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Metastases largely rely on hematogenous dissemination of tumor cells via the vascular system and significantly limit prognosis of patients with solid tumors. To colonize distant sites, circulating tumor cells must destabilize the endothelial barrier and transmigrate across the vessel wall. Here we performed a high-content screen to identify drugs that block tumor cell extravasation by testing 3,520 compounds on a transendothelial invasion coculture assay. Hits were further characterized and validated using a series of in vitro assays, a zebrafish model enabling three-dimensional (3D) visualization of tumor cell extravasation, and mouse models of lung metastasis. The initial screen advanced 38 compounds as potential hits, of which, four compounds enhanced endothelial barrier stability while concurrently suppressing tumor cell motility. Two compounds niclosamide and forskolin significantly reduced tumor cell extravasation in zebrafish, and niclosamide drastically impaired metastasis in mice. Because niclosamide had not previously been linked with effects on barrier function, single-cell RNA sequencing uncovered mechanistic effects of the drug on both tumor and endothelial cells. Importantly, niclosamide affected homotypic and heterotypic signaling critical to intercellular junctions, cell–matrix interactions, and cytoskeletal regulation. Proteomic analysis indicated that niclosamide-treated mice also showed reduced levels of kininogen, the precursor to the permeability mediator bradykinin. Our findings designate niclosamide as an effective drug that restricts tumor cell extravasation through modulation of signaling pathways, chemokines, and tumor–endothelial cell interactions.Significance:A high-content screen identified niclosamide as an effective drug that restricts tumor cell extravasation by enhancing endothelial barrier stability through modulation of molecular signaling, chemokines, and tumor–endothelial cell interactions.

Effects of positive hits on endothelial barrier, cytoskeletal organization and tumor cell motility

Effect of drug hits on cortical actin and tumor cell migration and invasion

Phenotypes of the human pancreatic cell Ines and effects on endothelium

Methods and Reagents

Determination of niclosamide stability and approach for counting lung metastatic nodules

Analysis of scRNAseq findings

Work flow to assess effects of drug hits in vivo

Este trabajo pretende analizar la flexibilidad laboral en los conservatorios de música de Aragón, una vez vivida la situación sanitaria del COVID-19 en el año 2020, y todo lo que supuso para este sector de enseñanza pública. Del mismo modo, se investiga sobre una de las prácticas más novedosas de flexibilidad laboral como es el teletrabajo y la influencia que tuvo durante la pandemia en los docentes de los conservatorios de música, y cómo ha recalado más recientemente, ya que lo habitual en este tipo de enseñanza era la presencialidad docente. Tras la situación sanitaria, se pretende analizar lo que supondría para los docentes de los conservatorios de música el instaurar este tipo de flexibilidad laboral como recurso alternativo o complementario a la docencia presencial.

La aceleración del cambio climático amenaza gravemente a la producción agrícola, y uno de los sectores más afectados es el vitivinícola. Aunque los escenarios futuros son inciertos, todo apunta a que la situación climatológica en las regiones mediterráneas va a dificultar aún más el cultivo de la vid. Sin embargo, debido a que el calentamiento no es homogéneo y cada zona vitivinícola cuenta con un microclima propio, los impactos y las estrategias relevantes dependen de las características locales. Esta comunicación se centra en el cambio climático en la Denominación de Origen Protegida (D.O.P) Cariñena. Los objetivos específicos son: a) conocer de qué manera el cambio climático está afectando a la actividad vitícola en la zona, b) estimar la intensidad con qué lo hará en los próximos años y c) estudiar y comparar los costes de inversión de las principales medidas de adaptación en el viñedo. Los resultados confirman un empeoramiento de las condiciones actuales, una pérdida de potencial vitivinícola a medio plazo y la conveniencia de acometer medidas de adaptación en el corto plazo, que son menos costosas que las de largo plazo.

