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Orientador : Laura Sterian Ward Dissertação (mestrado) - Universidade Estadual de Campinas, Faculdade de Ciências Médicas Resumo: A susceptibilidade a carcinógenos químicos tem um importante papel no desenvolvimento da maioria dos cânceres. Diversos polimorfismos de enzimas metabolizadoras de drogas em humanos influenciam esta susceptibilidade individual. Os genes que incluem as isoenzimas do sistema glutationa s-transferase (GST) apresentam um polimorfismo hereditário. Os genes GST mu 1 (GSTM1) and GST theta 1(GSTT1) possuem uma variante alélica nula nos quais o gene inteiro está ausente e, portanto, não existe codificação ou produção da respectiva enzima. O genótipo nulo para ambas enzimas foi associado com diferentes tipos de cânceres. Para observar a influência da herança dessas enzimas no risco do câncer da tiróide, utilizamos uma multiplex-PCR que inclui o gene p-globina como um controle de DNA na reação de PCR para comparar 300 indivíduos normais de nossa população com 116 pacientes portadores de lesões tiroidianas. Desses casos, 49 eram de bócio benigno e 67 de doenças malignas: 50 carcinomas papilíferos e 17 carcinomas foliculares. A comparação entre tecidos de tumores da tiróide e 35 amostras correspondentes de sangue periférico de pacientes com câncer demonstraram padrão idêntico, sugerindo que o sistema GST não está envolvido no processo de desdiferenciação folicular. Não houve diferença estatística entre a prevalência da deleção dos genes GSTT1 e GSTM1 em indivíduos normais e em pacientes com bócio. Entretanto, os pacientes com carcinoma papilífero (10%) e pacientes com carcinoma folicular (17%) apresentaram uma prevalência de genótipo nulo mais elevada do que os indivíduos da população normal (5%) (p= 0,0479). Demonstramos que a herança de um genótipo nulo combinado para GSTM1 e GSTT1 é responsável por um aumento de 2.6 vezes no risco de câncer. Sugerimos que estes resultados podem ser usados como marcadores na susceptibilidade ao câncer da tiróide, auxiliando na seleção dos indivíduos de risco que merecem investigação e conduta mais rigorosa de seus bócios Abstract: Susceptibility to chemical carcinogens plays an important role in the development of most cancers. Several polymorphisms of human drug-metabolizing enzymes influence this individual susceptibility. The genes that encode the isoenzymes of the glutathione s-transferase (GST) system present a polymorphic inheritance. The GST mu 1 (GSTMl) and GST theta 1(GSTTl) genes have a null allele variant in which the entire gene is absent. The null genotype for both enzymes has been associated with many different types of tumors. In order to look for the influence ofthe inheritance pattern of these enzymes on thyroid cancer risk we used a triplex PCRi that included p-globin gene as a DNA quality control in the PCR reaction to compare 300 normal individuaIs of our population to 116 goiter patients. There were 49 cases of benign goiters and 67 cases of malignant diseases: 50 papillary and 17 follicular carcinomas. Comparison between thyroid tumor specimens and normal corresponding samples of 35 cancer patients demonstrated identical patterns, suggesting that the GST system is not involved in the process of follicular dedifferentiation. There was no statistical difference between the prevalence ofthe deleted alleles in the normal individuaIs and in the goiter patients. However, papillary carcinoma patients (10%) and follieular carcinoma patients (17%) presented a higher prevaIenee of the null genotype than the normal population individuaIs (5%) (p= 0,0479). We found a 2.6 increased risk of thyroid caneer associated with the GSTT1 and GSTMl combined null inheritance, suggesting that this may be a usefuI marker for thyroid caneer susceptibility Mestrado Ciências Básicas Mestre em Clínica Médica

