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The Rad5 protein is an SWI/SNF family ubiquitin ligase that contains an N-terminal HIRAN domain and a RING C3HC4 motif. The HIRAN domain is critical for recognition of the stalled replication fork during the replication process and acts as a sensor to initiate the damaged DNA checkpoint. It is a conserved domain widely distributed in eukaryotic organisms and is present in several DNA-binding proteins from all kingdoms. Here we showed that distant species have important differences in key residues that affect affinity for ssDNA. Based on these findings, we hypothesized that different HIRAN domains might affect fork reversal and translesion synthesis through different metabolic processes. To address this question, we predicted the tertiary structure of both yeast and human HIRAN domains using molecular modeling. Structural dynamics experiments showed that the yeast HIRAN domain exhibited higher structural denaturation than its human homolog, although both domains became stable in the presence of ssDNA. Analysis of atomic contacts revealed that a greater number of interactions between the ssDNA nucleotides and the Rad5 domain are electrostatic. Taken together, these results provide new insights into the molecular mechanism of the HIRAN domain of Rad5 and may guide us to further elucidate differences in the ancient eukaryotes HIRAN sequences and their DNA affinity. Communicated by Ramaswamy H. Sarma.

CNPq - Conselho Nacional de Desenvolvimento Científico e Tecnológico FAPEMIG - Fundação de Amparo à Pesquisa do Estado de Minas Gerais CAPES - Coordenação de Aperfeiçoamento de Pessoal de Nível Superior Cálculos de Perturbações de Energia Livre (Free Energy Perturbation, FEP) são, na atualidade, rotineiramente aplicados na descoberta de fármacos para estimar a energia de Gibbs relativa de ligação de pequenas moléculas a alvos biomoleculares de interesse. A aplicação de técnicas de amostragem estendida pode melhorar a correlação entre predições e dados experimentais, especialmente em sistemas com mudanças conformacionais. Devido ao grande número de perturbações necessárias em uma campanha de descoberta de fármacos, a preparação manual de cálculos de FEP não é viável. Neste trabalho, apresentamos o PyAutoFEP, uma ferramenta flexível e de código aberto para automatizar a preparação de cálculos de FEP para energia de Gibbs relativa de ligação. PyAutoFEP foi escrito em Python3 e automatiza a geração de mapas de perturbação, topologias duplas, construção de sistemas para simulações de Dinâmica molecular e análise. O PyAutoFEP suporta diversos campos de força, incorpora diferentes versões de métodos de amostragem REST2 e esquemas flexíveis de janelas de λ para representar a perturbação. Para validar a ferramenta PyAutoFEP, esta foi aplicada para uma série de 14 ligantes do receptor Farnesóide X. Este sistema fez parte do desafio para a comunidade Grand Challenge 2, organizado pelo grupo Drug Design Data Resources. Uma média de 88% de sinais corretos das predições foi observado e 75% das predições alcançaram erros menores do que 1,5 kcal/mol. Resultados utilizando os campos de força Amber03/GAFF, CHARMM36m/CGenFF e OLSA-AA/M/LigParGen obtiveram r de Pearson de 0,71 ± 0,13, 0,30 ± 0,27 e 0,66 ± 0,20, respectivamente. Os resultados utilizando o Amber03/GAFF e OPSA-AA/M/LigParGen foram comparáveis às melhores submissões originais ao Grand Challenge 2. A aplicação da REST2 melhorou os resultados utilizando o CHARMM36m/CGenFF (r de Pearson = 0,43 ± 0,21), porém pouco impacto foi observado para os outros campos de força. Finalmente, utilizando um modelo estatístico, foi estimada a probabilidade de descoberta de moléculas com potência ao menos uma unidade de 1 pKi melhor do que um protótipo hipotético, quando uma ferramenta como o PyAutoFEP é aplicada para triar 10 ou 100 análogos. As probabilidades são até 7 vezes maiores se comparadas àquela obtida usando seleção aleatória, quando 