[ES] El cambio climático es especialmente grave en el sistema agrario, por su dependencia medioambiental. Uno de los sectores más sensibles es el vitivinícola, por la influencia del clima sobre la cantidad y la calidad de la cosecha. Además, afecta a la tipicidad de los vinos de cada zona, lo que preocupa especialmente a las denominaciones de origen, que quizá deban introducir cambios en sus reglas de funcionamiento, con el fin de que los productores puedan adaptarse. En este trabajo se analiza de qué manera afecta el cambio climático al sector vitivinícola en la Denominación de Origen Cariñena, localizada en la provincia de Zaragoza (Aragón), ubicada en pleno valle del Ebro, una zona mediterránea con escasas precipitaciones y temperaturas elevadas en verano. En una primera parte se analizan a) las variaciones ocurridas en los parámetros climáticos de la zona en las últimas décadas, b) los escenarios futuros probables, c) los índices bioclimáticos relacionados con el viñedo y d) los impactos que pueden producirse en el viñedo de la zona, así como las consecuencias sobre la rentabilidad y viabilidad del cultivo. Con la caracterización climática de la zona de estudio, el TFM demuestra que se han producido cambios sustanciales en los últimos 50 años que afectan a la idoneidad del cultivo, como el continuo aumento de la temperatura media, o el descenso de las precipitaciones. De igual manera, todas las proyecciones y escenarios futuros indican que en los próximos años estos cambios seguirán acentuándose, lo que dificultará cada vez más una adecuada adaptación del viñedo. En una segunda parte, al examinar las principales estrategias de adaptación que suponen costes de inversión y cambios de modelo productivo para los viticultores, se concluye que la medida más económica y rápida es el cambio de variedad mediante reinjerto, pero también es la que menor efecto tiene. Por el contrario, la medida con mayor alcance, pero la más costosa y que mayores dificultades conlleva, es la deslocalización del viñedo. Por último, se realiza un análisis de la realidad vitícola de la zona, en el que se comprueba que la percepción que tienen los viticultores sobre el cambio climático está muy influenciada por el modelo vitícola que practican, siendo más sensibles las zonas con viñedos antiguos y sin acceso a recursos hídricos., [EN] Climate change is especially serious in the agricultural system, due to its environmental dependence. One of the most sensitive sectors is the wine sector, due to the influence of the climate on the quantity and quality of the harvest. In addition, it affects the typicity of the wines of each area, which is of particular concern to the denomination of origin, which may have to introduce changes in their rules of operation, so that producers can adapt. The aim of this TFM was to analyse how climate change affects the wine sector in the Cariñena Denomination of Origin, located in the province of Zaragoza (Aragón), in the Ebro Valley, a Mediterranean area with low rainfall and high temperatures in summer. The first part was focused on the analysis of a) the variations that have occurred in the climatic parameters of the area in the last decades, b) the probable future scenarios, c) the bioclimatic indexes related to the vineyard and d) the impacts that can occur in the area¿s vineyards, as well as the consequences on the profitability and viability of the crop. With the climatic characterization of study area, this TFM demonstrates that in the last fifty years there have been important changes which affect the suitability of the crop, such as the increase in the average temperature, or decrease in rainfall. Similary, all future projections indicate in the coming years, these changes will continue to increase, making more difficult the adequate adaptation of the vineyard. In a second part, the main adaptation strategies will be examined, involving investment costs and changes in the production model for wine growers. It is concluded that the cheapest and fastest measure is the change of variety, bus this measure is the one with the least effect. On the contrary, the measure with the greatest scope, but the most expensive and the one that presents the greatest difficulties, is the relocation of the vineyard. Finally, the wine sector reality is analysed to verify if it corresponds to the changes in the environment. It shows that the perception that wine growers have about climate change is highly influenced by the wine model they practice, being areas with older vineyards and without access to irrigation more sensitive.

Women show a lower incidence of cardiovascular diseases than age-matched men, but this benefit disappears after menopause. Oestrogen-mediated vascular actions are mainly attributed to oestradiol and exerted by oestrogen receptors (ERα, ERβ and G protein-coupled oestrogen receptor), through rapid and/or genomic mechanisms, but these effects depend on ageing and inflammation. A cardiovascular approach in women's health has arisen due to controversy regarding oestrogen's beneficial impact as reported in experimental and observational studies and large randomized trials. These can be explained, in part, by two mutually non-exclusive hypotheses. On the one hand, the timing hypothesis, which states that oestrogen-mediated benefits occur before the detrimental effects of ageing are established in the vasculature; on the other hand, ageing and/or hormonal-associated changes in ER expression that could lead to a deleterious imbalance in favour of ERβ over ERα, generally associated with higher inflammation and endothelial dysfunction. In experimental studies, oestradiol acting on ERα promotes the release of vasoactive compounds such as nitric oxide (NO) and prostacyclin, and shifts the angiotensin axis towards angiotensin 1-7 production. Mechanisms underlying oestradiol vascular function also include anti-inflammatory and epigenetic modifications. 17β-Oestradiol changes the transcriptomic profile of endothelial cells, and the involvement of miRNA in the regulatory pathways of vascular function reinforces assumptions regarding the vascular actions of oestrogen. Thus, the present Symposium Review aims to postulate the role of ERα in oestrogen modulation of endothelium-derived mediators and vascular physiology, as well as its relationship with miRNA and inflammation, and elucidate how physiological changes in postmenopausal women counteract the observed effects.

