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Summary Keyhole limpet hemocyanin (KLH) is a glycosylated multi-subunit metalloprotein that elicits a strong nonspecific immune activation, thus inducing both cellular and humoral immune responses. The exceptional immunogenicity of this protein can be leveraged to vaccinate mice against self-antigens that otherwise would not induce an autoimmune response. This protocol describes the covalent conjugation of KLH with acyl-coenzyme A-binding protein (ACBP), the autovaccination of mice with ACBP-KLH conjugate together with a potent adjuvant, and the detection of the produced anti-ACBP autoantibodies. For complete details on the use and execution of this profile, please refer to Bravo-San Pedro et al. (2019c)., Graphical abstract, Highlights • ACBP can be glutaraldehyde-conjugated to the large immunogenic protein KLH • When coinjected with adjuvant, KLH-ACBP elicits autoantibodies against ACBP • Circulating ACBP protein can be quantified by a specific ELISA • Bioavailable ACBP decreases after successful autovaccination, Keyhole limpet hemocyanin (KLH) is a glycosylated multi-subunit metalloprotein that elicits a strong nonspecific immune activation, thus inducing both cellular and humoral immune responses. The exceptional immunogenicity of this protein can be leveraged to vaccinate mice against self-antigens that otherwise would not induce an autoimmune response. This protocol describes the covalent conjugation of KLH with acyl-coenzyme A-binding protein (ACBP), the autovaccination of mice with ACBP-KLH conjugate together with a potent adjuvant, and the detection of the produced anti-ACBP autoantibodies.

Póster presentado al XLI Congreso de la SEBBM. Santander, 10-13 de septiembre de 2018, Comunicación núm. 6. Liver ischemia and reperfusion injury (IRI) remains a serious clinical problem affecting liver transplantation outcomes. IRI causes up to 10% of early organ failure and predisposes to chronic rejection. Cyclooxygenase-2 (COX-2) is involved in different liver diseases but the significance of COX-2 in liver IRI is a matter of controversy. This study was designed to elucidate the role of COX-2 expression in hepatocytes in the pathogenesis of liver IRI. In the present work hepatocyte-specific COX-2 transgenic mice (hCOX-2-Tg) and their wild-type (Wt) littermates were subjected to partial IRI and the results show that hCOX-2-Tg exhibited lower grades of necrosis and inflammation than Wt mice in part by reduced recruitment and infiltration of hepatic macrophages and netrophils with a corresponding decrease in serum levels of pro-inflammatory cytokines. Moreover hCOX-2-Tg mice showed a significant attenuation of the IRI-induced increase in oxidative stress and hepatic apoptosis an increase in autophagic flux and a decrease in endoplasmic reticulum (ER) stress comparing with that observed in Wt mice. Preconditioning of Wt mice resembles the beneficial effects of hCOX-2-Tg mice in IRI due to an increase in endogenous COX-2 expression. Furthermore measurement of PGE2 levels in plasma from patients who underwent orthotopic liver transplantation revealed a significantly negative correlation between PGE2 levels and graft function and time of ischemia. Overall the data support the view of the beneficial effects of hepatic COX-2 dependent prostaglandins after liver IRI., This work was supported by i‐COOP2016‐20213 (CSIC) to D.F., P.M.S; SAF2014‐52492 (MINECO, Spain) to L.B.; CIBERcv and CIBERehd (ISCIII, Spain) to L.B., P.M.S and M.C.; SAF2016‐75004‐R (MINECO, Spain) to P.M.S. and M.C. M F‐A. is recipient of FPI fellowship from MINECO (BES‐2017‐081928).

