Search

Tese (doutorado) - Universidade Federal de Santa Catarina, Centro de Ciências Biológicas, Programa de Pós-Graduação em Biologia Celular e do Desenvolvimento, Florianópolis, 2014. As células-tronco mesenquimais (CTM) adultas abrangem uma população de células que pode ser isolada a partir de vários órgãos e tecidos que têm sido sugerida como uma fonte atrativa de células para a engenharia de tecidos em razão da sua multipotencialidade e capacidade de liberação de moléculas ativas. Representam assim uma fonte promissora de células para o tratamento de lesão da medula espinhal, uma desordem neurológica que compromete funções motoras, sensoriais, reflexas e autonômicas. As CTM derivadas da derme humana apresentam a capacidade de se diferenciar em células das linhagens mesenquimal e ectodérmica in vitro. Neste trabalho, investigamos o potencial neural de CTM da derme humana (CTMD). A expressão espontânea de marcadores neurais por CTM tem sido considerada uma demonstração da sua predisposição para originar linhagens neurais. Neste trabalho, demonstramos que as CTMD expressam marcadores neurais in vitro, em meio de cultivo padrão e in vivo, em modelo animal de lesão de medula espinhal. Uma vez que a combinação do fator de crescimento epidérmico (EGF) e do fator de crescimento do fibroblasto tipo 2 (FGF2) é mitogênica e promove o comprometimento neuronal de diversas populações de células-tronco, avaliamos seus efeitos em estimular o potencial neuronal das CTMD in vitro. O tratamento com a combinação de EGF e FGF2, promoveu um aumento na proporção de células que expressam marcadores de pluripotência, marcadores neurais precoces e marcadores neuronais e gliais, em detrimento da expressão de marcadores mesenquimais. Além disso as CTMD responderam a estímulos neurogênicos, aumentando a expressão de proteínas neuronais específicas, e reduzindo a expressão de marcadores neurais precoces e marcadores gliais. Ademais, as CTMD promovem a recuperação funcional locomotoraparcial em ratos com lesão da medula espinhal, e sobrevivem no tecido medular. Portanto, as CTMD apresentam potencial neural in vitro e in vivo, que pode ser explorado em terapia para a regeneração da lesão medular, e possivelmente como complemento a outras terapias. Abstract : Adult mesenchymal stem cells (MSCs) correspond to a cell population isolated from several organ and tissues that represent an attractive source of cells for tissue engineering due to their multipotentiality and ability to release active molecules. MSCs derived from human dermis (DMSCs) are able to differentiate into mesenchymal and ectodermal cell lineages in vitro. In this study, we have investigated the neural potential of DMSCs. The expression of neural markers by MSCs has been considered a demonstration of their predisposition to differentiate towards neural lineages. Here we show that human DMSCs express in vitro and in vivo neural markers. Since the combination of epidermal growth factor (EGF) and fibroblast growth factor type 2 (FGF2) promotes the neural commitment of stem cells, we examined its effects in the neuronal potential of DMSCs. The treatment with the combination of EGF and FGF2 increased the proportion of cells positives for pluripotency and neural (neuronal and glial) markers and reduced those expressing the smooth muscle marker. Moreover, DMSCs were able to respond to neurogenic stimulation expressing neuronal specific proteins, at the expense of early neural and glial markers. Furthermore, DMSCs are able to survive and integrate into the spinal tissue partially recovering spinal cord injured rats. Therefore, DMSCs represent an attractive source of cells for therapy of spinal cord injuries and possibly also for other therapies.