Aims Endothelial progenitor cells (EPC) play a role in endothelium integrity maintenance and regeneration. Decreased numbers of EPC or their impaired function correlates with an increase in cardiovascular events. Thus, EPC are important predictors of cardiovascular mortality and morbidity. Microparticles carrying Sonic hedgehog (Shh) morphogen (MPShh+) trigger pro-angiogenic responses, both in endothelial cells and in ischaemic rodent models. Here, we propose that MPShh+ regulates EPC function, thus enhancing vasculogenesis, and correcting the defects in dysfunctional EPC obtained from acute myocardial infarction (AMI) patients. Methods and results The mechanisms underlying Shh pathway function and nitric oxide (NO) production in EPC were evaluated. MPShh+ increased both the in vitro and in vivo vasculogenic capacity of EPC isolated from adult human peripheral blood samples. MPShh+ treatment significantly increased the expression of Shh signalling pathway genes (PTCH1, SMO, and GLI1) and masters of pro-angiogenic genes (NOS3, VEGFA, KDR, and KLF2) in EPC. Moreover, MPShh+ increased both the protein expression and activity of eNOS, resulting in increased NO production. Most importantly, MPShh+ improved the vasculogenic capacity of EPC from AMI patients to levels similar to that of EPC from healthy patients. All these effects were due to the activation of Shh pathway. Conclusion MPShh+ increase both the vasculogenesis of EPC and their capacity to produce NO, including EPC from patients who have recently suffered an AMI. This study emphasizes MPShh+ and EPC as potential therapeutic tools for improving vascular regeneration as a treatment for cardiovascular ischaemic disease.

Endothelial progenitor cells (EPC) play a role in endothelium integrity maintenance and regeneration. Decreased numbers of EPC or their impaired function correlates with an increase in cardiovascular events. Thus, EPC are important predictors of cardiovascular mortality and morbidity. Microparticles carrying Sonic hedgehog (Shh) morphogen (MPShhþ) trigger pro-angiogenic responses, both in endothelial cells and in ischaemic rodent models. Here, we propose that MPShhþ regulates EPC function, thus enhancing vasculogenesis, and correcting the defects in dysfunctional EPC obtained from acute myocardial infarction (AMI) patients.

