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Chitosans, partially de-N-acetylated derivatives of chitin, are multifunctional biopolymers. In nature, biological activities of partially acetylated chitosan polymers are mediated in part by their oligomeric breakdown products, which are generated in situ by the action of chitosanolytic enzymes. Understanding chitosanolytic enzymes, therefore, can lead to the production of chitosan oligomers with fully defined structures that may confer specific bioactivities. To address whether defined oligomer products can be produced via chitosanolytic enzymes, we here characterized a GH8 family chitosanase from Bacillus spec. MN, determining its mode of action and product profiles. We found that the enzyme has higher activity towards polymers with lower degree of acetylation. Oligomeric products were dominated by GlcN3, GlcN3GlcNAc1, and GlcN4GlcNAc1. The product distribution from oligomers were GlcN3 > GlcN2. Modeling and simulations show that the binding site comprises subsites ranging from (−3) to (+3), and a putative (+4) subsite, with defined preferences for GlcN or GlcNAc at each subsite. Flexible loops at the binding site facilitate enzyme-substrate interactions and form a cleft at the active site which can open and close. The detailed insight gained here will help to engineer enzyme variants to produce tailored chitosan oligomers with defined structures that can then be used to probe their specific biological activities.

Among different Candida species triggering vaginal candidiasis, Candida albicans is the most predominant yeast. It is commonly treated using azole drugs such as Tioconazole (TIO) and Econazole (ECO). However, their low water solubility may affect their therapeutic efficiency. Therefore, the aim of this research was to produce a novel chitosan nanocapsule based delivery system comprising of TIO or ECO and to study their suitability in vaginal application. These systems were characterized by their physicochemical properties, encapsulation efficiency, in vitro release, storage stability, cytotoxicity, and in vitro biological activity. Both nanocapsules loaded with TIO (average hydrodynamic size of 146.8 ± 0.8 nm, zeta potential of +24.7 ± 1.1 mV) or ECO (average hydrodynamic size of 127.1 ± 1.5 nm, zeta potential of +33.0 ± 1.0 mV) showed excellent association efficiency (99% for TIO and 87% for ECO). The analysis of size, polydispersity index, and zeta potential of the systems at 4, 25, and 37 °C (over a period of two months) showed the stability of the systems. Finally, the developed nanosystems presented fungicidal activity against C. albicans at non-toxic concentrations (studied on model human skin cells). The results obtained from this study are the first step in the development of a pharmaceutical dosage form suitable for the treatment of vaginal candidiasis.

Cancer gene therapy requires the design of non-viral vectors that carry genetic material and selectively deliver it with minimal toxicity. Non-viral vectors based on cationic natural polymers can form electrostatic complexes with negatively-charged polynucleotides such as microRNAs (miRNAs). Here we investigated the physicochemical/biophysical properties of chitosan-hsa-miRNA-145 (CS-miRNA) nanocomplexes and the biological responses of MCF-7 breast cancer cells cultured in vitro. Self-assembled CS-miRNA nanocomplexes were produced with a range of (+/-) charge ratios (from 0.6 to 8) using chitosans with various degrees of acetylation and molecular weight. The Z-average particle diameter of the complexes was

Sorocea bonplandii is a dioecious sub canopy plant species with an abundant and widespread distribution in the Atlantic Forest, Southern Brazil. It is traditionally used for art crafts and popular medicine. We have investigated the genetic status of S. bonplandii in one large and six small populations of the fragmented Atlantic Forest in southern Brazil. In spite of population fragmentation, the allozyme electrophoretic analysis involving 23 loci of 12 enzymes from 420 plants revealed unusually high frequencies of heterozygous genotypes and a balanced distribution, in agreement with Hardy-Weinberg proportions. Very little genetic differentiation among populations was detected. The observed excess of heterozygotes suggests that selection favors heterozygous plants. Although S. bonplandii is a dominant sub-canopy species which strongly depends on ombrophilous environmental conditions, its genetic structure and diversity do not appear to suffer with forest fragmentation. All of these characteristics, in addition to its medicinal uses, suggest that this species is a potential resource for sustainable management of tropical forests in southern Brazil.

