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Orientador : Prof. Dr. Silvio Sanches Veiga Coorientador : Profª. Drª. Olga Meiri Chaim Tese (doutorado) - Universidade Federal do Paraná, Setor de Ciências Biológicas, Programa de Pós-Graduação em Biologia Celular e Molecular. Defesa: Curitiba, 26/02/2015 Inclui referências : f. 102-115 Área de concentração Resumo: O conteúdo total do veneno das aranhas do gênero Loxosceles permanece ainda desconhecido, entretanto, muitos estudos têm mostrado que se constitui uma mistura complexa de compostos biologicamente ativos. Por meio de análises eletroforéticas, observa-se a predominância de moléculas de baixa massa molecular (3-45 kDa), enquanto moléculas de alta massa molecular são menos abundantes. Os venenos de aranhas estão funcionalmente relacionados à defesa contra predadores e também à paralisia e captura de presas, especialmente insetos. As aranhas desenvolveram um arsenal de moléculas inseticidas, resultando em uma biblioteca combinatória de peptídeos que tem sido aprimorada durante sua evolução. Comumente, tais peptídeos consistem em moléculas de cadeia única com massa molecular variando de 3 a 10 kDa, ricos em resíduos de cisteína, os quais estabelecem pontes dissulfeto intramoleculares características. Essas pontes se organizam em um motivo estrutural característico denominado "nó de cistina inibidor" ou ICK (Inhibitor Cystine Knot) e, por isso, os peptídeos que o contém são denominados peptídeo ICK ou notinas ("knottins"). Recentemente, análises do transcriptoma da glândula de veneno de L. intermedia (GREMSKI et al., 2010) revelaram ESTs com similaridade a peptídeos ICK previamente descritas como LiTx (De CASTRO et al., 2004). Sequências relacionadas à LiTx3, por exemplo, foram as mais abundantes no transcriptoma de L. intermedia, representando aproximadamente 13,9% de todas as ESTs obtidas e compreendendo 32% dos mRNAs codificantes de toxinas; as sequências relativas aos demais grupos de peptídeos ICK, LiTx1, LiTx2 e LiTx4 representaram 6,2%, 11,4% e 3,8% de todos os transcritos codificantes de toxinas, respectivamente. Devido a alta proporção de sequências codificantes para peptídeos ICK os objetivos deste trabalho foram o rastreamento de sequências codificantes de peptídeos ICK em outras duas aranhas do gênero (Loxosceles gaucho e Loxosceles laeta), bem como a obtenção de um peptídeo ICK semelhante à LiTx3 de forma recombinante em Pichia pastoris e sua caracterização biológica. A partir do RNA total extraído das glândulas de veneno de L. laeta e L. gaucho, procedeu-se o rastreamento de sequências relacionadas a peptídeos ICK; sequências codificantes para todos os grupos de peptídeos ICK já descritos (LiTx1-4) foram encontradas, algumas revelando sutis diferenças na sua estrutura primária, outras revelando divergências importantes como a não presença de sequências consenso para modificações pós-traducionais importantes para a atividade biológica dos mesmos. Quanto à produção do peptídeo recombinante, várias formas foram obtidas; entretanto, análises de SDS-PAGE e western blotting mostraram que os peptídeos obtidos ou não apresentavam a conformação nativa ou apresentavam glicosilação indesejada. A atividade biológica desses peptídeos foi testada in vivo em insetos e in vitro em cultura de células, contudo nenhum efeito tóxico pode ser comprovado. As sequências encontradas em L. laeta e L. gaucho representam potenciais moléculas a serem exploradas do ponto de vista biotecnológico, ao passo que o peptídeo recombinante estudado deve ser expresso em outros modelos com intuito de obtê-lo em conformação adequada e, assim, comprovar sua atividade biológica. Palavras-chave: Peptídeo ICK, notinas, Loxosceles, veneno, Pichia pastoris. Abstract: The whole content of Loxosceles spider venom still remains unknown, but several studies have shown that is a complex mixture of biologically active and inactive components. By eletrophoretic analysis, the predominance of low molecular mass molecules (3-45kDa) can be observed, while high molecular mass ones are less abundant. Spider venoms are functionally related to defense against predators as well as to paralyze and capture a natural prey, especially insects. Spiders had