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Doutoramento em Biologia Submitted by Nuno Cruz (nuno@ua.pt) on 2013-11-08T17:28:19Z No. of bitstreams: 1 tese.pdf: 10910011 bytes, checksum: 8c0546c5835947158518959625c6217d (MD5) Made available in DSpace on 2013-11-08T17:28:19Z (GMT). No. of bitstreams: 1 tese.pdf: 10910011 bytes, checksum: 8c0546c5835947158518959625c6217d (MD5) Previous issue date: 2013

Doutoramento em Biologia As comunidades de macrofauna bentónica são ecológica e economicamente relevantes, sendo fonte de diversos bens e serviços. A sua identificação, caracterização e mapeamento são importantes para identificar áreas marinhas protegidas e para uma melhor utilização do ambiente marinho. Este trabalho apresenta um estudo holístico da diversidade e distribuição espacial das comunidades de macrofauna bentónica ao longo da plataforma continental Portuguesa. Cerca de 145 locais posicionados ao longo da plataforma ocidental e setentrional foram amostrados com uma draga Smith-McIntyre de área 0,1 m2, a profundidades que variaram entre os 13 e 195 metros. Os sedimentos foram caracterizados em termos de granulometria, de matéria orgânica e geoquímica. São propostos seis habitats bentónicos principais para a plataforma continental Portuguesa, analisada a relação entre os dados biológicos e ambientais e discutidas questões biogeográficas relacionadas com a distribuição espacial de espécies e das comunidades. A distribuição da granulometria e assinatura geoquímica dos sedimentos da plataforma continental revelou-se bastante complexa, refletindo importantes diferenças nas fontes (naturais e antropogénicas), origem fluvial, geomorfologia da plataforma, hidrodinamismo e atividade biológica. Relativamente à macrofauna, entre os mais de 30 mil indivíduos recolhidos, foram identificados cerca de 737 taxa, dos quais quatro são novas espécies e aproximadamente 40 correspondem a primeiras ocorrências para a costa Portuguesa. As espécies mais frequentes foram a Ampharete finmarchica, Ampelisca sp. e Lumbrineris lusitanica sp. nov. enquanto as mais abundantes foram Mediomastus fragilis, Polygordius appendiculatus e Ampharete finmarchica. A abundância por local de amostragem variou entre 7 e 1.307 espécimens e a diversidade alfa atingiu um máximo de 96 taxa. Os sedimentos mais grosseiros apresentaram maior diversidade e abundância comparativamente com os sedimentos envasados. Foram identificados seis habitats bentónicos na plataforma continental Portuguesa: (a) sedimentos grosseiros com Protodorvillea kefersteini, Pisione remota, Angulus pygmaeus e várias espécies intersticiais; (b) areias finas hidrodinamicamente expostas e próximas da linha de costa com Magelona johnstoni, Urothoe pulchella e Angulus fabula; (c) comunidade de Abra alba em areia envasadas da plataforma profunda do noroeste; (d) Galathowenia oculata, Lumbrinerides amoureuxi e outros poliquetas escavadores e tubícolas em areais envasadas muito profundas na plataforma sudoeste; (e) Euchone rubrocincta, Nematonereis unicornis e várias espécies setentrionais nas areias envasadas da plataforma sul; (f) vasas com Sternaspis scutata, Heteromastus filiformis e Psammogammarus caecus. A granulometria do sedimento (particularmente teor em finos), matéria orgânica, profundidade e hidrodinamismo foram as variáveis ambientais com a maior relação com os padrões de distribuição da macrofauna. As espécies cosmopolitas e de latitudes superiores (clima Boreal ou Temperado Frio) dominaram o setor noroeste, sendo substituídas por espécies mais quentes na área de transição entre os canhões da Nazaré e S. Vicente, que dominaram por conseguinte a plataforma sul. O presente estudo evidenciou a abundância e diversidade da macrofauna bentónica ao longo da área costeira de Portugal, na qual coexistem faunas das províncias biogeográficas do norte da Europa, bem como subtropicais. Integrado com outro estudos, este poderá ser a base para uma melhor gestão da plataforma continental Portuguesa. Macrofauna benthic communities are ecologically and economically relevant, providing important ecological goods and services. Their identification, characterization and mapping are important to identify marine protected areas and to an overall better use of the marine environment. This work presents a comprehensive assessment of the diversity and spatial distribution of the soft-bottom benthic macrofauna communities along the Portuguese continental shelf. A total of 145 sites positioned along the west and south coasts of Portugal were sampled with a 0.1 m2 Smith-McIntyre grab, at depths ranging from 13 to 195 metres. Sediment grain-size, total organic matter and bulk geochemistry were characterized. It is proposed six major soft-bottom benthic habitats for the Portuguese continental shelf, analysed the relationship between the macrofauna patterns and environmental variables and discussed the biogeographic issues related to the spatial distribution of species and communities. The sediments grain-size distribution and geochemical signature were complex, reflecting differences in the sources, fluvial input, shelf morphology, hydrodynamic energy and biological activity. Concerning the macrofauna, 737 taxa were identified in more than 30000 specimens. Four new species and nearly 40 new species occurences for the Portuguese coast were recorded in the scope of this work. The most frequent species were Ampharete finmarchica, Ampelisca sp. and Lumbrineris lusitanica