100 moléculas são triadas, indicando que o PyAutoFEP pode ser útil em problemas de otimização de protótipos. O PyAutoFEP está disponível no repositório do grupo, https://github.com/lmmpf/PyAutoFEP. Free Energy Perturbation (FEP) calculations are now routinely used in drug discovery to estimate the relative free energy of binding (RFEB) of small molecules to a biomolecular target of interest. Using enhanced sampling can improve the correlation between predictions and experimental data, especially in systems with conformational changes. Due to the large number of perturbations required in drug discovery campaigns, manual setup of FEP calculations is no longer viable. Here, we introduce PyAutoFEP, a flexible and open-source tool to aid the setup of RFEB FEP. PyAutoFEP is written in Python3, and automates the generation of perturbation maps, dual-topologies, system building and molecular dynamics (MD), and analysis. PyAutoFEP supports multiple force fields, incorporates two flavors of REST2 enhanced sampling method, and allows flexible λ values along perturbation windows. To validate PyAutoFEP, it was applied to a set of 14 Farnesoid X receptor ligands, a system included in the Drug Design Data Resource Grand Challenge 2. A mean 88% correct sign prediction was achieved, and 75% of the predictions had an error below 1.5 kcal/mol. Results using Amber03/GAFF, CHARMM36m/CGenFF, and OLSA-AA/M/LigParGen had Pearson’s r values of 0.71 ± 0.13, 0.30 ± 0.27 and 0.66 ± 0.20, respectively. The Amber03/GAFF and OLSA-AA/M/LigParGen results were on par with the top Grand Challenge 2 submissions. Applying REST2 improved the results using CHARMM36m/CGenFF (Pearson’s r = 0.43 ± 0.21), but had little impact on the other force fields. Finally, we estimated the probability of finding a molecule 1 pKi better than a lead when using PyAutoFEP to screen 10 or 100 analogs. The probabilities, when comparing to random sampling, increased up 7-fold when 100 molecules were to be screened, suggesting that PyAutoFEP would likely be useful for lead optimization. PyAutoFEP is available on GitHub at https://github.com/lmmpf/PyAutoFEP.

CAPES - Coordenação de Aperfeiçoamento de Pessoal de Nível Superior A chagasina, um inibidor endógeno de cisteíno proteases de Trypanosoma cruzi, regula a atividade da protease parasitária cruzaína durante o ciclo de vida do parasita. Experimentos in vitro mostram que a chagasina também inibe a catepsina L, uma enzima homóloga humana. Enquanto a chagasina inibe ambas enzimas com potências similares, mutações nesta proteína tem diferentes efeitos na ligação para essas enzimas. Os mutantes T31A e T31A/T32A se ligam bem à catepsina L, mas a afinidade deles para a cruzaína cai de aproximadamente 40 a 140 vezes. Por outro lado, o mutante W93A mantém potência frente à cruzaína, mas perde afinidade contra a catepsina L. Neste trabalho, foram realizados estudos de modelagem comparativa e simulações de dinâmica molecular para entender a seletividade de inibição da cruzaína e catepsina L pelos mutantes da chagasina W93A, T31A e T31A/T32A. Os resultados possibilitaram obtenção de um perfil de interações não ligadas nas interfaces de cada mutante em complexo com as cisteíno proteases. Além disso, observamos diferenças na conformação de ligação dos loops L2 e L6 da chagasina do mutante W93A, favorecendo as interações com a cruzaína e reduzindo as interações com a catepsina L. Estas diferenças são associadas com uma dissociação parcial do complexo W93Acatepsina L, fornecendo uma possível causa para a seletividade do mutante W93A em relação à cruzaína. Adicionalmente, foram realizados cálculos de energia livre para avaliação do impacto de mutações na afinidade dos complexos da cruzaína e catepsina L através do método MM/GBSA. Apesar deste método ter como vantagem seu baixo custo computacional, observamos baixa correlação entre os valores de variação de energia livre de ligação preditos por MM/GBSA e os dados experimentais.