developed an arsenal of insecticidal molecules, resulting in a combinatorial peptide library of peptides that has been improved during evolution. Commonly, such peptides consist in single chain molecules ranging between 3- 10 kDa and are rich in cystein residues, which form intramolecular disulfide bridges. These bridges establish a structural motif "Inhibitor Cystine Knot" (ICK), then, these peptides are named ICK peptides or "knottins". Recently, a transcriptome analysis of L. intermedia venomous gland (GREMSKI et al., 2010) has revealed ESTs with similarity to ICK peptides previously described as LiTx (De CASTRO et al., 2004). LiTx3-related sequences were the most abundant in the L. intermedia transcriptome representing about 13.9% of all ESTs obtained and comprise 32% of toxin-encoding messengers; the sequences related to the other groups of ICK peptides, LiTx1, LiTx2 e LiTx4, represented 6,2%, 11,4% and 3,8% of all EST coding for toxins, respectively. Due to the high proportion of sequences encoding ICK peptides verified by the transcriptome analyses, the present study aimed screening ESTs related to these peptides in other two Loxosceles species (L. gaucho and L. laeta), as well as the obtainment of an ICK recombinant peptide with high similarity to LiTx3 in Pichia pastoris and its biological activity characterization. From total RNA purified from the venom glands of L. gaucho and L. laeta, it was performed the screening of ICK peptides sequences. ESTs coding for all groups of ICK peptides already described were found (LiTx1-4), some of them revealed subtle differences in their primary structures while others showed important divergences, for example, the absence of consensus sequences for posttranslational modifications that are essential for biological activities. The recombinant peptide was produced in different forms, however, SDS-PAGE and western blotting analyses indicated that they were not properly folded or presented unwanted glycosylation. The biological activity of the recombinant peptide was tested in insects microinjection's assays and in vitro cultivated cells, nevertheless no toxic effects were proven. The sequences identified form L. laeta and L. gaucho RNA represent potential molecules to be biotechnologically explored, whereas the studied recombinant peptide must be expressed in other heterologous expressions models in order to obtain it in the native conformation and, thus, verify its biological activity. Keywords: ICK peptides, knottins, Loxosceles, venom, toxins, Pichia pastoris. recombinant peptide was tested in insects microinjection's assays and in vitro cultivated cells, nevertheless no toxic effects were proven. The sequences identified form L. laeta and L. gaucho RNA represent potential molecules to be biotechnologically explored, whereas the studied recombinant peptide must be expressed in other heterologous expressions models in order to obtain it in the native conformation and, thus, verify its biological activity. Keywords: ICK peptides, knottins, Loxosceles, venom, toxins, Pichia pastoris.

Orientador : Prof. Dr. Silvio Sanches Veiga Coorientadora: Profa. Dra. Olga Meiri Chaim Dissertação (mestrado) - Universidade Federal do Paraná, Setor de Ciências Biológicas, Programa de Pós-Graduação em Biologia Celular e Molecular. Defesa: Curitiba, 28/02/2011 Bibliografia: fls. 74-86 Resumo: O conteúdo total do veneno das aranhas do gênero Loxosceles permanece ainda desconhecido, entretanto, muitos estudos têm mostrado que se constitui uma mistura complexa de compostos biologicamente ativos. Por meio de análises eletroforéticas, observa-se a predominância de moléculas de baixa massa molecular (3-45 kDa), enquanto moléculas de alta massa molecular são menos abundantes. Os venenos de aranhas estão funcionalmente relacionados à defesa contra predadores e também à paralisia e captura de presas, especialmente insetos. As aranhas desenvolveram um arsenal de moléculas inseticidas, resultando em uma biblioteca combinatória de peptídeos que tem sido aprimorada durante sua evolução. Comumente, tais peptídeos consistem em moléculas de cadeia única com massa molecular variando de 3 a 10 kDa, ricos em resíduos de cisteína, os quais estabelecem pontes