Resumen del trabajo presentado al EMBO Workshop: "Metabolic disorders and liver cancer", celebrado en Palma de Mallorca (España) del 23 al 26 de abril de 2017., Cyclooxygenase-2 (COX-2) is involved in different liver diseases but little is known about the significance of COX-2 in the development and progression of fibrosis. In the present work, hepatocytespecific COX-2 transgenic mice (hCOX-2-Tg) and their wild-type (Wt) littermates were injected with carbon tetrachloride (CC14) for 9 weeks or subjected to bile duct ligation (BDL) for 21 days to induce liver fibrosis. Different cells types were isolated analyzing the expression of a specific set of rniRNAs implicated in liver fibrosis. Furthermore, considering COX-2 expression in hepatocytes could protect against fibrosis by modulating the activation of hepatic stellate cells (HSC), we evaluated the effect of conditioned medium from isolated hepatocytes of COX-2 in primary HSC cells. Our results provide evidence that COX-2-dependent PGs protects against fibrosis by decreasing the Jevels of pro-fibrogenic markers a-SMA and collagen l a l and increasing apoptosis of HSC. Furthermore, the constitutive expression of COX-2 in hepatocytes represses rniRNA-23a-5p expression in HSC cells. These results suggest a protective effect exerted by COX-2 in the process of liver fibrosis, possibly through the downregulation of rniR-23a-5p. Further work is in progress to clarify the role of this miRNA and to identify putative target genes.

Trabajo presentado a la XX Jornada Científica del IIBM (Instituto de Investigaciones Biomédicas Alberto Sols, CSIC-UAM) celebrada el 23 de noviembre de 2017.

Resumen del póster presentado al XXXIX Congreso anual de la Sociedad Española de Bioquímica y Biología Molecular, celebrado en Salamanca, del 5 al 8 de septiembre 2016., La ciclooxigenasa 2 (COX-2) participa en diferentes enfermedades hepáticas, pero se conoce muy poco sobre la importancia de COX-2 en el desarrollo y progresión de la esteatohepatitis no alcohólica. Este estudio se diseñó con el objetivo de esclarecer el papel de la expresión de COX-2 en hepatocitos en la patogénesis de la esteatohepatitis y la fibrosis hepática. En el presente trabajo, ratones transgénicos para COX-2 específica del hepatocito (hCOX-2-Tg) y sus correspondientes controles wild-type (Wt) fueron alimentados con una dieta deficiente en metionina y colina (MCD) para establecer un modelo experimental de esteatohepatitis no alcohólica, o inyectados con tetracloruro de carbono (CCl4) para inducirles fibrosis hepática. En nuestro modelo animal, los ratones hCOX-2-Tg alimentados con la dieta MCD presentaron menor grado de esteatosis, >ballooning> e inflamación que los ratones Wt, en parte debido a una disminución del reclutamiento e infiltración de los macrófagos hepáticos, con la correspondiente disminución en los niveles de citoquinas pro-inflamatorias en suero. Además, los ratones hCOX-2-Tg mostraron una atenuación significativa del incremento del estrés oxidativo y la apoptosis hepática inducida por la dieta MCD observada en los ratones Wt. Aún más, los ratones hCOX-2-Tg tratados con CCl4 presentaban, de forma significativa, estadíos menores de fibrosis y un menor contenido hepático de colágeno, hidroxiprolina y marcadores pro-fibrogénicos que los controles Wt. De forma conjunta, nuestros datos indican que la expresión constitutiva de COX-2 en el hepatocito atenúa el desarrollo de la esteatohepatitis no alcohólica y la fibrosis hepática en ratones, mediante una reducción de la inflamación, el estrés oxidativo y la apoptosis, y mediante una modulación de la activación de las células estrelladas hepáticas, respectivamente, sugiriendo un posible papel protector de la inducción de COX-2 en la progresión de la enfermedad del hígado graso no alcohólico, EHGNA.