Os venenos de serpentes são constituídos por uma complexa mistura de substâncias que apresentam diferentes ações e atividades. Essassubstâncias são de grande interesse na pesquisa e desenvolvimento de novos fármacos devido ao seu potencial biotecnológico. Além disso, o estudo dos venenos é importante para a compreensão da variabilidade, patofisiologia e antigênicidade inerente a eles. De acordo com essas propriedades dos venenos de serpentes, o presente estudo procurou caracterizar o veneno de Bothriopsis bilineata smaragdina, uma serpente arbórea da família Viperidae, cuja composição do veneno ainda é pouco conhecida. Para isso, foram avaliados o perfil proteômico do veneno e suas atividades biológicas e antigênicas. Os resultados obtidos identificaram um total de 122 proteínas, dividas em 22 subgrupos. Dentre elas estão as metaloproteinases de veneno de serpentes (SVMPs, 45,93%), lectinas do tipo C (Snaclecs, 22,37%), serino-proteinases de veneno de serpentes (SVSPs, 11,11 %), L-aminoácido oxidases (LAAOs, 6,62 %), fosfolipases B(2,69 %), 5 nucleotidases (2,37 %), fosfolipases A2 (PLA2, 2,22 %),fosfodiesterases (2,2 %), proteínas do veneno ricas em cisteína (1,97 %) e outras proteínas. Experimentalmente, os ensaios in vitro demonstraram que o veneno possui atividade de enzimas pertencentes ás famílias das SVMP, SVSP, Hialuronidase (Hyal), PLA2 e LAAO, corroborando os achados proteômicos. O veneno também foi capaz de causar edema, hemorragia e letalidade in vivo. Além disso, as atividades de hemorragia e edema foram neutralizadas pelos soros antibotrópicos peruano e brasileiro, indicando a presença de anticorpos com reatividade cruzada em ambos os soros comerciais utilizados. Os resultados obtidos neste estudo contribuíram para uma melhor compreensão do veneno de Bothriopsis bilineata smaragdina edas toxinas que o compõe. Snake venoms are a complex mixture of substances with different actions and activities. These substances are of great interest in research and development of new drugs, due to their biotechnological potential. In addition, venom studies are important for understanding the variability, pathology and antigenicity inherent in them. According to these snake venom properties, the aim of the present study was to characterize Bothriopsis bilineata smaragdina venom, an arboreal snake from the Viperidae family, whose venom still little known. To this end, the proteomic profile of the venom and its biological and antigenic activities were analysed. The results identified a total of 122 proteins, divided into 16 different subgroups. Among them are metalloproteinases (SVMPs, 45.93%), snake C-type lectins (Snaclecs, 22.37%), snake venom serine proteinases (SVSPs, 11.11%), L-amino acid oxidases (LAAOs, 6.62%), phospholipases B (2.69%), 5nucleotidases (2.37%), phospholipases A2 (PLA2, 2.22%), phosphodiesterase (PDE, 2.20%), cystein-rich venom proteins (1.97%) and other proteins. Experimentally, the in vitro enzymatic assays showed that the venom has SVMP, SVSP, Hyaluronidase (Hyal), PLA2 and LAAO activities. The venom was also capable of causing edema, haemorrhage and lethality in vivo. Furthermore, the edema and hemorrhage activities were neutralized by the Peruvian and Brazilian antibothropic serum, indicating the presence of crossreactive antibodies in both commercial antivenoms. The results of this study contributed to a better understanding of Bothriopsis bilineata smaragdina venom and its toxins

O vírus Ebola (EBOV) é um vírus envelopado, filamentoso, e que contém um genoma de RNA de fita negativa. O EBOV pertence à família Filoviridae, e é causador de uma doença devastadora, com uma taxa de mortalidade de cerca de 50-90%. Os primeiros sintomas desenvolvidos por pacientes infectados são febre, mal-estar e dor muscular e podem ser seguidos por sangramento e falha de órgãos e tecidos. Os alvos iniciais do Ebola são macrófagos e células dendríticas, mas sua capacidade de infecção abrange todos os tipos de células, com exceção de linfócitos. O Ebola conecta-se através da membrana plasmática e, depois disso, a glicoproteína viral induz a absorção por endocitose. O processo é dependente da ação das proteínas da superfície celular. Após a absorção, as partículas viajam em compartimentos onde a glicoproteína viral é clivada e fundida na membrana endossomal, o que resulta na liberação dos compartimentos virais no citoplasma do hospedeiro. Foi feito o estudo do mecanismo de infecção do EBOV e a coleta das proteínas hospedeiras conhecidas até o momento, por participar diretamente ou indiretamente na infecção. Esta abordagem de mineração recrutou 133 proteínas hospedeiras. Com elas, foi construído uma via completa do interatoma para representar o ciclo de infecção do Ebola nos hospedeiros. Foi feita a análise também dos homólogos de cada proteína humana coletada ao longo da árvore taxonômica, para