dissulfeto intramoleculares características. Essas pontes se organizam em um motivo estrutural característico denominado "nó de cistina inibidor" ou ICK (Inhibitor Cystine Knot) e, por isso, os peptídeos que o contém são denominados notinas ("knottins"). Recentemente, análises do transcriptoma da glândula de veneno de L. intermedia (GREMSKI et al., 2010) revelaram ESTs com similaridade a notinas previamente descritas como LiTx (De CASTRO et al., 2004). Sequências relacionadas à LiTx3 foram as mais abundantes no transcriptoma de L. intermedia, representando aproximadamente 13,9% de todas as ESTs obtidas e compreendendo 32% dos mRNAs codificantes de toxinas. Devido a alta proporção de sequências codificantes para peptídeos semelhantes a LiTx3, o presente estudo teve como objetivo a clonagem e expressão de um peptídeo dessa família. Primers foram desenhados para a realização das técnicas de 3' e 5' RACE, o qual teve como resultado a obtenção da sequência nucleotídica completa do cDNA correspondente ao peptídeo em estudo. A sequência do propeptídeo associado ao peptídeo maduro foi amplificada e modificada por PCR com primers contendo sítios de restrição para as enzimas XhoI e BamHI e inseridos no vetor de expressão pET-14b. A construção foi transformada em cepa de E. coli AD494(DE3). Um teste de expressão foi realizado para determinar as condições ótimas de expressão do peptídeo. Verificou-se que a indução com 0,5mM de IPTG, por 3 horas e meia, a 30oC era a melhor condição de expressão. A partir desse resultado, uma expressão em larga escala foi realizada, obtendo-se o peptídeo recombinante na fração solúvel, após cromatografia de afinidade em resina de Ni2+-NTA. A diversidade de peptídeos presentes no veneno de L. intermedia representa uma fonte importante de possíveis novas ferramentas moleculares com aplicação farmacológica e/ou biotecnológica. Abstract: The whole content of Loxosceles spider venom still remains unknown, but several studies have shown that is a complex mixture of biologically active and inactive components. By eletrophoretic analysis, the predominance of low molecular mass molecules (3-45kDa) can be observed, while high molecular mass ones are less abundant. Spider venoms are functionally related to defense against predators as well as to paralyze and capture a natural prey, especially insects. Spiders had developed an arsenal of insecticidal molecules, resulting in a combinatorial peptide library of peptides that has been improved during evolution. Commonly, such peptides consist in single chain molecules ranging between 3-10 kDa and are rich in cystein residues, which form intramolecular disulfide bridges. These bridges establish a structural motif "Inhibitor Cystine Knot" (ICK), then, these peptides are named "knottins". Recently, a transcriptome analysis of L. intermedia venomous gland (GREMSKI et al., 2010) has revealed ESTs with similarity to knottins previously described as LiTx (De CASTRO et al., 2004). LiTx3-related sequences were the most abundant in the L. intermedia transcriptome representing about 13.9% of all ESTs obtained and comprise 32% of toxin-encoding messengers. Due to the high proportion of sequences encoding LiTx3 peptide, the present study aimed to clone and express a peptide of this family. Primers were designed to perform 3'RACE and 5'RACE methods, obtaining the full nucleotide sequence of this peptide. The sequence corresponding propeptide associated with the mature peptide was amplified and modified by PCR with specific primers containing restriction sites for XhoI and BamHI enzymes and inserted in pET-14b vector. The construct was transformed in E. coli AD494(DE3) strain. A small scale expression was performed and the optimum parameters for recombinant protein expression were determined: 0,5mM of IPTG induction during 3h and 30min at 30°C. A large scale expression was done to obtain enough quantity of this molecule for biological assays. After affinity chromatography in Ni-NTA resin, the recombinant peptide was obtained in the soluble fraction. The diversity of peptides present in the L. intermedia venom glands represents an amazing source of novel molecular tools with pharmacological and biotechnological applications.