sp. nov., while the most abundant were Mediomastus fragilis, Polygordius appendiculatus and Ampharete finmarchica. Abundance per site ranged from 7 to 1307 specimens per 0.1 m2 and alpha diversity reached a maximum of 96 taxa per 0.1 m2. Coarser sediments presented higher diversity and abundance than mud sediments. Six major soft-bottom benthic habitats were identified and characterized: (a) coarse sediments with Protodorvillea kefersteini, Pisione remota, Angulus pygmaeus and other interstitial species (Lusitanean Venus community); (b) Near shore hydrodynamic exposed fine sands with Magelona johnstoni, Urothoe pulchella and Angulus fabula (Boreal Lusitanean Tellina community); (c) Abra alba community in northwestern deep muddy sands (with northern biogeographic affinity); (d) Galathowenia oculata, Lumbrinerides amoureuxi and other burrowers and tubicolous polychaetes in southwestern deep muddy sands (biological community with warmer affinity); (e) Euchone rubrocincta, Nematonereis unicornis and other warmer water species in muddy sands of the southern and sheltered shelf; (f) Muds of Sternaspis scutata, Heteromastus filiformis and Psammogammarus caecus. Sediment grain-size, organic matter, depth and hydrodynamic energy were the variables best related with the macrofauna distribution patterns. Cosmopolitan and northern species (Cold Temperate and Boreal affinity) dominated the northwestern sector, were replaced by warmer species (Lusitanean, Mediterranean and African affinity) in a transition area between the Nazaré and S. Vicente Canyons, which then dominated the southern shelf. The present study highlighted the abundance and diversity of the macrofauna along a coastal area where cold temperate, warm temperate and subtropical faunas can coexist. Integrated with other studies, it can support a better management of the Portuguese coastal shelf.

Forests are considered one of the most important ecosystems on the planet, for their services, and ecological role. However, they are subject to diseases such as Pine Pitch Canker (PPC), caused by the fungus Fusarium circinatum, with several economic and ecological impacts. There are no effective methods in controlling the disease in nurseries and in forests. This work evaluates the potential use of innovative nano-agents in the control of PPC, which implied the optimization of in vitro growth conditions for inhibition tests. Umbelliferon and nano-agents labelled with this fluorochrome were tested in the same inhibition tests to visualize the fluorescence emitted and confirm the uptake. Additionally, in vivo assays have been established to evaluate the toxic effect of nano-agents in a host susceptible to PPC (Pinus radiata). Layered double hydroxides (Cu/Zn-Al-LDH), stabilised with nitrate (NO32-) or phosphite (PO33-) ions and silica mesoporous nanocapsules (SiNC), loaded with the broad-spectrum fungicide DCOIT, as well as its components (free nanomaterials, active ingredients, and conventional commercial fertilizers) have been tested as in vitro control agents against F. circinatum. Three in vitro application techniques [Poisonous Food Technique (PFT); Surface Immersion Technique (SIT); Dry Mass Technique (DMT)] were preliminary tested to define the best experimental parameters and optimize the protocol (in terms of techniques and concentration). Preliminary antifungal tests in vitro showed a high inhibiting effect with the Poisonous Food Technique, considering the concentration of 10% of the active ingredient. The treatments of 100 mg. L-1 with Cu-Al-LDH (PO3) and SiNC-DCOIT showed the best inhibition rates of 90.7 and 53.8 %, respectively. Copper source was the best inhibitor within the free formulas with 83,3 %, followed by DCOIT with 69.6 % and by Trafos Si with 50.7 % (conventional fertilizer). Finally, to understand the high efficacy of nanostructured biocide, SiNC nanocapsules were marked with umbelliferon and the fungus was exposed to these nanomaterials under the same experimental conditions. It was possible to visualize the strong fluorescence within hyphae of F. circinatum exposed to free or nanostructured umbelliferon, in contrast to the weak fluorescence of the fungus exposed to non-fluorescent products, proving that nanomaterials can be internalized by the fungus. No qualitative toxic damage was noted in the preliminary tests in vivo in Pinus radiata after preliminary foliar aspersion with stock dispersions/solutions at the same concentration. Further in vivo studies are encouraged to investigate the possible application of these innovative nanomaterials in the control of Pine Pitch Canker in Pinus species. As florestas são consideradas um dos ecossistemas mais importantes no planeta, pelos seus serviços, e papel ecológico. No entanto, estão sujeitas a doenças, como o Cancro Resinoso do Pinheiro (CRP ou PPC), causado pelo fungo Fusarium circinatum, acarretando vários impactos económicos e ecológicos. Não existem métodos eficazes no controlo da doença em viveiros e em florestas. Este trabalho avalia o potencial uso de nano agentes inovadores no controlo do CRP o que implicou a otimização das condições de crescimento in vitro para testes de inibição. Umbeliferona e nano-agentes marcados com este fluorocromo foram testados nos mesmos testes de inibição de crescimento para visualizar a fluorescência emitida e confirmar o “uptake”. Adicionalmente foram estabelecidos ensaios in vivo para avaliar o efeito tóxico dos nano-agentes num hospedeiro