inferir seu clado/época de origem. Os resultados da análise de origem evolutiva permitiram inferir que o vírus poderia infectar desde Euleostomi, sugerindo que animais como peixes e pets poderiam ser infectados e retransmitir o vírus para outros hospedeiros, como o homem. Além disso, analisamos duas séries de dados GEO para expressão gênica após a infecção pelo Ebola, através do enriquecimento pelo KEGG, criando um perfil de infecção viral. Inicialmente, processos envolvendo controle celular e metabolismo foram enriquecidos, seguidos de vários outros processos de imortalização e supressão do sistema imune. Em conclusão, a infecção pelo Ebola ocorre com a interação com proteínas antigas na membrana e internas, algumas porém são mais novas. A construção da via possibilita a criação de um estudo sistemático a infecção do vírus e quais seriam os possíveis alvos terapêuticos. Ebola virus (EBOV) is an enveloped, filamentous virus that contains a negativestranded RNA genome. EBOV belongs to the Filoviridae family, and causes a devastating disease, with a mortality rate of about 50-90%. The first symptoms developed by infected patients are fever, malaise and muscle pain and can be followed by bleeding and failure of organs and tissues. The initial targets of Ebola are macrophages and dendritic cells, but their ability to infect all types of cells, with the exception of lymphocytes. Ebola connects through the plasma membrane and, thereafter, a viral glycoprotein induces uptake by endocytosis. The process is dependent on the action of the proteins of the cell life. After absorption, as particles travel in compartments where a viral glycoprotein is cleaved and fused to the endosomal membrane, which results in the release of viral compartments without host cytoplasm. The study of the mechanism of infection of the EBOV and a collection of the hosted proteins was carried out, by participating directly or indirectly in the infection. This mining approach recruited 133 host proteins. With them, a complete interactive route was constructed to represent the Ebola infection cycle in hosts. An analysis was also made of the homologues of each human protein collected along the taxonomic tree to infer its clade/epoch the origin. The results of the analysis of evolutionary origin have allowed inferring that the virus can infect from Euleostomi, suggesting that animals such as fish and pets might be infected and retransmit the virus to other hosts, such as man. In addition, we analyzed two datasets, through KEGG enrichment, creating a profile of viral infection. Initially, processes involving cellular control and metabolism were enriched, followed by several other processes of immortalization and suppression of the immune system. In conclusion, an Ebola infection occurs with an interaction with old membrane and internal proteins, some still are younger. The construction of the pathway allows the creation of a systematic study of virus infection and what the possible therapeutic targets might be.

No Brasil, durante o ano de 2015 (últimos dados disponíveis), foram registrados 106.983 casos de acidentes com animais peçonhentos. Desse total, 19.495 envolveram aranhas (18,22%). O estado de Minas Gerais apresentou o maior número de acidentes com animais peçonhentos notificados com 19.474 casos registrados, sendo que 2.269 acidentes foram com aranhas (11,6%). Dentre os acidentes com Aranha, destaca-se o gênero Loxosceles (aranha-marrom), responsável por 58% dos acidentes com aranhas em que houve identificação da espécie. No mundo, já foram identificadas cerca de 100 espécies diferentes de Loxosceles, dentre elas, 10 são encontradas no Brasil. As espécies de maior importância médica são: L. intermedia, L. gaucho, L. similis e L. laeta. O veneno da aranha-marrom possui uma composição extremamente complexa, contendo diversas toxinas. Dentre as enzimas foram identificadas: hidrolases, hialuronidases, lipases, peptidases, colagenases, alcalino fosfatase, 5-ribonucleotidase, fosfohidrolases e proteases. Embora, provavelmente todas as enzimas presentes no veneno sejam capazes de contribuir de alguma forma para a progressão da lesão decorrente do acidente, somente as esfingomielinases D (SMase D), lipases presentes no veneno, foram capazes de produzir lesões dermonecróticas, hemólise e agregação plaquetária em animais de laboratório. Foi demonstrado em laboratório que as SMase D possuem diversos substratos e embora tenha sido demonstrado que em meio fisiológico a SMase D de L. laeta é capaz de liberar a colina da lisofosfatidilcolina (LPC), uma molécula de imunosinalização derivada de fosfatidilcolina (PC), assim gerando ácido lisofosfatídico (LPA), conhecido por induzir várias respostas biológicas e patológicas, o mecanismo das SMAses D causador dermonecrose ainda não foi totalmente elucidado. Recentemente foi identificado um motivo