Agradecimentos: The present work was supported by the Brazilian funding agencies: Fundacao de Amparo a Pesquisa do Estado de Sao Paulo (FAPESP), Fundacao de Amparo a Pesquisa do Estado de Minas Gerais (FAPEMIG), Coordenacao de Aperfeicoamento de Pessoal de N?vel Superior (CAPES) and Conselho Nacional de Desenvolvimento Cient?fico e Tecnologico (CNPq). We thank Dr Jose Vassallo (A.C. Camargo) for performing IHC analysis, and the A. C. Camargo Hospital for providing tissue microarrays Abstract: This study aimed to identify novel biomarkers for thyroid carcinoma diagnosis and prognosis. We have constructed a human single-chain variable fragment (scFv) antibody library that was selected against tumour thyroid cells using the BRASIL method (biopanning and rapid analysis of selective interactive ligands) and phage display technology. One highly reactive clone, scFv-C1, with specific binding to papillary thyroid tumour proteins was confirmed by ELISA, which was further tested against a tissue microarray that comprised of 229 thyroid tissues, including: 110 carcinomas (38 papillary thyroid carcinomas (PTCs), 42 follicular carcinomas, 30 follicular variants of PTC), 18 normal thyroid tissues, 49 nodular goitres (NG) and 52 follicular adenomas. The scFv-C1 was able to distinguish carcinomas from benign lesions (P=0.0001) and reacted preferentially against T1 and T2 tumour stages (P=0.0108). We have further identified an OTU domain-containing protein 1, DUBA-7 deubiquitinating enzyme as the scFv-binding antigen using two-dimensional polyacrylamide gel electrophoresis and mass spectrometry. The strategy of screening and identifying a cell-surface-binding antibody against thyroid tissues was highly effective and resulted in a useful biomarker that recognises malignancy among thyroid nodules and may help identify lower-risk cases that can benefit from less-aggressive management CONSELHO NACIONAL DE DESENVOLVIMENTO CIENTÍFICO E TECNOLÓGICO - CNPQ COORDENAÇÃO DE APERFEIÇOAMENTO DE PESSOAL DE NÍVEL SUPERIOR - CAPES FUNDAÇÃO DE AMPARO À PESQUISA DO ESTADO DE MINAS GERAIS - FAPEMIG FUNDAÇÃO DE AMPARO À PESQUISA DO ESTADO DE SÃO PAULO - FAPESP Fechado

Orientadores: Laura Sterian Ward, Antônio Hugo José Fróes Marques Campos Dissertação (mestrado) - Universidade Estadual de Campinas, Faculdade de Ciências Médicas Resumo: Marcadores de malignidade, especialmente capazes de distinguir lesões de padrão folicular, que sejam de fácil implantação na rotina do diagnóstico de nódulos tireoidianos, continuam sendo extremamente necessários, dado o crescente aumento de nódulos tireoidianos diagnosticados nos últimos anos. A via HGF/c-Met/STAT3 está relacionada com desenvolvimento e progressão tumoral, sendo que a expressão de c-Met, HGF e de STAT3 foram descritas em grande parte dos carcinomas papilíferos de tireoide (CPT), mas não em tecido tireoidiano normal, sugerindo sua relação com o desenvolvimento e progressão do CPT. Para avaliar a utilidade da expressão proteica de c-Met, HGF, STAT3, e de sua proteína fosforilada (pSTAT3) no diagnóstico e no prognóstico de pacientes com nódulos tireoidianos, analisamos 356 tecidos tireoidianos, sendo 153 carcinomas papilíferos (CPT), dos quais 95 eram clássicos (CPC), 47 carcinomas papilíferos variante folicular (CPVF), e 11 carcinomas papilíferos de células altas (CPCA); 34 carcinomas foliculares (CFT), 34 adenomas foliculares (AF), 124 bócios e 11 tecidos normais. Todos os pacientes foram tratados e acompanhados de acordo com um mesmo protocolo padrão por 1-10 anos (Mo=5 anos). Áreas representativas do tecido foram selecionadas para a construção de uma lâmina de tissue microarray (TMA) que foi submetida à técnica de imunoistoquímica e analisada pelo score de Allred. A expressão citoplasmática de c-Met foi capaz de diferenciar nódulos malignos de benignos (p

Orientadores: Laura Sterian Ward, Márcio José da Silva Dissertação (mestrado) - Universidade Estadual de Campinas, Faculdade de Ciências Médicas Resumo: Nódulos de tireoide, benignos e malignos, tem se tornado cada vez mais frequentes, obrigando a busca de marcadores de diagnóstico e prognóstico. Três fatores de transcrição tireoide-específicos estão envolvidos na manutenção do estado diferenciado da glândula e em sua carcinogênese: TTF-1, FOXE1 e PAX8. Os níveis de expressão destes genes estão relacionados com o grau de diferenciação tecidual em tumores tireoidianos. O repressor transcricional DREAM também está envolvido na expressão gênica tireoide-específica através da interação com o gene da tireoglobulina e com os fatores de transcrição TTF-1, FOXE1 e PAX8. O aumento da expressão de DREAM na tireoide está relacionado com o aumento da glândula e desenvolvimento nodular. O objetivo do presente estudo foi analisar a expressão