Las enfermedades cardiovasculares, en concreto el síndrome coronario agudo (SCA), son la principal causa de muerte en hombres y mujeres en todo el mundo. El SCA es la manifestación clínica de la isquemia miocárdica, producida por la reducción del aporte sanguíneo al miocardio como consecuencia de una disminución del calibre de las arterias coronarias. La enfermedad subyacente al SCA más frecuente es la aterosclerosis, un proceso inflamatorio iniciado por la acumulación de lipoproteínas de baja densidad (LDL) en el espacio subendotelial en arterias de mediano y gran calibre a lo largo del sistema cardiovascular. El primer cambio funcional detectable en la lesión aterosclerótica es la disfunción endotelial provocada por la modificación mediante oxidación y agregación de las LDL que estimulan una respuesta inmune innata y adaptativa, dando lugar a la activación del endotelio. El endotelio activado induce la expresión de moléculas de adhesión y quimioquinas, dando lugar a la adhesión de monocitos y a su migración a través de la pared vascular, donde se diferencian a macrófagos y células dendríticas. Conforme avanza el proceso inflamatorio, se genera una capa fibrosa, cuya rotura es la causa más frecuente de trombosis coronaria. El trombo puede ocluir parcial o totalmente la arteria coronaria, dando lugar a la isquemia miocárdica y necrosis del tejido perfundido por esa arteria. Como consecuencia de esta necrosis, se desencadena una respuesta inflamatoria sistémica inicial que posteriormente es suprimida, en parte, por citoquinas antiinflamatorias, dando lugar a la transición desde la inflamación a la reparación cardiaca. Por tanto, la inflamación ejerce un papel central en la fisiopatología del SCA. La sintomatología clínica no permite una diferenciación precisa de los diferentes síndromes, por lo que es imprescindible la realización de un electrocardiograma (ECG), cuyos resultados permiten agrupar a los pacientes con SCA en dos grandes grupos: infarto agudo de miocardio con elevación del segmento ST (IAMCEST) y aquellos que no presentan una elevación del ST (SCA sin elevación del segmento ST, SCASEST). Éste último término (SCASEST) hace referencia tanto al infarto agudo de miocardio sin elevación del ST (IAMSEST) como a la angina inestable. La necrosis de cardiomiocitos asociada al daño cardiaco provocado por el SCA da lugar a la liberación de proteínas a la circulación, como las troponinas I y T (cTnI y cTnT) que actualmente se utilizan como biomarcadores de necrosis miocárdica de referencia. Por lo tanto, en el diagnóstico de los diferentes síndromes, se complementa el resultado del ECG con la medida plasmática de cTnI o cTnT. De esta manera, los pacientes IAMCEST (elevación del segmento ST y con aumento de troponinas cardiacas) son diagnosticados con certeza y precocidad. La medida de las troponinas cardiacas es asimismo un aspecto importante en el diagnóstico de los pacientes IAMSEST, ya que no muestran una elevación del ST pero sí una elevación de troponinas en sangre. Sin embargo, su uso en el diagnóstico de pacientes con angina inestable no está tan claro, ya que no muestran elevación del ST y tampoco un aumento de troponinas dificultando un diagnóstico temprano. Es probable que el tejido cardiaco dañado genere una liberación de RNA no codificantes (ncRNA), entre ellos microRNA (miRNA), similar a la liberación de troponinas cardiacas. Los miRNA son pequeñas moléculas monocatenarias (19-23 nt) de RNA no codificante que desempeñan importantes funciones en la regulación postranscripcional de la expresión génica. El interés actual en los miRNA circulantes radica en la posibilidad de utilizarlos como biomarcadores clínicos para distintas enfermedades, entre ellas las cardiovasculares. Sin embargo, la falta de estandarización de los métodos pre-analíticos y analíticos, ha derivado en la imposibilidad de comparar los diferentes estudios publicados. El resultado de estas dificultades metodológicas es la falta de consenso sobre el potencial de los miRNA como biomarcadores de SCA. El suero y el plasma son los tipos de muestra más frecuentemente utilizados en los estudios de expresión de miRNA circulantes. Sin embargo, el tipo de muestra de partida podría ser una fuente de variación en el análisis del perfil de miRNA circulantes en SCA. Por ello, el primer objetivo de este estudio ha sido determinar las diferencias en la concentración de miRNA en suero y plasma y si bien, la fracción de miRNA entre suero y plasma era similar, los pacientes con SCASEST presentaron concentraciones de miRNA más elevadas que las muestras de sujetos sanos. Entre las dificultades metodológicas del análisis de la expresión de miRNA circulantes mediante qRT-PCR también se encuentra la normalización de los valores de expresión. Por ello, para seleccionar un control endógeno adecuado para nuestros estudios de qRT-PCR en muestras de suero y plasma de pacientes con SCASEST e individuos sanos, analizamos la expresión de los miRNA circulantes utilizados como controles endógenos en diferentes estudios. El miR-484 resultó ser el miRNA que, además de no mostrar diferencias significativas entre suero y plasma en nuestra muestra, tampoco mostró diferencias en los coeficientes de variación. Por lo tanto, los valores de expresión de los miRNA de este estudio fueron normalizados tomando como referencia la expresión de miR-484. Por otra parte, suero o plasma podrían influir en el nivel de expresión de miRNA circulantes en pacientes con SCA y para determinarlo, analizamos la expresión de miRNA que previamente habían sido descritos como posibles biomarcadores de SCA. De hecho, el patrón de expresión de los miRNA resultó ser diferente en suero y plasma y también se observaron diferencias en la variabilidad de expresión. El suero ofreció una mayor sensibilidad en la detección de miRNA y una menor variabilidad en la expresión, sugiriendo que el tipo de muestra más adecuado para realizar estudios de miRNA circulantes en pacientes con SCA es el suero. La desregulación de la biogénesis de miRNA se ha asociado a diversas enfermedades cardiovasculares. Numerosos estudios han descrito diferentes patrones de expresión de miRNA en el SCA, especialmente en pacientes IAMCEST, sugiriendo su posible uso como herramientas moleculares para su diagnóstico y pronóstico. Sin embargo, debido a la mayor incertidumbre a la hora de diagnosticar pacientes con SCASEST (IAMSEST y angina inestable), el análisis del patrón de expresión de miRNA circulantes en este tipo de pacientes sería de especial interés, siguiente objetivo de este estudio. Para ello, mediante arrays de expresión analizamos el perfil de miRNA de pacientes con SCASEST en su manifestación aguda y también después de un año de evolución clínica, para determinar los miRNA relacionados directamente con el momento agudo del infarto. Se observó una desregulación de 54 miRNA en el momento agudo del SCA, de los que 10 aumentaron y 44 disminuyeron