Dissertação (mestrado) - Universidade Federal de Santa Catarina, Centro de Ciencias Biológicas, Programa de Pós-Graduação em Neurociências, Florianópolis, 2010 A crista neural (CN) constitui uma população celular pluripotente derivada das pregas neurais da placa neural que surge nos estágios iniciais da embriogênese, durante o processo de neurulação. A CN origina todo o sistema nervoso periférico, pigmentação do corpo além dos ossos e cartilagens crânio-faciais. A deficiência de ácido fólico (AF) promove um aumento nos níveis de homocisteína (HC) e tem sido associada a diversas anomalias congênitas, principalmente a defeitos no fechamento do tubo neural e neurocristopatias. No entanto, os mecanismos celulares desse processo não estão esclarecidos e se são causados pela deficiência de folato ou pelo aumento dos níveis de HC. Desse modo, esse trabalho tem por objetivo investigar o efeito da HC e AF em diversos aspectos da morfogênese da CN, como a migração, proliferação, morte e diferenciação celular. Culturas primárias de células da crista neural (CN) da região cefálica (mesencefálo) foram realizadas a partir de explantes das pregas neurais de embriões murinos de 8,5 dias de gestação. Os explantes foram cultivados sobre substrato de fibronectina (FN) (20µg/mL) em meio de cultura contendo homocisteína (HC) (0, 75, 150 ou 300 uM) e/ou ácido fólico (AF) (45 e 90uM). Após 48 horas, os explantes foram removidos e as células da CN que migraram para a placa de cultivo a partir do tubo neural foram tripisinizadas, replaqueadas e mantidas em cultura por mais 10 dias nas mesmas condições de tratamento. Os fenótipos celulares foram identificados por imunofluorescência utilizando anticorpos para proteínas marcadoras específicas de células gliais (proteína ácida fibrilar glial-GFAP), neurônios (-Tubulina III), células de músculo liso (alfa-actina de músculo liso-aSMA) e células da crista neural indiferenciada (nestina e p75). Foram analisados ainda, a área de migração das células da CN, a proliferação celular por incorporação de BrdU e a proporção de núcleos apoptóticos. Nossos resultados demonstram que a HC reduz a diferenciação da CN para o fenótipo de músculo liso de maneira dosedependente, e aumenta a proporção de células indiferenciadas, não alterando a proporção de células gliais e neurônios. A adição de AF previne esse efeito da HC. A proporção de núcleos apoptóticos manteve-se baixa em todas as condições analisadas, sugerindo que os efeitos observados não se devem a uma morte celular acentuada. Por outro lado, observamos um progressivo aumento na migração e proliferação celular das células da CN após tratamento com concentrações crescentes de HC, efeito este prevenido pela adição de AF. Os resultados sugerem que a HC influencia os processos de diferenciação, migração e proliferação das células da CN podendo assim estar relacionada com o surgimento de anomalias congênitas e que o AF previne esses efeitos. The neural crest (NC) is a transient structure of the vertebrate embryo formed by the lateral borders of the neural primordium during neurulation. The NC originates most of neurons and glial cells of the peripheral nervous system, pigment cell of body and bones and cartilage of the head. Folic acid (FA) deficiencies lead to an increase in the levelf of homocysteine (HC) and have been associated with many adverse congenital abnormalities, particularly neural tube closure defects and neurocristopathies. However, it is not clear, whether these defects are due to a FA deficiency or to the increased levels of (HC) levels neither the involvement of the NC cells. Thus, the objective of this study was to investigate the effect of HC and AF in various aspects of morphogenesis the CN, such as migration, proliferation, death and cell differentiation. Primary cell cultures were performed by mechanical dissection of neural tubes of 8.5 days post coitum mouse embryos at the level of mesencephalon. Explants were applied on plastic dishes coated with fibronectin (FN) (20ìg/mL), being removed 48 hours later. The remaining migrated cells (NC cells) were then trypsinized, reapplied on the same culture condition and cultured for additional 10 days. Cells were cultured in the complex media containing HC (0, 75, 150 or 300 uM) and/or FA ( 45 or 90uM). The medium was changed every 3 days. The cell phenotypes were identified by immunofluorescence using the ineagespecific markers to glial cells (GFAP), neurons (-III-Tubulin), smooth muscle cells (aSMA), and indiferentiated neural crest cells (nestin and p75). It was also analyzed the NC cell migration area, the cell proliferation (by BrdU incorporation) and the proportion of apoptotic nuclei. We could observe that HC reduces in a dose-dependent manner the differentiation of NC to smooth muscle cells, and increases the proportion of undifferentiated cells, an effect that is prevented by AF. The proportion of apoptotic nuclei was insignificant in all tested condition, suggesting that massive cell death is not responsible to the observed effects. In addition, we verified that HC progressively increased the migration and proliferation of NC cells, effects prevented by FA. These results suggest an effect of the HC in the differentiation, migration and proliferation processes of the CN cells that may be involved in ongenital anomalies, and that FA prevent this effects.