Resumen del póster presentado al XXXVIII Congreso de la Sociedad Española de Bioquímica y Biología Molecular, celebrado en Valencia del 7 al 10 de septiembre de 2015., Las ciclooxigenasas (COX) catalizan el primer paso en la biosíntesis de prostanoides. Existen dos isoformas: COX-1 es un enzima constitutivo implicado en procesos fisiológicos, mientras que COX-2 se induce en respuesta a diferentes estímulos. Los microRNA (miRNA) son RNA no codificantes que funcionan como reguladores postranscripcionales de la expresión génica. Aunque se conoce que la expresión de la COX-2 se regula a través de miRNA, no existen datos hasta la fecha del papel de COX-2 en la biogénesis y expresión de los miRNA. Teniendo en cuenta resultados previos de nuestro grupo que apuntan a una protección de los hepatocitos frente a la resistencia a la insulina mediada por COX-2, en el presente trabajo hemos analizado el papel de COX-2 en la regulación de un grupo específico de miRNAs implicados en la señalización de la insulina en células hepáticas. COX-2 reprime la expresión de miR-23b, miR-146b y miR-183 al aumentar la estabilidad por acetilación de la helicasa de RNA DDX5 vía PI3K/p300, modulando de este modo la función del complejo Drosha a través de su asociación con DDX5. La disminución de la expresión de miR-183 promueve protección frente a la resistencia a insulina al aumentar los niveles de IRS1. Estos resultados indican que la modulación en el procesamiento de los miRNAs por COX-2 es clave en la señalización por insulina en el hígado y podrían tener repercusión en la clínica para el tratamiento de varias disfunciones hepáticas.

Resumen del póster presentado a la Conferencia: FASEB SRC: Liver Biology: Fundamental Mechanisms and Translational Applications, celebrada en Keystone-Colorado (US) del 6 al 11 de julio de 2014., [Background and Aims: Accumulation evidence links obesity-induced inflammation as an important contributor to the induction of insulin resistance. Moreover, insulin resistance plays a key role in the pathophysiology of obesity-related diseases such as type 2 diabetes and non alcoholic fatty liver disease. Cyclooxygenase-1 and -2 catalyze the first step in prostanoid biosynthesis. Since adult hepatocytes fail to induce COX-2 expression regardless of the pro-inflammatory factors used, we have evaluated whether this lack of expression under mild pro-inflammatory conditions might constitute a permissive condition for the onset of insulin resistance. [Methods]: We evaluated the role of COX-2 expression in hepatocytes in a model of insulin resistance and altered energy homeostasis induced by high fat diet by metabolic parameters in transgenic mice constitutively expressing human COX-2 in hepatocytes. [Results]: COX-2 expression in hepatocytes protects from high fat diet-induced hepatic steatosis, obesity and hence insulin resistance, as demonstrated by a decreased hepatic steatosis, adiposity and adipocyte area, an enhanced insulin sensitivity and glucose tolerance, decreased plasmatic and hepatic triglycerides and free fatty acids levels, increased adiponectin/leptin ratio and decreased levels of pro-inflammatory cytokines. COX-2 transgenic mice exhibited increased whole body energy expenditure and fatty acid oxidation. Moreover, when hepatic insulin signaling was analyzed, an increase in insulin receptor-mediated Akt phosphorylation was found in hCOX-2 transgenic mice. Similar results were obtained in human and murine hepatic cells expressing a COX-2 transgene. [Conclusion]: Constitutively expression of COX-2 in hepatocytes protects against adiposity, inflammation and hepatic insulin resistance in mice under high fat diet.

Resumen del póster presentado al XXXVII Congreso de la Sociedad Española de Bioquímica y Biología Molecular, celebrado en Granada del 9 al 12 de septiembre de 2014., La resistencia a la insulina (RI) participa en la fisiopatología de enfermedades relacionadas con la obesidad como la diabetes mellitus tipo 2 y la enfermedad de hígado graso no alcohólica. Además, la RI está asociada con un estado de inflamación crónica leve que contribuye significativamente a su desarrollo. Las ciclooxigenasas 1 y 2 (COX-1 y COX-2) catalizan el primer paso en la biosíntesis de los prostanoides. COX-1 se expresa constitutivamente en diversos tejidos, mientras que la expresión de COX-2 es inducida por diferentes estímulos. Los hepatocitos adultos son incapaces de inducir la expresión de COX-2 independientemente de los factores proinflamatorios presentes. Se ha analizado el papel de la expresión hepática de COX-2 en ratones transgénicos (hCOX-2-Tg) en un modelo de RI y de alteración de la homeostasis energética inducido por una dieta rica en grasa. Nuestros resultados muestran que la expresión de COX-2 en el hepatocito protege frente a la RI, esteatosis hepática y obesidad, en parte debido a una mayor sensibilidad a la insulina, un aumento en la tolerancia a la glucosa, y de la relación adiponectina/leptina. Asimismo, se observó una disminución de la esteatosis hepática, adiposidad y en el área de los adipocitos, de los niveles de triglicéridos y ácidos grasos libres tanto hepáticos como plasmáticos, y de las citoquinas proinflamatorias. Los ratones hCOX-2-Tg exhibieron también un incremento en el gasto energético, inducción de la termogénesis y de los niveles de expresión de genes implicados en la oxidación de ácidos grasos, así como un aumento en la señalización de insulina hepática (fosforilación del receptor de insulina y AKT). Resultados similares se obtuvieron en líneas celulares hepáticas murinas y humanas que sobreexpresan COX-2. Nuestros datos demuestran que la expresión constitutiva de COX-2 en hepatocitos protege frente a la RI hepática, la adiposidad e inflamación en ratones hCOX-2-Tg sometidos a una dieta rica en grasa.