su expresión. Después de un año de evolución clínica, había 42 miRNA desregulados, de los que 35 aumentaron y 7 disminuyeron su expresión. Con la finalidad de identificar los miRNA que podrían estar relacionados con el momento agudo del infarto, se seleccionaron del array aquellos miRNA cuya expresión variaba en la manifestación aguda del SCA y revertía a niveles control después de un año de evolución clínica. Estos miRNA se comprobaron posteriormente en una población de SCASEST más amplia y se confirmó la desregulación de la expresión de let-7e, miR-28, miR-130b, miR-523, miR-874, miR-92a, miR-26a y miR-320b en suero de pacientes con SCASEST en su manifestación aguda. De ellos, la expresión de let-7e y miR-26a revirtió hasta niveles control tras un año de evolución clínica. El miRNA let-7e forma parte del cluster miR-99b/let-7e/miR-125a y para comprobar si estos miRNA se comportaban de manera coordinada, también analizamos la expresión de miR-99b y miR-125a. Al igual que let-7e, la expresión de miR-99b y miR-125a disminuyó en suero de pacientes con SCASEST en su manifestación aguda, revirtiendo a niveles control después de un año de evolución clínica. La comunicación intercelular a través de miRNA circulantes es especialmente importante para las células endoteliales, donde se ha descrito una alta expresión del cluster miR-99b/let-7e/miR-125a. Sin embargo, se desconoce su papel en la biología vascular. Por ello, después de comprobar los niveles circulantes del cluster miR-99b/let-7e/miR-125a en pacientes con SCASEST, estudiamos su implicación en la modulación de la función endotelial en cultivo celular. Para ello, utilizando células endoteliales de vena umbilical humana, HUVEC, se realizaron transfecciones con inhibidores y mímicos de los 3 miRNA del cluster, analizando su capacidad funcional mediante estudios de adhesión, proliferación y vasculogénesis. Sólo el let-7e y miR-125a tuvieron efectos sobre la función endotelial. Las células transfectadas con el mímico de let-7e incrementan su capacidad de adhesión y con el inhibidor de let-7e aumentan la vasculogénesis, mientras que la transfección celular con el inhibidor de miR-125a disminuye la proliferación celular. También se ha demostrado la contribución de los miRNA en gran variedad de procesos biológicos incluyendo la disfunción endotelial y la inflamación vascular, y la inflamación tiene un papel destacado en la patogénesis del SCA. Un mediador clave de la inflamación es el factor de transcripción nuclear NF-κB, el cual se activa en respuesta a estímulos inflamatorios e induce la expresión de genes inflamatorios como moléculas de adhesión y citoquinas proinflamatorias. La activación de NF-κB también regula la expresión de miRNA que a su vez pueden controlar la inflamación regulando esta vía de señalización. Además, los miRNA pueden regular postranscripcionalmente factores inflamatorios como citoquinas o moléculas de adhesión tanto de forma directa como indirecta. Para determinar si la expresión de miRNA circulantes relacionados con el SCA estaban asociados a los niveles de citoquinas pro y antiinflamatorias y de quimioquinas implicadas en la patología del SCA se realizó un análisis de correlación en todos los individuos del estudio. Como resultado, la expresión de todos los miRNA previamente relacionados con la manifestación aguda del SCA, excepto el miR-125a, mostraron una asociación con los niveles de citoquinas y quimioquinas implicadas en la patología del SCA. Los resultados obtenidos en la presente tesis destacan la importancia del tipo de muestra de partida al analizar la expresión de miRNA circulantes y se sugiere el suero como la muestra adecuada en pacientes con SCA, así como el miR-484 como control endógeno. Por primera vez se analiza el perfil de expresión de miRNA circulantes en pacientes con SCASEST en su manifestación aguda y después de un año de evolución clínica y se han identificado varios miRNA circulantes que podrían actuar como posibles biomarcadores de SCASEST. Entre ellos, dos de los componentes del cluster miR-99b/let-7e/miR-125a también se han visto implicados en la modulación de la función endotelial. Finalmente, la asociación existente entre la expresión de los miRNA relacionados con el SCASEST y los niveles séricos de citoquinas y quimioquinas implicadas en la patología del SCA, refuerza su posible uso como biomarcadores de SCASEST. Cardiovascular diseases, specifically acute coronary syndrome (ACS), are the leading cause of death in the world for both men and women. ACS is the clinical manifestation of myocardial ischemia, caused by myocardial blood flow decrease as a result of reduced coronary artery size. Atherosclerosis is the most common underlying disease of ACS, an inflammatory disease primarily driven by low density lipoprotein (LDL) accumulation in the subendothelial layer of large and medium-sized arteries along the cardiovascular system. Endothelial dysfunction appears as the first functional change in atherosclerotic lesions, due to LDL modification and aggregation, and the resulting stimulation of the innate and adaptive immune response, giving rise to endothelial activation. Vascular endothelial cell activation induces cell adhesion molecule and chemokine expression, leading to monocyte adhesion and transmigration across the vascular wall, where monocytes differentiate into macrophages and dendritic cells. Both cell types can serve as deposits of lipids and become foam cells. As the inflammatory process advances, a fibrous cap is formed, whose rupture is the most frequent cause of thrombosis. The thrombus may partially or totally occlude the coronary artery, resulting in myocardial ischemia and necrosis. As a consequence, a systemic inflammatory response is triggered and subsequently partially suppressed by anti-inflammatory cytokines, resulting in a transition from inflammation toward cardiac repair. Therefore, inflammation has a central role in ACS pathophysiology. Clinical symptoms caused by ACS do not permit an accurate differentiation between distinct syndromes, making essential to get an electrocardiogram (ECG). Patients with ACS are divided into two major categories based on the ECG results: ST-segment elevation myocardial infarction (STEMI) patients and non-ST-segment elevation ACS (NSTE-ACS). The latter term (NSTE-ACS) encompasses both non-ST elevation myocardial infarction (NSTEMI) and unstable angina. Cardiomyocyte necrosis is associated to myocardial damage caused by ACS, leading to a protein release into the circulation such as cardiac troponin I and T (cTnI and cTnT), biomarkers of myocardial necrosis currently used. Thus, ACS diagnosis requires the ECG result in conjunction with the traditional markers cTnI or cTnT. STEMI patients (ST elevation and troponin-positive) are diagnosed, therefore, in an early and more accurate manner. The measurement of cardiac troponins is also an important aspect for the diagnosis