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Este trabajo aborda la búsqueda de compuestos químicos con carácter inhibitorio de la actividad de flavoenzimas de microorganismos patógenos. Concretamente se centra en la búsqueda de inhibidores de la enzima NADPH-flavodoxina reductasa del fitopatógeno Xanthomonas axonopodis pv citri denominada XacFPR. Esta bacteria es conocida por provocar la enfermedad denominada cancrosis o cáncer de cítricos que afecta a múltiples plantaciones y cultivos alrededor del mundo provocando necrosis y la caída prematura de los frutos. Por tanto esta infección supone grandes pérdidas económicas a nivel global y resulta de vital importancia desarrollar un bactericida útil. Con el fin de lograr este objetivo se escogió como diana terapéutica la XacFPR, ya que interviene en procesos de fotosíntesis y respuesta a estrés oxidativo y por tanto resulta esencial para la supervivencia del patógeno. De entre una serie de compuestos derivados de un inhibidor ensayado con anterioridad (compuesto C12 actualmente descatalogado), se seleccionaron los más competentes realizando medidas de actividad enzimática. Estos fueron D2, D5 Y D10 con valores de IC50 de 25,38, 17,24 y 174,72 µM respectivamente y porcentajes de inhibición próximos al 100%. Posteriormente y debido a su homología estructural con XacFPR, se elaboraron ensayos con AnFNR, la enzima ferredoxina NADP+-reductasa presente en la cianobacteria de Anabaena. Con lo que se pudo concluir que solo D5 resultó prácticamente inocuo frente a la FNR (IC50 de 102,38 µM y 47,31% de inhibición). Un estudio posterior del tipo de inhibición reveló un posible mecanismo de inhibición no competitiva para los tres compuestos mencionados, con valores de kI de 21,3 µM en el caso de D2, kI de 8,3 µM para D5 y kI de 74,1 µM para D10.

Este trabajo ha abordado el estudio estructural de proteínas redox de interés biotecnológico y biomédico tales como el factor de inducción de la apoptosis humano, implicado en procesos de muerte celular (hAIF), la NADPH-flavodoxina reductasa del microorganismo fitopatógeno Xanthomonas axonopodis pv citri (XacFPR) y las proteínas riboflavin quinasa humana (hRFK) y FAD sintetasa humana (hFADS_2), implicadas en la síntesis del cofactor FAD necesario para múltiples rutas metabólicas así como para la actividad de las flavoproteinas. Con este fin se han utilizado varias técnicas: la cristalografía de rayos X, la predicción estructural de proteínas y la microscopia de fuerzas atómicas. La técnica de cristalografía de rayos X aplicada a proteínas está basada en la obtención de cristales proteicos que difractan los rayos X proporcionando datos que conducen a la resolución de la estructura tridimensional de la proteína. Esta técnica se puede llevar a cabo en presencia de ligandos de manera que se consigue información de la interacción proteína - ligando. Durante el desarrollo de este trabajo se han identificado condiciones iniciales de cristalización de las proteínas riboflavin quinasa humana (hRFK) y de las especies mutantes del factor de inducción de la apoptosis humano (hAIF), así como la resolución de la estructura de la proteína XacFPR cocristalizada con NADP+ y/o un inhibidor de su actividad reductasa en la que no se observa densidad electrónica extra debida al ligando. Con el fin de avanzar en el conocimiento de la estructura de la enzima hFADS_2, y a falta de un modelo cristalográfico, se realizó una predicción de su estructura tridimensional así como un estudio morfológico del dominio C terminal mediante microscopia de fuerzas atómicas. Se observó que el dominio C terminal aislado dimeriza y que los monómeros presentan una altura promedio de 3,5 ± 0,5 nm, que se ajusta a las dimensiones encontradas en las predicciones.