dos genes TTF-1, FOXE1, PAX8 e DREAM em tecidos tumorais benignos e malignos da tireoide, além de identificar possíveis mutações no gene DREAM em pacientes com nódulos tireoidianos. Para tanto foram coletadas 200 amostras de tecido nodular, sendo 50 adenomas foliculares (AF), 49 bócios nodulares, 63 carcinomas papilíferos clássicos (CPTC), 36 carcinomas papilíferos de variante folicular (CPTVF). Todos os pacientes foram submetidos a um mesmo protocolo padrão e acompanhados por 12-87 meses (38 ± 17 meses). Foram extraídos DNA e RNA de todas as amostras. A análise de expressão foi realizada por qPCR e a detecção de mutações no gene DREAM foi feita por sequenciamento automático. Os dados obtidos foram relacionados com dados clínicos e de evolução dos pacientes. Demonstramos que, embora a expressão de TTF-1 tenha sido similar entre os diferentes nódulos analisados (p=0.7056), FOXE1 (pA está localizada na região promotora e foi encontrada em apenas um paciente. As alterações IVS2-131C>T e IVS3+17T>C foram encontradas em regiões intrônicas (intron 1 e 3 respectivamente) em um paciente cada. As alterações IVS1+41C>G, IVS3+10G>C e IVS8-118C>T foram encontradas em vários pacientes por se tratarem de polimorfismos já descritos (rs2248415, rs117109173 e rs58372613 respectivamente). As frequências alélicas e genotípicas das alterações não se associaram as características clínicas, de agressividade ou evolução. Concluímos que a expressão dos genes FOXE1, PAX8 e DREAM pode auxiliar o diagnóstico de malignidade e a diferenciação de lesões tireoidianas, mas não possui utilidade como marcador de prognóstico. Além disso, mutações e polimorfismos do gene DREAM em pacientes com nódulos tireoidianos não possuem clínica como biomarcadores de diagnóstico ou prognóstico do CT Abstract: Thyroid nodules, benign and malignant, have become increasingly frequent, impelling the search for markers for their diagnosis and prognosis. Three thyroid-specific transcription factors are involved in maintaining the differentiation of the gland and its carcinogenesis: TTF-1, FOXE1 and PAX8. The expression levels of these genes are related to the degree of tissue differentiation in thyroid tumors. The transcriptional repressor DREAM is also involved in thyroid-specific gene expression through interaction with the thyroglobulin gene and the transcription factors TTF-1, FOXE1 and PAX8. An increased expression of DREAM was related to the thyroid enlargement and nodular development. The purpose of this study was to analyze the expression of TTF-1, FOXE1, PAX8 and DREAM genes in benign and malignant thyroid tumor tissues and identify possible mutations in the DREAM gene in patients with thyroid nodules. For that purpose, we collected 200 thyroid nodules samples: 50 follicular adenomas (FA), 49 nodular goiters, 63 classic papillary carcinomas (CPTC), 36 follicular variant of papillary thyroid carcinomas (FVPTC). All patients were submitted to the same standard treatment protocol and followed by 12-87 months (38 ± 17 months). Gene expression analysis was performed by real time PCR and we performed automatic sequencing in order to detect mutations of DREAM gene. The data obtained were correlated to clinical and pathological features and to patients¿ outcomes. We demonstrated that FOXE1 (p A is located in the promoter region of the gene and was found in one patient. The alterations IVS2-131C>T and IVS3+17T> C were found in intronic regions (introns 1 and 3 respectively), each in one patient. The alterations IVS1+41C>G, IVS3+10G>C and IVS8-118C>T, corresponding to already described polymorphisms (rs2248415, rs58372613 and rs117109173 respectively), were found in several patients. Allelic and genotypic frequencies of the alterations were not associated with any clinical or pathological feature of aggressiveness or with outcome. We conclude that the expression of FOXE1, PAX8 and DREAM may help diagnose thyroid nodules, identifying malignancy and characterizing follicular-patterned thyroid lesions, but is not useful as a prognostic marker. In addition, mutations and polymorphisms in non-coding regions of the DREAM gene in patients with thyroid nodules are not associated with clinical features, not having utility as diagnostic or prognosis biomarkers for TC Mestrado Clínica Médica Mestre em Ciências FAPESP