of NSTEMI (non-ST elevation and troponin-positive). However, the diagnosis of unstable angina patients is hampered because they are negative to cardiac troponin and present non-ST elevation. It is likely that the damaged heart tissue causes a release of non-coding RNAs (ncRNAs), including microRNAs (miRNAs), analogous to the release of cardiac troponins. miRNAs are small single-stranded molecules (19-23 nt) that functions as important post-transcriptional regulators of gene expression. The increasingly recent interest in circulating miRNAs lies in their potential use as clinical biomarkers for multiple diseases, especially cardiovascular diseases. However, the lack of a methodological standardization has led to the inability of comparison between different studies. These methodological issues result in a lack of consensus about the potential use of miRNAs as ACS biomarkers. Serum and plasma are the most widely used type of sample in studies of circulating miRNA expression. Nevertheless, the sample of choice could be a source of variation and influence the analysis of circulating miRNA expression in ACS. For that reason, we initially determined the differences in miRNA enrichment and yield in serum and plasma, and while no differences were found when miRNA fraction between serum and plasma were compared, the miRNA concentration in both sample types in NSTE-ACS patients was higher than in healthy subjects. Among the methodological challenges in analyzing miRNA expression by qRT-PCR is data normalization. In this regard, we examined the most frequently used miRNA as endogenous controls, to stablish an appropriate endogenous control to be used in the qRT-PCR studies performed in both serum and plasma of NSTE-ACS patients and healthy subjects. miR-484 showed no significant differences between means and coefficients of variation in both serum and plasma. Therefore, in this study the values of miRNAs were normalized to the expression of miR-484. On the other hand, to determine the influence of serum and plasma on circulating miRNA profile expression in NSTE-ACS patients, we analyzed the expression of the most described miRNAs as potential biomarkers of ACS. Indeed, serum and plasma showed a different miRNA expression pattern and a significant difference in variance was also found. Serum demonstrated a higher sensitivity and lower variability in miRNA expression, suggesting that serum may be the appropriate sample type in circulating miRNA studies. Dysregulation of miRNA biogenesis has been associated with many cardiovascular diseases. Several studies have shown different circulating miRNA profile expression in ACS, particularly in STEMI patients, suggesting their potential use as a molecular tool for the diagnosis and prognosis of ACS. However, the analysis of the miRNA profile expression would be of particular interest in NSTE-ACS patients (NSTEMI and instable angina) because of the higher uncertainty in the diagnosis, and thus it was the following aim of this study. For that purpose, we assessed the miRNA expression in patients with acute manifestation of NSTE-ACS and one-year follow-up, to select the miRNAs related to ACS. 54 miRNAs were dysregulated in ACS, including 10 up-regulated and 44 down-regulated miRNAs. After one-year follow-up, 42 miRNAs were dysregulated, including 35 up-regulated and 7 down-regulated miRNAs. In order to identify miRNAs involved with acute manifestation of ACS, we selected those miRNAs dysregulated in NSTE-ACS patients whose expression reverted to control levels after one-year follow-up. Changes in miRNA expression of let-7e, miR-28, miR-130b, miR-523, miR-874, miR-92a, miR-26a and miR-320b were then confirmed in serum of a larger number of NSTE-ACS patients. Among then, let-7e and miR-26a expression was reverted to control levels after one-year follow-up. Let-7e miRNA is a member of miR-99b/let-7e/miR-125a cluster, so in order to assess if the cluster is expressed coordinately, we also determined miR-99b and miR-125a expression. miR-99b and miR-125a were down-regulated in NSTE-ACS patients in the same way that let-7e, reversing to control levels after one-year follow-up. Intercellular communication involving circulating miRNAs is especially relevant to endothelial cells, where the cluster miR-99b/let-7e/miR-125a is highly expressed. However, its role in vascular biology is unknown. In this regard, after confirming the cluster miR-99b/let-7e/miR-125a expression in NSTE-ACS patients, we studied its involvement in endothelial function. We cultured human umbilical vein endothelial cells, HUVEC, and we analyze the adhesion, proliferation and vasculogenesis capacity of cells transfected with miRNA inhibitors and mimics of the cluster constituents, assessing the endothelial function. Endothelial function was only affected by let-7e and miR-125a transfection. HUVEC transfected with let-7e mimic and let-7e inhibitor show an increased adhesion capacity and an increased vasculogenesis capacity, respectively, whereas miR-125a transfection decrease HUVEC proliferation. Great diversity of biological processes has been demonstrated to be affected by miRNAs, including endothelial dysfunction and vascular inflammation, and inflammation has a leading role in ACS pathogenesis. The NF-κB transcription factor is a key mediator of inflammation, being activated in response to inflammatory stimulus, and leading to the induction of adhesion molecule and proinflammatory cytokine expression. NF-B activation also regulates miRNA expression, which in turn can regulate inflammation through modulation of NF-κB signaling pathway. miRNAs can also directly and indirectly control cytokine and adhesion molecule expression in a post transcriptional manner. To determine the association between circulating miRNAs related to ACS and pro and anti-inflammatory cytokine levels involved in ACS, we performed a correlation analysis considering all the participants in the study. As a result, miRNA expression of every miRNA previously selected regarding to ACS manifestation, excluding miR-125a, was related to the levels of cytokine and chemokine implicated in ACS. In conclusion, our results highlight the importance of the sample of choice for detecting circulating miRNA expression, suggesting that serum may be the appropriate sample type and miR-484 could be used as reference gene in circulating miRNA studies of NSTE-ACS. The obtained results provide for the first time the circulating miRNA profile in NSTE-ACS patients at acute manifestation and after one-year follow-up, identifying several miRNAs as potential biomarkers of NSTE-ACS. Among them, two components of miR-99b/let-7e/miR-125a cluster has been implicated in the modulation of endothelial function. Finally, the association between the expression of miRNAs related to NSTE-ACS and cytokine and chemokine serum levels involved in ACS enhance the potential use of miRNAs as NSTE-ACS biomarkers.