Resumen del póster presentado al XXXVI Congreso de la Sociedad Española de Bioquímica y Biología Molecular, celebrado en Madrid del 3 al 6 de septiembre de 2013., La ciclooxigenasa-2 (COX-2), enzima limitante en la cascada del ácido araquidónico, desempeña un papel clave en la biosíntesis de la prostaglandina E2 (PGE2) en respuesta a estímulos inflamatorios, factores de crecimiento, hormonas y otros factores de estrés celular. Un incremento en la producción de PGE2 estimula la proliferación de diversas células cancerosas, confiere resistencia a apoptosis, favorece metástasis y angiogénesis. Los niveles basales de PGE2 son mantenidos por el balance entre la ruta biosintética que incluye a las enzimas COXs y a las sintasas de PGE2, así como a las vías catabólicas, que implican a la 15-hidroxiprostaglandina deshidrogenasa (15-PGDH) dependiente de nicotinamida adenina dinucleótido (NAD+). 15-PGDH es una enzima crucial responsable de la inactivación biológica de PGE2. Los hepatocitos adultos son incapaces de inducir la expresión de COX-2 independientemente de los factores pro-inflamatorios utilizados. COX-2 se induce en los hepatocitos después de la hepatectomía parcial, en modelos animales de cirrosis, en líneas celulares de hepatoma humano, en carcinoma hepatocelular (CHC) y después de la infección de VHB y VHC. Sin embargo, no existen datos disponibles con respecto a la expresión de 15-PGDH en CHC. Nuestros resultados demuestran que la expresión de 15-PGDH esta disminuida en células de hepatoma humano con alta expresión de COX-2, al igual que en los modelos murinos químicos y genéticos de CHC y en las biopsias humanas de CHC. Además, la expresión de 15-PGDH se inhibe por EGF (factor de crecimiento epidérmico) y HGF (factor de crecimiento de hepatocitos) a través de la activación de ERK (quinasa regulada por señales extracelulares) y p38MAPK (proteína quinasa activada por mitógenos). Por el contrario, la expresión ectópica de 15-PGDH induce apoptosis en células de hepatoma y disminuye el crecimiento de células de CHC en ratones inmunodeprimidos, mientras que el silenciamiento de 15-PGDH incrementa la viabilidad celular y la formación de tumores. Estos datos sugieren una aplicación terapéutica de 15-PGDH en CHC.