Sowohl konventionelle als auch ökologische Landwirtschaft werden noch immer vom Einsatz umweltschädlicher und oft giftiger Pestizide bestimmt. Chitosane sind Zuckermoleküle, die einerseits aktiv die Resistenz von Pflanzen gegenüber Krankheiten erhöhen, andererseits Pflanzenschädlinge direkt angreifen können. Da Chitosane unter anderem aus Krabbenschalen oder Insektenpanzern gewonnen werden können, sind sie eine erneuerbare und nachhaltige Ressource und stellen eine attraktive Alternative zum chemisch geprägten Pflanzenschutz dar. In dieser Arbeit wurde die Eignung von Chitosan als Pflanzenschutzmittel überprüft, indem es als Fungizid gegen den Weizenschädling Fusarium graminearum und als Resistenzinduktor auf Kartoffelpflanzen getestet wurde. Dabei hat sich einerseits gezeigt, dass Chitosane das Wachstum von Fusarium graminearum verhindert, andererseits wurden verschiedene Abwehrmaßnahmen in der Kartoffelpflanze aktiviert, die auch auf genetischer Ebene nachgewiesen werden konnten. Both conventional and organic agriculture are still largely dependent on the usage of ecologically harmful and toxic pesticides. Chitosans are sugars, which can induce the resistance of plants against diseases and prevent growth and spread of phytopathogens at the same time. Chitosans display a sustainable and renewable resource as they are attained from exoskeletons of crabs or insect cuticles. This thesis shows the antifungal activity of chitosans against the wheat pathogen Fusarium graminearum as well as its resistance-inducing potential on potato plants. It was observed that chitosans inhibit the growth of Fusarium graminearum and trigger defense mechanisms in potato plants that could also be determined via transcriptome expression analysis.

Chitin Deacetylasen (CDAs) katalysieren die Acetamido-Hydrolyse von N-Acetylglucosamin zu Glucosamin in Chitin und Chitosan. Es ist nachgewiesen, dass chemisch produzierte Chitosane ein zufälliges Acetylierungsmuster (PA) aufweisen, welches wahrscheinlich die biologische Aktivität und damit die Anwendung des Polymers beeinflusst. Thema dieser Arbeit ist die Charakterisierung zweier pilzlicher CDAs (BC95 aus Botrytis cinerea und PaCDA aus Podospora anserina), welche zusätzlich zur katalytischen Domäne Chitin-Bindedomänen (CBDs) aufweisen. Die heterologe Produktion beider Enzyme wurde erfolgreich in der Hefe Hansenula polymorpha durchgeführt, jedoch zeigte nur PaCDA Enzymaktivität. Des Weiteren wurden Deletionsvarianten der PaCDA erstellt, um die Rolle der CBDs zu untersuchen. Die Wirkungsweise von PaCDA wurde anhand der Produkte analysiert und ist nicht prozessiv; dennoch produziert das Enzym ein spezifisches Acetylierungsmuster, welches durch alternierende Einheiten gekennzeichnet ist Chitin deacetylases (CDAs) catalyze the acetamido hydrolysis of N-acetylglucosamine to glucosamine in chitin and chitosan. It has been demonstrated that chemically produced chitosans show a random pattern of acetylation (PA), which is supposed to influence the biological activity and thereby the application of the polymer. The subject of this study is the characterization of two fungal CDAs (BC95 from Botrytis cinerea and PaCDA from Podospora anserina), which possess additional chitin binding domains (CBDs) next to the catalytic domain. The heterologous production of both enzymes was successful in Hansenula polymorpha, but CDA activity was confirmed only for PaCDA. Additionally, deletion variants of PaCDA were constructed to analyze the role of the CBDs. The mode of action of PaCDA was determined by product analysis and is not processive; nevertheless the enzyme is producing a specific PA, which is characterized by alternating unit

Die allogene Stammzelltransplantation (SZT) ist eine der effektivsten Formen der zellulären Immuntherapie. In der klinischen Forschung zur allogenen Immunzelltherapie, ist u.a. die Charakterisierung von minor Histokompatibilitätsantigenen (mHags) und Tumorantigenen als Zielstruktur der Spender-gegen-Tumor (Graft-versus-tumor, GvT)-Reaktion und deren Nutzen für den therapeutischen Einsatz nach einer SZT von zentralem Interesse.Ziel der Arbeit war es, am Beispiel des mHags HY, den Einfluss auf die GvHD- und GvT-Reaktion nach einer SZT zu evaluieren. Dabei wurde zwischen einer ubiquitären oder nur selektiven, tumorassoziierten Expression unterschieden. Darüber hinaus sollten die an der GvT-Reaktion beteiligten Effektorzellen charakterisiert werden.Es wurde in dieser Arbeit gezeigt, dass ubiquitär exprimierte mHags, wie das männliche mHag HY, relevante Zielstrukturen der GvHD sind, jedoch mit einem geringeren Einfluss auf den erwünschten Anti-Tumor-Effekt wirken. Allogeneic stem cell transplantation (SCT) is one of the most effective forms of cellular immunotherapy. In clinical research for adoptive immunotherapy of leukemia characterization of minor histocompatibility antigens (mHag) and tumor associated antigens (TAA/TSA) as a target of antitumor response (GvT) and their utility as therapeutic uses after stem cell transplantation (SCT) move more in focus.In this study, we wanted to clarify how far the male mHag HY can affect the GvHD and GvT reactions after SCT, when it is expressed ubiquitously on healthy tissues or selective on tumor only in recipients. In addition, the effector cells involved in the GvT reaction were characterized.Our experimental data indicate that minor Histocompatibility Antigens like the male mHag HY are relevant targets for T cells mediated GvH reaction but less important for the desired GvT effect.