Cardiovascular diseases are a worldwide health problem and are the leading cause of mortality in developed countries. Together with experimental data, the lower incidence of cardiovascular diseases in women than in men of reproductive age points to the influence of sex hormones at the cardiovascular level and suggests that estrogens play a protective role against cardiovascular disease and that this role is also modified by ageing. Estrogens affect cardiovascular function via their specific estrogen receptors to trigger gene expression changes at the transcriptional level. In addition, emerging studies have proposed a role for microRNAs in the vascular effects mediated by estrogens. miRNAs regulate gene expression by repressing translational processes and have been estimated to be involved in the regulation of approximately 30% of all protein-coding genes in mammals. In this review, we highlight the current knowledge of the role of estrogen-sensitive miRNAs, and their influence in regulating vascular ageing.

The beneficial effects of estrogen on the cardiovascular system have been reported extensively. In fact, the incidence of cardiovascular diseases in women is lower than in age-matched men during their fertile stage of life, a benefit that disappears after menopause. These sex-related differences point to sexual hormones, mainly estrogen, as possible cardiovascular protective factors. The regulation of vascular function by estrogen is mainly related to the maintenance of normal endothelial function and is mediated by both direct and indirect gene transcription through the activity of specific estrogen receptors. Some of these mechanisms are known, but many remain to be elucidated. In recent years, microRNAs have been established as non-coding RNAs that regulate the expression of a high percentage of protein-coding genes in mammals and are related to the correct function of human physiology. Moreover, within the cardiovascular system, miRNAs have been related to physiological and pathological conditions. In this review, we address what is known about the role of estrogen-regulated miRNAs and their emerging involvement in vascular biology.