suscetível ao CRP (Pinus radiata). Os hidróxidos metálicos lamelares duplos (Cu/Zn-Al-LDH), estabilizados com os iões nitrato (NO32-) ou fosfito (PO33-) e as nanocápsulas mesoporosas de sílica (SiNC), carregadas com o fungicida de largo espetro DCOIT, bem como os respetivos componentes (nanomateriais livres, ingredientes ativos e fertilizantes comerciais convencionais) foram testados como agentes de controlo in vitro contra o F. circinatum. Foram testadas preliminarmente três técnicas de aplicação in vitro [Técnica Alimentar Venenosa (PFT); Técnica de Imersão Superficial (SIT); Técnica de Massa Seca (DMT)], de forma a definir os melhores parâmetros experimentais e otimizar o protocolo (em termos de técnicas e concentração). Os testes preliminares antifúngicos in vitro mostraram um elevado efeito inibitório com a Técnica Alimentar Venenosa, considerando a concentração de 10% do composto ativo. Os tratamentos com 100 mg.L-1 de Cu-Al-LDH (PO3) e SiNC-DCOIT apresentaram as melhores taxas de inibição de 90,7 ± 0,1 e 53,8 %, respetivamente. A fonte de cobre foi o maior inibidor na sua forma livre, com 83,3%, seguido pelo DCOIT com 69,6 %, e pelo Trafos Si com 50,7 % (fertilizante convencional). Finalmente, para entender a elevada eficácia do biocida nanoestruturado, marcaram-se cápsulas de SiNC com umbeliferona e expôs-se o fungo a estes nanomateriais nas mesmas condições. Foi possível visualizar a forte fluorescência das hifas de F. circinatum expostos a umbeliferona livre ou nanoestruturada em contraste com a fraca fluorescência do fungo exposto a produtos não fluorescentes, comprovando que os nanomateriais podem ser internalizados pelo fungo. Não se notaram danos tóxicos qualitativos nos testes preliminares in vivo em Pinus radiata após a aspersão foliar preliminar com dispersões/soluções stock na mesma concentração. Mais estudos in vivos são encorajados para investigar a possível aplicação destes nanomateriais inovadores no controlo do Cancro Resinoso do Pinheiro em espécies de Pinus. Mestrado em Biologia Aplicada

Eutrophication of water bodies is a common phenomenon resulting from the surplus of inorganic nutrients, usually related to anthropogenic activities, such as, agriculture, sewage discharges, mining, overconsumption, among others. Recent efforts to control and remediate eutrophication processes include the use of green nanotechnology. Zn-Al layered double hydroxides (LDH) are non toxic hydrotalcite-like anionic nanoclays that can exchange the stabilizer anion by others that can be present in the water, such as phosphates. Therefore, the present study aimed to assess the efficacy of Zn-Al LDH-NO3 as a low toxic adsorbent for the remediation of P-rich water bodies (benchmarked with calcined LDH). For this purpose, three concentrations of LDHs (5, 50 and 500 mg/L) were added to P-rich solutions mimicking the maximum recommended concentration of phosphorus on drinking water (0.4 mg P/L) and wastewater (10 mg P/L), according to the Portuguese legislation (DL 236/98) and to water collected from an eutrophic artificial lake (Aveiro, Portugal), simulating a real scenario. Nitrates and phosphates were periodically measured to evaluate the nanomaterial capacity to remove phosphates’ content for a period of 7 days. The remediation efficacy was also assessed in terms of the toxicity of remediated water at the end of the remediation period through growth inhibition tests using the freshwater microalgae Raphidocelis subcapitata. Tested materials showed a great efficacy on the removal of phosphates, in all tested media. Overall, the higher the LDH tested concentration, the higher the speed on P removal, the higher the nitrates released (below the recommended threshold for drinking water, 25 mg/L) and the higher the growth inhibition effects on the green microalgae R. subcapitata. The intercalation of phosphates was confirmed through X-ray diffraction (XRD). In conclusion, the results suggest that Zn-Al LDH-NO3 is a technological and environmentally friendly promising solution for phosphates remediation, preferably if used for very short-periods (e.g. the addition of 500 mg LDH/L into the solution of 10 mg P/L removes 99.9% of the P in just 5 minutes, releasing only 6 mg NO3/L). A eutrofização de corpos de água é um fenómeno comum resultante da disponibilidade de nutrientes inorgânicos, normalmente relacionada com atividades antropogénicas, tais como agricultura, descargas de esgoto, mineração, indústria, entre outros. Os recentes esforços para controlar e remediar o processo de eutrofização incluem a utilização da nanotecnologia. Os hidróxidos duplos lamelares (LDH) de Zn-Al são nanoargilas aniónicas não tóxicas que conseguem trocar o anião estabilizador por outros que podem estar presentes na água, como é o caso do fosfato. Deste modo, o presente estudo teve como objetivo avaliar a eficácia do Zn-Al LDH-NO3 como um adsorvente de baixa toxicidade para a remediação de massas de água ricas em P, comparativamente a um material de referência: LDH calcinado. Para tal, três concentrações de LDH (5, 50 e 500 mg/L) foram adicionados a soluções que mimetizaram a concentração de fosfato máxima recomendada em água potável (0.4 mg P/L) e água de ETAR (10 mg P/L), de acordo com a legislação Portuguesa (DL 236/98), e ainda a água recolhida de um lago artificial eutrofizado (Aveiro, Portugal), num cenário real. Os nitratos e fosfatos foram medidos periodicamente de forma a avaliar a capacidade do nanomaterial