Chitin ist nach Cellulose das am häufigsten in der Natur vorkommende Biopolymer. Chitosan ist die vollständige oder teilweise deacetylierte Version des Chitins. Chitin und Chitosan modifizierende Enzyme (CCME) finden als Werkzeuge zur Erzeugung spezieller Chitosane für die Biotechnologie und Biomedizin Anwendung. In dieser Arbeit wurde sowohl mithilfe einer metagenomischen Genbank als auch mittels mikrobieller Direktisolaten nach neuen CCMEs gesucht. Als Ausgangsmaterial für diese beiden Ansätze dienten Bodenproben, die über mehr als zehn Jahre in Kontakt mit Chitin und Chitosan waren. CCME kodierende Gene aus Bacillus spp. wurden in E. coli-Stämmen heterolog exprimiert und die entsprechenden Enzyme aufgereinigt. Eine Inkubation von Chitosanpolymeren verschiedener Acetylierungsgrade (50%, 35% und 10%) mit den aufgereinigten Enzymen generierte Mischungen aus Chitin- und Chitosan-Oligomeren, die vielversprechende Elicitor- und Priming-Effekte auf pflanzliche Zellkulturen hatten.

Während der enchondralen Ossifikation, der indirekten Knochenbildung, durchlaufen die Chondrozyten verschiedene Stufen der Proliferation und der Spätdifferenzierung. Einer dieser Faktoren -Kollagen VIII- wurde intensiv untersucht. Kollagen VIII ist ein Hauptbestandteil der Descemet-Membran des Auges und kommt z.B. auch in den Wänden von Arterien und im Knorpel vor. Seine Funktion im Knorpel ist noch unbekannt. Es konnte gezeigt werden, dass die Expression von alpha1(VIII) und alpha2(VIII) während der späten Differenzierung von Hühnerchondrozyten in vitro abnimmt und dass eine Reduzierung der Kollagen VIII alpha1-Expression in kaudalen Chondrozyten zu einer Beschleunigung der hypertrophen Differenzierung der Zellen führt. Kollagen alpha1(VIII) spielt folglich eine wichtige Rolle als negativer Regulator der späten Chondrozytendifferenzierung während der enchondralen Ossifikation.

Osteoprotegerin (OPG) wird immer häufiger mit einer protektiven Funktion in der Entstehung arteriosklerotischer Erkrankungen in Verbindung gebracht. Im Rahmen dieser Arbeit wurden 5 SNPs in der Promotorregion des OPG identifiziert (T-960C, A-946G, G-900A, T-864G und T-159C), deren allelische Konstellation generieren 3 molekulare Haplotypen (MolHaps). Sowohl die MolHaps, als auch SNP T-159C beeinflussen die transkriptionelle Aktivität des OPG Promotors. Mit Hilfe serieller Deletionskonstrukte wurde ein cis-aktives Element im OPG Promotor identifiziert, welches notwendig für eine ausreichende transkriptionelle Aktivität des Promotors ist, und zum anderen mit SNP T-159C interagiert. Auf Grundlage dessen, wird in dieser Arbeit ein hypothetisches Modell der Genexpressionskontrolle vorgeschlagen: Sp1, NF-1, Egr1 und potentiell NFkB bilden ein transkriptionelles Modul und stimulieren die Expression von OPG.

Im Genom des phytopathogenen Pilzes Fusarium graminearum konnten 24 Gene identifiziert werden, deren Proteinprodukte Homologien zu Cellulasen aufweisen. Die Transkription von zwei Exo- (cel6 und cel7A) und zwei Endocellulasegenen (cel7B und cel45) war über Cellulose und Weizenzellwand induzierbar, während Glukose in der Regel zu keiner Induktion führte. Die Transkription von drei der vier untersuchten Gene konnte auch während der Infektion von Weizenpflanzen nachgewiesen werden (cel6, cel7A und cel45). Eine Beteiligung dieser Cellulasen am Infektionsprozess ist daher wahrscheinlich. Der Transkriptionsfaktor ACEI ist an der Regulation von Cellulasegenen beteiligt. Das Gen dieses Faktors wurde im Genom von F. graminearum identifiziert, sequenziert und charakterisiert. Das Ausschalten des konstitutiv transkribierten Gens des Transkriptionsfaktors ACEI in F. graminearum führte auf Weizenpflanzen zu einer erhöhten Virulenz der Mutante im Vergleich zum Wildtyp.

