mn resultan en un daño a los astrocitos del striatum y en la alteración de los niveles de expresión de la CatD en las neuronas de ciertos ganglios basales involucrados en el manganismo. En conjunto, nuestros resultados demuestran por primera vez que los lisosomas constituyen un blanco estratégico de la toxicidad del Mn, integrando la cascada de señales implicadas en la apoptosis. En este escenario, la autofagia se desencadena en un intento de rescatar a las células de la muerte. Estos hallazgos contribuyen al conocimiento de los mecanismos de daño posiblemente activados en el manganismo y probablemente en otras enfermedades neurodegenerativas. Manganism is a neurodegenerative disorder caused by chronic Mn overexposure whose symptoms and signaling pathways resemble those of idiopathic Parkinson's disease. Mn accumulates within the basal ganglia, particularly in mitochondria and lysosomes. Hence, Mn- induced reactive oxygen species may disrupt the integrity of these organelles. Lysosomal membrane permeabilization (LMP) causes the release of cathepsins and other hydrolases from the lysosomal lumen to the cytosol leading to apoptotic cell death. Moreover, LMP may induce alterations in the autophagic degradation pathway. In the present study, Mn-induced lysosomal damage and its impact on C6 rat glioma cell death were investigated. Some of these results were validated in an acute Mn intoxication in vivo model. Our approach was to study the possible involvement of the lisosomal pathway in manganese-induced apoptosis and the potential role of autophagy in this cellular context. For in vitro assays, cells were exposed to MnCl2 in different incubation conditions. We found that Mn induces an increase in acidic vesicles size, which is completely prevented by antioxidants. Moreover, Mn exposure generates PML and the release of cathepsin D (CatD) to the cytosol, both processes taking place upstream to the mitochondrial damage. CatD and B are involved in both caspase-8 and Bid cleavage, leading to the activation of the mitochondrial apoptotic pathway. Moreover, they regulate FasL expression levels. In this context, autophagy is activated as a survival pathway. In vivo studies suggested that the toxic effects of Mn result in both striatal astrocyte damage and altered expression of CatD in neurons of the basal ganglia. Taken together, our results demonstrate for the first time that lysosomes are a strategic target for Mn toxicity, integrating the signal cascades involved in apoptosis. In this scenario, autophagy is triggered as an attempt to rescue the cells from death. These findings contribute to the understanding of the damage mechanisms possibly activated in manganism and probably in other neurodegenerative diseases. Fil: Gorojod, Roxana Mayra. Universidad de Buenos Aires. Facultad de Ciencias Exactas y Naturales; Argentina.

Tese de mestrado. Biologia (Biologia Humana e Ambiente). Universidade de Lisboa, Faculdade de Ciências, 2010 Submitted by Lurdes Saramago (lurdes.saramago@fc.ul.pt) on 2011-03-31T17:30:44Z No. of bitstreams: 1 ulfc090530_tm_Rui Lucas.pdf: 1116532 bytes, checksum: e936b7f3e6f9937282168aa34abc0db2 (MD5) Made available in DSpace on 2011-03-31T17:31:04Z (GMT). No. of bitstreams: 1 ulfc090530_tm_Rui Lucas.pdf: 1116532 bytes, checksum: e936b7f3e6f9937282168aa34abc0db2 (MD5) Previous issue date: 2010

Tese de mestrado, Biologia (Biologia Humana e Ambiente), 2008, Universidade de Lisboa, Faculdade de Ciências Nível de preservação: critical, Criado em: 2009-09-18 18:32:27, Criado por: creator:LSARAM, Alterado em: 2010-01-08 19:26:52, Modificado por: super:LSARAM Made available in DSpace on 2010-07-27T08:56:50Z (GMT). No. of bitstreams: 2 19063_ulfc080484_tm.pdf: 575757 bytes, checksum: ff448ddd661c2201da0187416c193a73 (MD5) 19063.xml: 8447 bytes, checksum: 8574de195b7cdae314e72a271d49b69d (MD5) Previous issue date: 2008