remover o conteúdo de fosfato durante um período de 7 dias. A eficácia da remediação aos 7 dias foi igualmente avaliada em termos da toxicidade da água remediada através de testes de inibição de crescimento da microalga de água doce Raphidocelis subcapitata. Os materiais testados demonstraram uma grande eficiência na remoção de fosfatos, em todos os meios testados. No geral, quanto maior a concentração de LDH, maior a velocidade de remoção de P, maior a quantidade de nitratos libertados (inferior ao limite para água potável: 25 mg NO3/L) e maior são os efeitos de inibição de crescimento na microalga R. subcapitata. A intercalação de fosfatos foi confirmada através da difração de raio-X (DRX). Em conclusão, os resultados sugerem que Zn-Al LDH-NO3 é uma solução nanotecnológica ambientalmente promissora para a remediação de P, preferencialmente se utilizada durante curtos períodos de tempo (p.e. a adição de 500 mg LDH/L na solução de 10 mg P/L removeu 99.9% de P em apenas 5 minutos, libertando apenas 6 mg NO3/L). Mestrado em Eco-toxicologia e Análise de Risco

Layered Double Hydroxides (LDH) are anionic nanoclays, composed of positively-charged layers with divalent or trivalent metal cations (e.g., Zn2+ or Al3+) and stabilized by anions (e.g., nitrates) and water molecules in the interlayers. LDHs have remarkable properties namely excellent anion exchangeability, memory effect, biocompatibility, pH sensitivity, high surface to volume ratio, and high adsorbing capacity. LDHs have been regarded as “smart” engineered nanomaterials and lately received great interest in multiple areas, such as medicine, pharmaceutical, industry, among others. These nanomaterials are of low toxicity to humans, mammals, and marine organisms. However, ecotoxicological effects on freshwater organisms are scarcely studied, which is critical for regulatory purposes. The zebrafish Danio rerio is a wellestablished freshwater model organism that is widely used in toxicological and ecotoxicological assessment of innumerous contaminants. Several studies are using the zebrafish to evaluate the toxicity of nanomaterials, mainly metallic nanoparticles. The present study aimed to assess the ecotoxicological effects of Zn-Al LDH in Danio rerio. Danio rerio eggs were exposed to Zn-Al LDHs to assess developmental, behavioural, biochemical, and molecular (at the DNA level) changes. For the evaluation of embryotoxicity, the eggs were exposed to Zn-Al LDH (85 - 1200 mg/L) according to the OECD 236 protocol, where mortality, malformations, and hatching success were recorded daily for 96 hours. In the behavioural test, the embryos were exposed to sublethal concentrations of Zn-Al LDH (9 - 94 mg/L) for 120 h. The evaluation of genotoxicity (comet assay) and biomarkers of neurotoxicity and oxidative stress after a 96 h exposure of eggs to nanomaterial (9 - 94 mg/L). The behaviour and fate of LDHs in the water of the zebrafish system were characterized through the zeta potential and hydrodynamic particle size. Os hidróxidos duplos lamelares (LDH) são nanoargilas aniónicas, compostas por camadas carregadas positivamente com catiões metálicos divalentes ou trivalentes (por exemplo, Zn2+ ou Al3+) e estabilizados por aniões (por exemplo, nitratos) e moléculas de água entre camadas. Estes nanomateriais têm propriedades notáveis, nomeadamente excelente permutabilidade aniónica, efeito de memória, biocompatibilidade, capacidade de resposta a alterações do pH, elevada relação superfície/volume e elevada capacidade de adsorção. Os LDH têm sido considerados nanomateriais manufaturados “inteligentes” e têm recebido um forte interesse em áreas como a medicina, farmacêutica, indústria, entre outras. Estes nanomateriais causam baixa toxicidade em humanos, mamíferos e organismos marinhos. No entanto, os efeitos ecotoxicológicos em organismos de água doce são pouco estudados, lacuna esta que é crítica para fins regulatórios. O peixe-zebra Danio rerio é um organismo-modelo de água doce amplamente utilizado na avaliação (eco)toxicológica de inúmeros contaminantes. Existem vários estudos que utilizam o peixe-zebra para avaliar a toxicidade de nanomateriais, principalmente nanopartículas metálicas. O presente estudo visa assim avaliar os efeitos ecotoxicológicos do nanomaterial LDH Zn-Al fases larvares da espécie Danio rerio. Para o efeito, ovos de Danio rerio foram expostos a LDH Zn-Al para avaliar a embriotoxicidade e alterações de desenvolvimento, comportamentais, bioquímicas e moleculares (ao nível do DNA). Para a avaliação da embriotoxicidade, os ovos foram expostos a LDH Zn-Al (85 – 1200 mg/L) de acordo com o protocolo OCDE 236, onde a mortalidade, malformações e sucesso de eclosão foram registados diariamente durante 96 h. No ensaio comportamental, os embriões foram expostos a concentrações subletais de LDH Zn-Al (9 – 94 mg/L) durante 120 h. A avaliação da genotoxicidade (ensaio do cometa) e de biomarcadores de neurotoxicidade e de stress oxidativo foi realizada após uma exposição de 96 h dos ovos ao nanomaterial (9 – 94 mg/L). O comportamento e destino dos LDH na água do sistema do peixe-zebra foram avaliados através do potencial zeta e tamanho hidrodinâmico das partículas. No geral, as dispersões de LDH têm tendência para agregação e reduzida estabilidade no meio de exposição. No teste de embriotoxicidade, a concentração de efeito não observada (CENO) foi de 415.2, 244.3 e 143.7 mg/L para os parâmetros de letalidade, eclosão e malformações, respetivamente. Em termos comportamentais, a exposição aos LDH causou diferenças significativas na duração total da locomoção (CEO= 9 mg/L). A exposição aos nanomateriais não causou genotoxicidade, nem diferenças significativas nos parâmetros bioquímicos testados (p > 0.05). Em conclusão, os resultados atuais sugerem que o Zn-Al LDH é pouco tóxico para embriões e larvas de peixe-zebra. Os efeitos observados parecem indicar um modo de atuação iminentemente físico/mecânico, compatível com a tendência para sedimentação em concentrações muito elevadas e pouco realistas (na ordem das dezenas de mg/L). Mestrado em Eco-toxicologia e Análise de Risco