Die pflanzliche Zellwand ist eine der Hauptbarrieren, die Pflanzen gegen Pathogene schützen. Daher können Enzyme, die am Abbau von Zellwandkomponenten beteiligt sind, als Pathogenitätsfaktoren betrachtet werden. In der vorliegenden Arbeit wurden extrazelluläre Proteasen des Phytopathogens Fusarium graminearum, das bei Getreide Ährenfusariosen verursacht und für große Ernteeinbußen verantwortlich ist, mit biochemischen und molekularbiologischen Methoden untersucht. Die Kultivierung des Pilzes in Flüssigmedium unter Zugabe von Gelatine als einziger Stickstoffquelle wurde als Modellsystem zur Proteaseinduktion ausgewählt, da Gelatine sowohl hinsichtlich der Aminosäurezusammensetzung als auch der molekularen Struktur Ähnlichkeiten mit Strukturproteinen der pflanzlichen Zellwand besitzt. Zwei pilzliche Proteasen aus der Klasse der subtilisinähnlichen Serinproteasen konnten identifiziert und mit dem zeitlichen Verlauf der proteolytischen Aktivität im Medium in Zusammenhang gebracht werden. Weiterhin wurde ein Gen identifiziert und charakterisiert, das für eine subtilisinähnliche Protease codiert. The plant cell wall is one of the major barriers that protect plants against pathogens. Therefore cell wall degrading enzymes can be regarded as factors involved in pathogenicity. In the present work extracellular proteases of the phytopathogen Fusarium graminearum that causes Fusarium head blight in cereals and is responsible for substantial yield losses were investigated with biochemical and molecular biological methods. Cultivation of the fungus in liquid medium with gelatin as the sole nitrogen source was chosen as the model system because of the similarities in amino acid composition and molecular structure between gelatin and structural proteins in the plant cell wall. Two fungal proteases belonging to the subtilisin like serine proteases were identified and correlated with the time course of proteolytic activity in the medium. Furthermore a gene coding for a subtilisin like protease was identified and characterized.

Das Ziel der vorliegenden Arbeit war es, die mit biochemischen Methoden gewonnenen Erkenntnisse bezüglich der pektinolytischen Enzyme des Getreidepathogens Fusarium graminearum [Conze, 2000] mit molekularbiologischen Methoden weiter zu vertiefen. Um dieses Ziel zu erreichen, sind zunächst die genetischen Informationen von zwei Genen, pel1 und pel2, die für Pektat-Lyasen kodieren, gewonnen worden. Die Induzierbarkeit der Transkription der Gene durch Substrate der Enzyme, bzw. die Reprimierbarkeit durch Glukose in in vitro-Versuchen lässt darauf schließen, dass die Enzyme nur unter induzierenden Bedingungen während der Interaktion mit der Pflanze synthetisiert werden. Die heterologe Expression des pel1-Gens ist in A. niger erfolgreich durchgeführt worden. Die Charakterisierung des Genprodukts hat die Einordnung des Enzyms als Endo-Pektat-Lyase bestätigt. Der Promotor des pel1-Gens ist initial untersucht worden. In A. niger zeigt sich, dass die Kontrolle des Promotors und damit der Reprimierung bzw. Induktion möglicherweise in direktem Zusammenhang mit Glukose bzw. Pektin oder Polygalakturonsäure steht.

Resistente Weizenpflanzen reagieren auf Befall mit Weizenschwarzrost (Puccinia graminis f. sp. tritici) mit einer hypersensitiven Lignifizierungsreaktion. Dieser sehr effektive Abwehrmechanismus wird in infizierten suszeptiblen Pflanzen nicht ausgelöst. Chitosanpolymere konnten als Elicitoren von Abwehrreaktionen in Weizenpflanzen identifiziert werden. Chitosanpolymere rufen allerdings unspezifisch sowohl in resistenten als auch in suszeptiblen Weizenpflanzen Resistenzreaktionen hervor. In suszeptiblen Weizenpflanzen könnten daher Pektinoligomere als Suppressoren von Resistenzreaktionen wirken. In der vorliegenden Arbeit wurde untersucht, ob Chitosanelicitor-induzierte Abwehrreaktionen durch Pektinoligomere supprimierbar sind. Es wird postuliert, dass der Weizenschwarzrost mit Hilfe eines Pektin-abbauenden Enzyms Pektinoligomere nur aus der Zellwand suszeptibler Weizenpflanzen herauslösen kann. Vergleichende immunologische Untersuchungen der Weizenzellwände resistenter und suszeptibler Pflanzen sowie ein in vitro Nachweis von Pektin-abbauenden Enzymen des Rostpilzes wurden durchgeführt.