Este trabajo está dentro de una línea de investigación centrada en la búsqueda de compuestos que presenten acción bactericida contra el microorganismo patógeno Leptospira interrogans, el cual causa la enfermedad denominada Leptospirosis, una zoonosis muy extendida a nivel mundial. Leptospira es una bacteria Gram negativa que presenta en su metabolismo una enzima, la Ferredoxina NADP(H) reductasa (LepFNR) que se está estudiando como diana farmacológica en otros organismos patógenos (la FPR del fitopatógeno Xanthomonas). Sus diferencias tanto estructurales como funcionales con las análogas presentes en organismos eucariotas hacen que esta proteína sea un buen candidato para actuar sobre ella y que no afecte al hospedador. La enfermedad de Weill (Leptospirosis en humanos) presenta cuadros desde leves hasta graves, y en estos últimos casos el fallo renal puede causar la muerte, por lo que encontrar un tratamiento o una vacuna sería una forma de parar la extensión de dicha enfermedad. En esta memoria se estudia el poder de inhibición de la actividad de la LepFNR de 7 compuestos (LP1-LP7) identificados mediante un cribado masivo de una quimioteca formada por 1120 compuestos. Además, se ha estudiado otro compuesto más, el D5, que es un buen candidato como inhibidor de la enzima análoga en Xanthomonas. El objetivo era comprobar si este mismo compuesto podía ser prometedor en otro tipo de microorganismo con características diferentes en una proteína con función similar. Este trabajo ha consistido en la medida del IC50 de estos compuestos mediante la actividad diaforasa de la LepFNR y el estudio del tipo de inhibición que ejercen tres de ellos sobre dicha actividad (LP1, LP2 y D5). Con los datos obtenidos se han realizado ajustes globales a las funciones de Michaelis-Menten y Lineweaver-Burk (inversa), ambas modificadas por el factor de inhibición, lo cual permite determinar el tipo de inhibición. Se ha concluido que, si bien todos los compuestos estudiados inhiben la actividad de la LepFNR como mínimo hasta un 80 %, los valores de IC50 que presentan son demasiado altos para ser buenos inhibidores (>50 µM). De los estudios de inhibición realizados con los tres compuestos se deduce que LP1 (con el menor IC50 de los compuestos LPs) actúa como inhibidor competitivo mientras que LP2 (que inhibe al 100% la actividad) y D5 llevan a cabo su acción inhibitoria mediante un tipo de inhibición no competitivo. A partir de la estructura de LP1 y LP2 se pueden diseñar compuestos de segunda generación que mejoren la inhibición de la actividad de la LepFNR y así avanzar en el descubrimiento de fármacos para tratar la Leptospirosis.

El objetivo de este proyecto es el estudio análisis por primera vez de las fuerzas de interacción entre una enzima y su substrato enzimático usando una aproximación de molécula única. Se utilizará el AFM en su variante de Espectroscopia de Fuerzas de Molécula Única (SMFS) para analizar las fuerzas intermoleculares que mantienen unido el complejo formado por la flavoenzima Ferredoxina-NADP+ reductasa (FNR) y substrato enzimático, NADP+. La FNR de plantas participa en la cadena fotosintética recibiendo electrones de las proteínas ferredoxina/ flavodoxina y transfiriéndolos al substrato NADP+ que se reduce a NADPH. Los resultados no sólo proporcionarán datos de mecanoestabilidad del complejo sino otros parámetros del estado de transición asociado al proceso de disociación (koff). En este trabajo, la enzima FNR será inmovilizada covalentemente en substratos de mica, y el NADP+ en la punta del cantiléver, para lo que se ha diseñado un procedimiento que utilizará un espaciador flexible de polietilenglicol modificado para unirse por un lado a la punta y por otro al ligando modificado con un entrecruzador. Posteriormente se realizarán las medidas de SMFS consistentes en la toma de cientos de aproximaciones o curvas Fz entre muestra y punta funcionalizadas a diferentes velocidades de carga (piconewtons/s). Con los datos de los picos de las curvas Fz que registren la ruptura de enlaces se construirán histogramas que proporcionarán fuerzas de ruptura más probable. Utilizando el modelo de Ritchie-Evans se obtendrá el paisaje y otros parámetros de la disociación del complejo.