Nanotechnology has experienced an unprecedent growth, marked by the development of innovative nanomaterials with unique physicochemical characteristics for a wide range of applications. Layered double hydroxides (LDH) are a great example of such innovation. Currently, risk assessment methodologies are based on test methods developed for conventional chemical’s characteristics and do not account for the specificities that nanomaterials exhibit. Under REACH (Registration, Evaluation, Authorisation and Restriction of Chemicals) and CLP (Classification, Labelling and Packaging of substances) EU regulations, nanomaterials are regarded as substances. The chemical safety assessment of nanomaterials is thus crucial to meet the needs for their registration and posterior commercialization. The safety assessment performed for REACH, based on the current non nano-specific ecotoxicological test methodologies might produce data with low relevance and reliability. Thus, the present study aimed to assess the impact of two different exposure methodologies, recommended by OECD (serial dilutions from a stock dispersion vs direct nanomaterial addition to each individual concentration), in the growth of the freshwater microalgae Raphidocelis subcapitata exposed to Zn-Al and Cu-Al LDHs. Moreover, different powder grain sizes (bulk, 250 µm) of both LDHs were used for the exposure of the same microalgae regarding a possible grain size-dependent toxicity. Regarding exposure methodologies, differences were observed in the toxicity of Zn-Al LDH, however, there is no methodological difference in the toxicity output for Cu-Al LDH exposure. Zn-Al LDH toxicity was similar for all grain sizes, however, the 3 highest grain sizes of Cu-Al LDH produced lower toxicity when comparing to the bulk counterpart. Thus, a grain size separation for Cu-Al LDH might be of great advantage towards the formulation of an eco-friendlier nanomaterial. Exposure methodology results pose as a good starting point for ecotoxicological testing involving LDHs. Additionally, other studies with exposure methodologies and media, and different nanomaterials are needed, in order to achieve better standardization procedures for nano-specific test methodologies. A nanotecnologia tem sofrido um crescimento sem precedentes, marcado pelo desenvolvimento de nanomateriais inovadores com características físico-químicas únicas para uma ampla gama de aplicações. Os hidróxidos duplos-lamelares (LDHs) são um excelente exemplo dessa inovação. Atualmente, as metodologias de avaliação de risco são baseadas em metodologias de avaliação desenvolvidas para substâncias convencionais e não têm em conta as especificidades exibidas pelos nanomateriais. Os nanomateriais estão enquadrados como substâncias nos regulamentos europeus REACH (Registo, Avaliação, AutorizaçãoeRestriçãodeQuímicos) e CRE (Classificação, Registo e Embalagem),sendo-lhes aplicáveis as disposições constantes em ambos os documentos.Assim,a avaliação do risco dos nanomateriais é crucial para o seu registo e posterior comercialização. No entanto, a avaliação de risco dos nanomateriais no âmbito REACH é baseada em metodologias para compostos convencionais o que pode originar resultados com baixa relevância e confiabilidade. Por isso, o presente estudo visou avaliar o impacto de duas metodologias de exposição recomendadas pela OCDE (diluições em série a partir de uma solução stock vs. adição direta de nanomaterial a cada concentração individual), no crescimento da microalga de água doce Raphidocelis subcapitata após a exposição a uma gama de concentrações de Zn-AlLDH e Cu-Al LDH. Adicionalmente, pós com diferentes tamanhos de grão (heterogéneo; 250 μm) de ambos os LDHs foram utilizados na exposição à mesma microalga, considerando uma possível toxicidade dependente do tamanho do grão. Relativamente às metodologias, foram observadas diferenças na toxicidade obtida entre ambas as metodologias de exposição para Zn-Al LDH, contudo, nenhuma diferença foi detetada no caso doCu-AlLDH. Relativamente aos tamanhos de grão nos pós de LDHs, atoxicidade do Zn-Al LDH foi similar para todos os tamanhos, contudo, os 3 tamanhos maiores do Cu-Al LDH produziram uma menor toxicidade comparando com a amostra heterogénea. Assim sendo, a separação do Cu-Al LDH por tamanhos granulométricos poderá ser uma vantagem para a formulação de uma nanomaterial mais amigo do ambiente. Os resultados da metodologia de exposição constituem um bom ponto de partida para a elaboração de adaptações das metodologias a realizar em testes ecotoxicológicos com algas envolvendo LDHs. Estudos futuros com outras metodologias de exposição, meios de exposição e diferentes nanomateriais permitirão atingir uma padronização mais precisa das metodologias de teste para nanomateriais. Mestrado em Eco-toxicologia e Análise de Risco