Resumen del póster presentado al 64th Annual Meeting of the American Association for the Study of Liver Diseases: The Liver Meeting 2013, celebrado en Washington (US) del 1 al 5 de noviembre de 2013., [Background and Aims]: 15-hydroxyprostaglandin dehydrogenase (15-PGDH) is a tumor suppressor in some cancers. However, no data are available regarding 15-PGDH expression in hepatocellular carcinoma (HCC). We aimed to assess the potential role of 15-PGDH in HCC. [Materials and Methods]: HCC cells lines were treated with EGF, HGF or different pharmacological inhibitors and vehicle as control. COX-2, mPGES-1 and 15-PGDH expression were analyzed by qPCR and Western-blot. Additionally, we induced 15-PGDH overexpression or silencing in a hepatoma cell line, to test in vitro cell viability, cell cycle and apoptosis markers, so as to assess tumor growth in vivo in athymic nu/nu mice. Furthermore, this study comprised a chemical model of liver cancer induced with diethylnitrosamine, a mouse model of accelerated hepatocarcinogenesis and human HCC biopsies where 15-PGDH expression was evaluated. [Results]: 15-PGDH was downregulated in human hepatoma cells with a high COX-2 and mPGES-1 expression. Moreover, EGF and HGF increased COX-2 and mPGES-1 levels and suppressed 15-PGDH expression by mainly involving ERK and p38MAPK activation. Besides, 15-PGDH expression was decreased in chemical and genetic murine models of HCC and in human HCC biopsies. Conversely, ectopic expression of 15-PGDH induced apoptosis in hepatoma cells and decreased the growth of hepatoma cells in nude mice whereas the silencing of 15-PGDH increased the tumor formation by promote increased in cell viability and Sphase cells. [Conclusion]: 15-PGDH expression is downregulated in HCC while the overexpression leads to apoptosis and may function as a relevant tumor suppressor and a potential therapeutic application in HCC.

Trabajo Fin de Grado: Grado en Biología Sanitaria., [ES] La ciclooxigenasa (COX) es la enzima que cataliza el paso limitante en la síntesis de prostanoides, entre ellos las prostaglandinas (PGs). Existen dos isoformas de COX: la COX-1, que se expresa constitutivamente en diversos tejidos, y la COX-2 que es inducida por múltiples estímulos como factores de crecimiento, moléculas proinflamatorias y estrés celular. Los hepatocitos adultos expresan COX-2 en respuesta a hepatectomía parcial, al daño hepático agudo y en enfermedades hepáticas crónicas. La lesión hepática inducida por isquemia-reperfusión (I/R) es una causa importante de morbilidad y mortalidad que puede ocurrir durante el trasplante hepático, resección hepática y shock circulatorio. Trabajos previos han implicado a COX-2 en la fisiopatología de la lesión por I/R con resultados contradictorios. Teniendo en cuenta estos antecedentes, el objetivo de este trabajo es determinar el papel de COX-2 en un modelo de daño hepático por I/R en ratones transgénicos para COX-2 humana. Concretamente se pretende determinar el efecto de COX-2 sobre el estrés oxidativo, principal mecanismo fisiopatológico en la lesión por I/R. Los resultados obtenidos muestran que la expresión de COX-2 en el hepatocito atenúa la muerte celular hepática y el estrés oxidativo, en la lesión inducida por I/R. Dicho efecto es debido, en parte, a un incremento de la expresión y actividad de moléculas antioxidantes tales como la superóxido dismutasa 2 (SOD2) y la glutation peroxidasa (GPx). En conclusión, la expresión constitutiva de COX-2 en el hepatocito protegen contra el daño hepático y estrés oxidativo inducido por I/R., [EN] Cyclooxygenase (COX) is the enzyme that catalyzes the limiting step in prostanoids biosynthesis, including prostaglandins (PGs). There are two isoforms of COX: COX-1 is constitutively expressed in many tissues, and COX-2, which is induced by variety stimuli such as growth, pro-inflammatory factors, and cell stress. Adult hepatocytes express COX-2 in response to partial hepatoectomy, acute liver damage or chronic liver disease. Ischemia-reperfusion hepatic injury (IRI) is an important cause of morbidity and mortality that can occur during liver transplantation, liver resection and circulatory shock. Previous studies have implicated COX-2 in the pathophysiology of IRI with contradictory results. Given this background, the objective of this work is to determine the contribution of COX-2 in a model of IRI in transgenic mice for human COX-2. Moreover, the effect of COX-2 in oxidative stress, the main pathophysiological mechanism in this injury. The results obtained show that the expression of COX-2 in hepatocytes attenuates hepatic cell death and oxidative stress in the IRI. This effect is due, in part, to an increase in the expression and activity of antioxidant molecules such as dismutase superoxide 2 (SOD2) and glutathione peroxidase (GPx). In conclusion, the constitutive expression of COX-2 in the hepatocyte protect against hepatic damage and oxidative stress induced by IRI.