Este trabajo se incluye dentro de un proyecto de búsqueda de compuestos que presenten acción bactericida contra el microorganismo patógeno Xanthomonas axonopodis pv citri (Xac), una bacteria que causa la enfermedad del cáncer de cítricos. Xanthomonas es una bacteria Gram negativa que posee una enzima, la NADPH-flavodoxina (ferredoxina) reductasa (XacFPR), que se ha utilizado en este proyecto como diana terapéutica, debido a sus diferencias estructurales y funcionales con sus homólogas en las células eucariotas vegetales, las FNRs plastídicas. De este modo se busca inhibir la enzima del fitopatógeno sin ocasionar daño a la planta hospedadora mediante el descubrimiento de un bactericida eficaz. El objetivo supone todo un reto, ya que existe un método efectivo para evitar los efectos de Xanthomonas, que incluyen graves daños en los cítricos de diferentes países del mundo, incluyendo España, reduciendo enormemente la producción, lo que conlleva grandes pérdidas económicas sin que existan métodos efectivos para frenar su avance. Los potenciales inhibidores de la XacFPR estudiados en esta memoria, 43 compuestos, fueron seleccionados con anterioridad mediante cribado masivo a partir de una quimioteca formada por 11.120 compuestos. En este trabajo se ha medido el valor IC50 de estos compuestos mediante la actividad diaforasa de la XacFPR y se han realizado ajustes globales de los datos cinéticos obtenidos en presencia de un compuesto con alta eficacia de inhibición, a las funciones de Michaelis-Menten y sus inversos modificadas por el factor de inhibición para determinar el tipo de inhibición. En este trabajo se ha concluido que dicho compuesto produce una inhibición efectiva de un 94,6 % de la actividad reductasa de la XacFPR y con un IC50 de 9.7 µM mediante un posible mecanismo de inhibición no competitiva, con un valor de KI de 5 µM. Los experimentos preliminares de acoplamiento molecular, "docking", muestran que dicho compuesto se une a XacFPR en el sitio donde se encuentra el cofactor FAD. Con este compuesto seleccionado se podrán realizar pruebas de inhibición in vivo donde se comprobará la efectividad del bactericida y su inocuidad en las plantas hospedadoras.

Estudio del papel de los residuos E413, R422 y R430 en el proceso de oligomerización de la enzima AIF mediante cristalografía de rayos X.

Flavin adenine dinucleotide synthetases (FADSs) are known as a group of prokaryotic bifunctional enzymes that carry out the dual functions of riboflavin phosphorylation to produce flavin mononucleotide (FMN) and its subsequent adenylylation to generate FAD (hereafter FADS-type 1). A recent work [1] using a variety of bioinformatics methods revealed that certain gram-positive pathogenic bacteria (i.e. Listeria monocytonegens, Listeria welshimeri, Lactobacillus plan tarum, Bacillus cytotoxicus) contain also a variant of FADS sequences, named FADS-type II. These two types of sequences cluster together. Although the phylogenetic tree does not support that FADStype II proteins constitute a distinct evolutionary class, their shorter and non-conserved C-terminal domains suggest them as a distinct functional group unable to produce riboflavin phosphorylation. In this work the putative structure and function of the Cterminal domain of the FADS-type II from Listeria monocytonegens (LmFADS-typell) has been investigated. The results point out that this C-terminal domain contains a LPAxGxY conserved sequence motif with high homology with the LPASGxY consensus sequence common to proteins acting as lysozyme inhibitors, such as P1iG, P1iC and Plil, in gram-negative bacteria. This motif has been shown to be important for lysozyme inhibition in the P1iC and Plil families, defending bacteria against the lytic action of host lysozymes [2]. In gram-positive bacteria no homology was found with lysozyme inhibitors. Interestingly, in this bacterium linage homologies were found with FMN reductases domains. A structural model for the C-terminal domain of LmFADStype II is also proposed.