Submitted by arlindo kohlrausch (ajfk@uepg.br) on 2022-04-13T16:44:17Z No. of bitstreams: 2 license_rdf: 811 bytes, checksum: e39d27027a6cc9cb039ad269a5db8e34 (MD5) Josyel Olszewski.pdf: 2368298 bytes, checksum: 3e0bf650859904bfcaead57f143d127c (MD5) Made available in DSpace on 2022-04-13T16:44:17Z (GMT). No. of bitstreams: 2 license_rdf: 811 bytes, checksum: e39d27027a6cc9cb039ad269a5db8e34 (MD5) Josyel Olszewski.pdf: 2368298 bytes, checksum: 3e0bf650859904bfcaead57f143d127c (MD5) Previous issue date: 2016-07-18 Bactérias fixadoras de nitrogênio estão sendo cada vez mais utilizadas como fertilizantes biológicos (biofertilizantes) em substituição aos fertilizantes químicos. O gênero Herbaspirillum foi inicialmente isolado de gramíneas de interesse agrícola no Brasil e devido a sua capacidade de fixar nitrogênio atmosférico, tem sido testada como biofertilizante de algumas culturas como a cana de açúcar e o milho. Porém, mesmo sendo considerado um gênero não-patogênico, seus mecanismos de interação com as plantas são semelhantes aos mecanismos de infecção de uma bactéria patogênica e, recentemente, foram relatados casos de isolamento dessa bactéria em pacientes hospitalizados, geralmente imunocomprometidos e/ou com doenças graves como leucemia e principalmente fibrose cística. Considerando isso, o objetivo do presente estudo foi o de avaliar o potencial patogênico das seguintes cepas do gênero Herbaspirilum: cepa ambiental H. seropedicae SmR1 e suas formas modificadas (RAM GFP e ds RED) e as cepas de isolados clínicos H. frisingense AU14559 e H. huttiense AU11883. Testes in vitro utilizando os reagentes MTT e VN foram realizados para avaliar a viabilidade de células pulmonares Calu-3 após exposição ao sobrenadante estéril das culturas bacterianas com 8 ou 18 h de crescimento, evidenciando a citotoxicidade das diferentes cepas da espécie H. seropedicae. Ensaios de morfologia celular utilizando os mesmos sobrenadantes induziram alterações morfológicas nas células Calu-3 com todas as cepa testadas. A metodologia de adesão mostrou que as cepas isoladas de infecções em humanos, H. huttiense AU11883 e H. frisingense AU14559, são capazes de aderir sobre as células Calu-3, sendo consideradas bactérias de baixa adesão. Nos ensaios in vivo, utilizando um modelo de indução de pneumonia em camundongos, a cepa H. seropedicae SmR1 foi capaz de induzir perda severa de peso desses animais, aumento na contagem total de leucócitos e proporção de neutrófilos no lavado broncoalveolar (LBA), além de alterações histopatológicas nos pulmões, como infiltrado perivascular e peribronquiolar. A cepa isolada de infecções pulmonares, H. huttiense AU11883, apresentou citotoxicidade e adesão in vitro, além de alterações histológicas no pulmão dos animais inoculados intratraquealmente, mas não houve perda de peso ou alterações significativas no LBA. Esses resultados demonstram que a cepa ambiental H. seropedicae SmR1 apresentou indícios que confirmam seu potencial patogênico, mas ainda são necessários testes com um número maior de cepas para avaliar o potencial patogênico deste gênero bacteriano. Nitrogen fixing bacteria are being widely used as biological fertilizers (biofertilizers) as a substitute to chemical compounds. Herbaspirillum genus was first isolated from grasses of agricultural interest in Brazil and, due to their ability to fix atmospheric nitrogen, has been tested as a biofertilizer in some agricultural crops such as sugar cane and corn. However, even being considered a non-pathogenic genus, their interaction mechanism with plants are similar to mechanism of infections from a pathogenic bacterium and recently there have been reports of isolation of these bacteria in hospitalized patients, usually in immunocompromised patients and/or with severe diseases like leukemia and mainly cystic fibrosis. Regarding this, the objective of this study was to evaluate the pathogenic potential of the strains of the genus Herbaspirillum: environmental strain H. seropedicae SmR1 and their modified forms (RAM GFP and ds RED) and the clinical isolated strains H. frisingense AU14559 e H. huttiense AU11883. In vitro tests using reagents MTT and Neutral Red were performed to evaluate lung cells Calu-3 viability following exposure to sterile supernatant of bacterial cultures with 8 and 18 h of growth, showing cytotoxic effect of all different strains of the species H. seropedicae used. Morphology cell tests using the same supernatants induced alterations in Calu-3 cells with all bacterium strains used. Cell adhesion methodology showed that the human isolated strains H. huttiense AU11883 and H. frisingense AU14559 are capable of adhering on Calu-3 cells, being considered low adhesion bacteria. In in vivo assays, using a pneumonia induced model in mice, H. seropedicae SmR1 strain was able to induce severe weight loss in those animals, as well as a rise in total leukocytes count and neutrophils on bronchoalveolar lavage (LBA) and histopathological changes on the lungs, like perivascular and peribronchial infiltrates. The clinical isolated strain from infected lungs, H. huttiense AU11883, showed cytotoxicity and adhesion in vitro, and also histopathological changes on the lungs of intratracheal inoculated animals, but they didn’t show weight loss or significant alterations on LBA. Those results shows that the environmental strain H. seropedicae SmR1 presented evidence confirming its pathogenic potential, but are still required further tests with a larger number of strains to evaluate the pathogenic potential of this bacterial genus.