Submitted by Manuel Jesus (albertojesus@ua.pt) on 2020-05-04T12:44:54Z No. of bitstreams: 1 Sara_Ribeiro_da_Silva.pdf: 2767821 bytes, checksum: e03268e812b7ac578dd31b83c9f18c60 (MD5) Made available in DSpace on 2020-05-04T12:44:54Z (GMT). No. of bitstreams: 1 Sara_Ribeiro_da_Silva.pdf: 2767821 bytes, checksum: e03268e812b7ac578dd31b83c9f18c60 (MD5) Previous issue date: 2019-12 Mestrado em Biologia Marinha Aplicada

Marine biofouling in man-made metallic immersed structures is still a global socio-economic problem. The protection of structures has been conventionally performed using antifouling paints containing toxic organic and/or metallic biocides (e.g. copper) towards non-target organisms. In order to circumvent this environmental problem and control the chemicals release over time, some of these biocides have been immobilized/encapsulated in engineered nanomaterials. When directly dispersed in artificial saltwater, novel nanoadditives show a noteworthy reduction in their toxicity and hazard to marine ecosystems. Thus, the present study aimed to test the toxicity and antifouling efficacy of 8 modified coatings with free or nanostructured biocides and 1 state-of-the-art coating and to establish a relationship with physicochemical parameters and the release rate of chemicals over time. The tested systems are the following: two coatings containing only free biocides (CuPT and DCOIT (commercially known as Sea-Nine), two with nano-structured biocides (CuPT @ Zn-Al LDH and Sea-Nine @ SiNC), three with unloaded/"empty" nanostructures (Cu-Al LDH, Zn-Al LDH and SiNC), blank reference without biocides and a commercial reference. The anti-fouling efficacy assessment was done at Gafanha da Encarnação marina (Aveiro, Portugal), for a complete year. Bacteria, microphytobenthos and macrofoulers communities were evaluated periodically. In the laboratory, coated plates were properly characterized in terms of chemical composition and metallographic properties, and then, placed in aquaria and allowed to release their chemical compounds for 3 months. Water samples were taken from each aquarium and monitored for toxic effects on microalgae (growth inhibition, Phaeodactylum tricornutum and Tetraselmis chuii) and crustaceans (lethality, Artemia salina), elemental composition (ICP-MS and ICP-OES), DCOIT quantification (only in paints with this compound via HPLC) and physicochemical characterization. Overall, this study showed that coatings with free biocides showed high antifouling efficacy, but extreme toxicity. The encapsulation of these biocides significantly reduced the coatings toxicity and kept (CuPT @ Zn-Al LDH) or even increased (Sea-Nine @ SiNC) their anti-macrofouling efficacy over an entire year of immersion in the field, being a promising method with environmental benefits. A bioincrustação marinha em estruturas metálicas marítimas construídas pelo Homem é ainda um problema socioeconómico a nível global. A proteção das estruturas tem sido convencionalmente realizada com recurso a tintas anti vegetativas contendo biocidas orgânicos e/ou metálicos (ex. cobre), cujos efeitos tóxicos em organismos não-alvo têm sido amplamente reportados na literatura. Por forma a contornar este problema ambiental e controlar a libertação dos químicos ao longo do tempo, alguns destes biocidas foram imobilizados/encapsulados em nanomateriais manufaturados. Recentemente foi demonstrado que, quando dispersos em água salgada artificial, os novos nanoaditivos apresentam uma redução apreciável da sua toxicidade e perigosidade para o ecossistema marinho. Desta forma, o presente estudo teve como objetivo avaliar a toxicidade e a eficácia anti vegetativa de 8 tintas modificadas com biocidas livres ou nano estruturados e 1 tinta comercialmente disponível, assim como relacionar estes dados com parâmetros físico-químicos e a libertação de elementos químicos ao longo do tempo. Destas tintas, duas continham biocidas em estado livre (CuPT e DCOIT (nome comercial Sea-Nine), duas com os biocidas na forma “nano” (CuPT@Zn-Al LDH e Sea-Nine@SiNC), três com nano-estruturas “vazias” (Cu-Al LDH, Zn-Al LDH e SiNC), um controlo negativo (sem biocidas) e um controlo positivo (tinta comercial). A eficácia anti-vegetativa das tintas foi avaliada ao longo de um ano, na marina da Gafanha da Encarnação (Aveiro, Portugal), tendo-se avaliado a evolução das comunidades bacterianas, microfitobentos e de macroorganismos incrustantes. No laboratório, as chapas revestidas foram caraterizadas e, posteriormente, colocadas em aquários para libertar os seus compostos químicos durante 3 meses. Periodicamente, aliquotas de água de cada aquário foram monitorizadas em termos dos efeitos tóxicos em microalgas (inibição de crescimento, Phaeodactylum tricornutum e Tetraselmis chuii) e crustáceos (letalidade Artemia salina), composição elementar (ICP-MS e ICP-OES), quantificação de DCOIT (nas tintas com este composto, via HPLC) e caraterização fisico-química. Globalmente, este estudo mostrou que as tintas com os biocidas em estado livre têm elevada eficácia anti-vegetativa, mas extrema toxicidade. Por sua vez, as tintas anti-vegetativas com nanoaditivos mostraram uma reducão significativa da sua toxicidade e mantiveram (CuPT@Zn-Al LDH) ou até melhoraram (Sea-Nine@SiNC) a eficácia anti-vegetativa contra macrorganismos incrustantes, sobretudo macroalgas, após um ano de imersão em condições reais. Portanto, o encapsulamento/imobilização destes biocidas para aplicação como aditivos anti-vegetativos de tintas parece ser um método bastante promissor em termos ambientais. Mestrado em Biologia Marinha Aplicada