bem conservado na porção C-Terminal das SMases D (ATXXDNPW) de diferentes espécies e gêneros, logo após a última -hélice do TIM barril (/)8. Desta forma, o objetivo deste trabalho foi avaliar os efeitos da mutação de aminoácidos conservados D277 e W280 na porção C-Terminal da esfingomielinase rLID1 do veneno de Loxosceles intermedia. As proteínas recombinantes rLID1, rLID1_D (D277A), rLID1_W (W280A) e rLID1_DW (D277A e W280A) foram submetidas a modelagem e dinâmica molecular a fim de avaliar os impactos das mutações in silico. Constatou-se que as mutações aumentam a flexibilidade da alça catalítica da proteína. Após a avaliação in silico, as proteínas foram expressas em BL21 (DE3) Arctic Express, porém, somente as proteínas rLID1, rLID1_D e rLID1_W ficaram solúveis. As proteínas solúveis foram purificadas utilizando cromatografia de afinidade e logo em seguida, cromatografia de gel filtração. Após a obtenção das proteínas puras, foi realizado o teste enzimático para avaliar a atividade das proteínas e foi observado que a proteína mutante rLID1_D possui atividade enzimática similar a proteína wildtype rLID1 enquanto a proteína rLID1_W possui atividade enzimática superior. Em seguida, foi realizado o teste biológico em coelho e foi constatado que as proteínas mutantes são capazes de causar dermonecrose, porém, a proteína rLID1_W, na quantidade testada, possui capacidade muito inferior a proteína wildtype. Nossos dados indicam que as mutações na região C-Terminal da rLID1 impactam na atividade enzimática e biológica da proteína. In Brazil, during the year 2015 (last available data), there were 106,983 cases of accidents with venomous animals. Of this total, 19,495 involved spiders (18.22%). The state of Minas Gerais had the highest number of accidents with venomous animals reported with 19,474 recorded cases, of which 2,269 were with spiders (11.6%). Among the accidents with Spider, the genus Loxosceles (brown spider) stands out, responsible for 58% of the spider accidents in which the species was identified. In the world, about 100 different species of Loxosceles have been identified, of which 10 are found in Brazil. The species of major medical importance are: L. intermedia, L. gaucho, L. similis and L. laeta. The venom of the brown spider has an extremely complex composition, containing several toxins. Among the enzymes were identified: hydrolases, hyaluronidases, lipases, peptidases, collagenases, alkaline phosphatase, 5-ribonucleotidase, phosphohydrolases and proteases. Although probably all the enzymes present in the venom are able to contribute in some way to the progression of the injury resulting from the accident, only sphingomyelinases D (SMase D), a lipase present in the venom, were able to produce dermonecrotic lesions, hemolysis and platelet aggregation In laboratory animals. It has been demonstrated in the laboratory that SMase D has several substrates and although it has been demonstrated that in physiological medium the SMase D of L. laeta is capable of releasing choline from lysophosphatidylcholine (LPC), an immunosin- guishing molecule derived from phosphatidylcholine (PC), thus generating lysophosphatidic acid (LPA), known to induce various biological and pathological responses, the mechanism of SMAse D causing dermonecrosis is still not fully elucidated. Recently, a well conserved motif was identified in the C-Terminal portion of SMasesD (ATXXDNPW) of different species and genera, shortly after the last -helix of the TIM barrel ( / )8. Thus, the objective of this work was to evaluate the effects of the conserved D277 and W280 amino acid mutation on the C-terminal portion of the rLID1 sphingomyelinase from the Loxosceles intermedia venom. The recombinant proteins rLID1, rLID1_D (D277A), rLID1_W (W280A) and rLID1_DW (D277A and W280A) were submitted to modeling and molecular dynamics in order to evaluate the impact of mutations in silico. The mutations were found to increase the flexibility of the protein's catalytic loop. After in silico evaluation, the proteins were expressed in BL21 (DE3) Arctic Express, however, only the rLID1, rLID1_D and rLID1_W proteins were soluble. Soluble proteins were purified using affinity chromatography and then, gel filtration chromatography. After obtaining the purified proteins, the enzymatic assay was performed to evaluate the activity of the proteins and it was observed that the mutant rLID1_D has enzymatic activity similar to the wildtype protein rLID1 while the rLID1_W protein has superior enzymatic activity. After that, it was performed a biological assay and mutant proteins were found to be capable of causing dermonecrosis, but the rLID1_W protein, in the concentration used, has much lower capacity than the wildtype protein. Our data indicates that the mutation on C-Terminal of rLID1 impacts both biological and enzymatic activity of the protein.