Cardiovascular diseases are a worldwide health problem and are the leading cause of mortality in developed countries. Together with experimental data, the lower incidence of cardiovascular diseases in women than in men of reproductive age points to the influence of sex hormones at the cardiovascular level and suggests that estrogens play a protective role against cardiovascular disease and that this role is also modified by ageing. Estrogens affect cardiovascular function via their specific estrogen receptors to trigger gene expression changes at the transcriptional level. In addition, emerging studies have proposed a role for microRNAs in the vascular effects mediated by estrogens. miRNAs regulate gene expression by repressing translational processes and have been estimated to be involved in the regulation of approximately 30% of all protein-coding genes in mammals. In this review, we highlight the current knowledge of the role of estrogen-sensitive miRNAs, and their influence in regulating vascular ageing.

The Mas receptor is involved in the angiotensin (Ang)-(1-7) vasodilatory actions by increasing nitric oxide production (NO). We have previously demonstrated an increased production of Ang-(1-7) in human umbilical vein endothelial cells (HUVEC) exposed to estradiol (E2), suggesting a potential cross-talk between E2 and the Ang-(1-7)/Mas receptor axis. Here, we explored whether the vasoactive response and NO-related signalling exerted by E2 are influenced by Mas. HUVEC were exposed to 10nM E2 for 24h in the presence or absence of the selective Mas receptor antagonist A779, and the estrogen receptor (ER) antagonist ICI182780 (ICI). E2 increased Akt and endothelial nitric oxide synthase (eNOS) mRNA and protein expression, measured by RT-PCR and Western blot, respectively. Furthermore, E2 increased Akt activity (determined by the levels of phospho-Ser473) and eNOS activity (by the enhanced phosphorylation of Ser1177, the activated form), resulting in increased NO production, which was measured by the fluorescence probe DAF-2-FM. These signalling events were dependent on ER and Mas receptor activation, since they were abolished in the presence of ICI or A779. In ex-vivo functional experiments performed with a small-vessel myograph in isolated mesenteric vessels from wild-type mice pre-contracted with noradrenaline, the relaxant response to physiological concentrations of E2 was blocked by ICI and A779, to the same extent to that obtained in the vessels isolated from Mas-deficient. In conclusion, E2 induces NO production and vasodilation through mechanisms that require Mas receptor activation.