Mestrado em Ecologia Aplicada Biofouling is an ecological succession of fouling communities in submerged surfaces that has extensive ecological, environmental and economic impacts worldwide when developed over man-made structures. In order to minimize this problem, biocides with anti-fouling properties are commonly used in protective coatings of submerged structures. Some decades ago, organotin compounds were used as effective anti-fouling agents, however they were completely banned in 2008 due to the toxic and biomagnification effects. As a consequence, a new generation of biocides were developed with lower toxicity and persistence in the environment when compared to organotin compounds. Recently, one of these biocides (DCOIT) was encapsulated in an engineered nanomaterial (silica mesoporous nanocapsules, SiNC-DCOIT) in order to prevent the interaction of biocides with coatings’ ingredients and control their leaching rate during the early lifetime of conventional paints, with environmental and economic benefits. The present study aimed to assess the toxicity of SiNC-DCOIT and a modified version of the engineered nanomaterial including two biocides, the SiNC-DCOIT coated with silver, to marine species and compare its toxicity with the free counterparts (empty SiNC, DCOIT and Ag). Ecotoxicity tests were carried out with eleven marine species, including bacteria (Vibrio fischeri), microalgae (Isochrysis galbana, Nannochloropsis gaditana, Phaeodactylum tricornutum), rotifers (Brachionus plicatilis), bivalves (Cerastoderma edule, Mytilus galloprovincialis), polychaetes (Hediste diversicolor), crustaceans (Artemia salina, Palaemon varians) and echinoderms (Paracentrotus lividus), following standard tests (with some adaptions in some cases). Acute or short-term chronic endpoints were used upon each species and adopted test. Globally, values of L/E/IC50 for SiNC-DCOIT, SiNC-Ag and SiNC-DCOIT-Ag were higher than the estimated values for DCOIT and silver (dissolved in solution), except for some target groups involved in the early fouling stages, proving that these alternative agents are more environmentally-friendly comparatively to free biocides. The obtained L/E/IC50 and NOEC values from the tested compounds were then used to create species sensitivity distributions together with data from literature. The HC5 and PNEC values derivated from these curves showed that the hazard of DCOIT and silver is reduced when encapsulated, highlighting these novel nanomaterials as a promising anti-fouling solution. A bioincrustação é uma sucessão ecológica de comunidades incrustantes em superfícies submersas que tem extensos impactos ecológicos, ambientais e económicos em todo o mundo quando desenvolvida em estruturas artificiais. Para minimizar esse problema, os biocidas com propriedades anti-incrustantes são comummente utilizados em revestimentos protetores de estruturas submersas. Há algumas décadas atrás, os compostos organoestânicos eram amplamente utilizados como agentes anti-incrustantes eficazes, porém foram definitivamente banidos em 2008 devido a efeitos tóxicos e de biomagnificação reportados. Como consequência, foi desenvolvida uma nova geração de biocidas com menor toxicidade e persistência no meio ambiente em comparação com os compostos organoestânicos. Recentemente, um desses biocidas (DCOIT) foi encapsulado num nanomaterial manufaturado (nanocápsulas de sílica mesoporosas, SiNC-DCOIT), a fim de evitar a interação dos biocidas com os ingredientes dos revestimentos e controlar a sua taxa de libertação durante o início de vida das tintas convencionais, com benefícios ambientais e económicos. O presente estudo teve como objetivo avaliar os efeitos em diversas espécies marinhas do nanomaterial SiNC-DCOIT e de uma versão modificada deste, contendo dois biocidas (SiNC-DCOIT revestido com prata), e comparar a sua toxicidade com os componentes destes nanomateriais (SiNC vazias, DCOIT e Ag). Os testes de ecotoxicidade foram realizados com onze espécies marinhas, incluindo bactérias (Vibrio fischeri), microalgas (Isochrysis galbana, Nannochloropsis gaditana, Phaeodactylum tricornutum), rotíferos (Brachionus plicatilis), bivalves (Cerastoderma edule, Mytilus galloprovincialis), poliquetas (Hediste diversicolor), crustáceos (Artemia salina, Palaemon varians) e equinodermes (Paracentrotus lividus), seguindo testes padrão (com algumas adaptações em alguns casos) ou com protocolos bem definidos. Foram determinados parâmetros agudos ou crónicos de curta duração dependendo da espécie testada e do teste adotado. Globalmente, os valores de L/E/IC50 para SiNC-DCOIT, SiNC-Ag e SiNC-DCOIT-Ag foram superiores aos valores estimados para DCOIT e prata (dissolvidos em solução), com exceção de alguns grupos alvo envolvidos nos primeiros estádios de incrustação, provando assim que estes são agentes alternativos mais amigos do ambiente comparativamente aos biocidas livres. Os valores obtidos de L/E/IC50 e NOEC para os compostos testados foram depois utilizados para derivar curvas de distribuições de sensibilidade de espécies, juntamente com dados da literatura. Os valores HC5 e PNEC derivados dessas curvas mostraram que o perigo do DCOIT e da prata diminui quando encapsulados, destacando que estes nanomateriais inovadores parecem ser uma solução anti-incrustante promissora.

Mestrado em Engenharia de Materiais A aplicação de revestimentos protetores em estruturas marítimas total ou parcialmente imersas em água (ex. navios) é, historicamente, a técnica mais utilizada para fins de conservação e proteção das mesmas contra as condições agressivas da água do mar. No entanto, ao longo da vida útil das estruturas é necessário proceder à renovação/substituição cíclica dos revestimentos devido à diminuição da eficácia dos revestimentos com o passar do tempo. No momento da manutenção, reparação e desmantelamento de cada embarcação, são geradas grandes quantidades de resíduos de tinta nos estaleiros (ou em fábricas especializadas). Pese embora exista forte regulamentação para garantir a eliminação adequada e segura desses resíduos tóxicos, quantidades apreciáveis de pós e resíduos podem acabar no fundo dos rios, estuários ou mares, devido principalmente à ação do vento ou da chuva, com efeitos imprevisíveis e praticamente desconhecidos na vida selvagem. Por conseguinte, o presente estudo teve como objetivo avaliar os efeitos dos resíduos de tintas, recolhidas no campo (doca seca da Navalria, Aveiro) e preparadas em laboratório, testando a sua toxicidade em duas espécies estuarinas representativas da Ria de Aveiro (Portugal): o crustáceo Corophium multisetosum e o poliqueta Hediste diversicolor. No laboratório foram preparados seis tipos de resíduos provenientes de revestimentos comerciais: dois revestimentos anti-corrosão, dois acabamentos (barreira protetora adicional) e duas bi-camadas (compostas por um revestimento anti-corrosão e um acabamento). Uma vez que a composição química dos resíduos da doca seca era totalmente desconhecida e as folhas de segurança das tintas utilizadas no laboratório não contêm informações sobre a toxicidade das mesmas como um todo e sobre a composição de todos os componentes (ex. material de carga), decidiu-se caraterizar todos os resíduos em termos de morfologia, estrutura e composição. Foram empregues técnicas de espectroscopia de infravermelhos com transformada de Fourier (FTIR), microscopia eletrónica de varrimento (MEV) com espectroscopia de dispersão de energia (EDS) e difração de raios X (DRX). Contrariamente aos resultados observados com os poliquetas, verificou-se uma clara dose-resposta na exposição dos anfípodes a todos os resíduos de tintas (laboratoriais ou de campo), o que sugere uma associação entre a toxicidade, ecologia da espécie e as propriedades estruturais, morfológicas e composicionais dos resíduos das tintas. As análises de FTIR, MEV-EDS e DRX aos resíduos das tintas comerciais utilizadas no presente estudo revelaram a presença de cargas minerais (ex. aluminosilicatos; carbonatos), óxidos de titânio e ferro, entre outros ingredientes usualmente considerados inertes associados à componente de “carga” e pigmentos da tinta. O material recolhido junto à Navalria apresenta como principal diferença composicional face aos demais revestimentos testados em laboratório, sinais de Cu na sua composição que deverá estar associado à presença de resíduos de tintas anti-vegetativas. Anti-corrosion and top-coat layers have been applied from the earliest times in maritime immersed structures (e.g. vessels) mostly for conservation and protection purposes against the sea water aggressive conditions. However, coatings renewal/replacement is needed in several moments along the in-service life time of the structures due to the decrease of the coatings effectiveness in a time-dependent manner. In each vessels’ maintenance, reparation and dismantling moment, massive quantities of paint residues are generated in the dockyards (or other type of specialized factories). Although strict regulation exists to ensure the adequate and safe disposal of these toxic products, powders and residues may end up in the bottom of rivers, estuaries or seas, mostly due to the wind or rainfall action, with unpredictable and poorly known effects for wildlife. Therefore, the present study aimed at assessing the exposure effects of paint residues, from the field (Navalria dry docks) and laboratorial preparations, towards two representative estuarine species of the Ria of Aveiro lagoon (Portugal), the crustacean Corophium multisetosum, and the polychaete Hediste diversicolor. Laboratorial preparations included two anti-corrosion coatings, two top-coats and two bi-layers (composed by one anti-corrosion coating and one top-coat) that were applied dried scratched and then homogenized until obtain a fine powder. Since chemical composition of field residues were totally unknown and safety data sheets of the tested paints had limited information regarding the fillers (and other key components) and toxicity of the coatings as a whole, all tested residues were characterized in terms of morphology, structure and composition. Infrared Spectroscopy with Fourier Transform (FTIR), Scanning Electron Microscopy (SEM) with Energy Dispersive Spectroscopy (EDS) and X-ray Diffraction (XRD) techniques were employed. Contrary to the results observed with the polychaetes, there was a clear dose-response in the exposure of amphipods to all paint residues (laboratories or field), suggesting an association between toxicity, species ecology and morphological and compositional properties of paint residues. FTIR, SEMEDS and XRD showed the presence of mineral fillers (e.g. aluminosilicates, carbonates), titanium and iron oxides used as pigments, among other regular ingredients in the commercial paints. The Navalria residues presents Cu which was the main compositional difference compared to other coatings tested in the laboratory.

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