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La histoplasmosis, micosis sistémica y endémica en una amplia zona de las Américas, es causada por el hongo dimórfico Histoplasma capsulatum. Tradicionalmente, el diagnóstico de esta entidad se realiza por métodos microbiológicos directos y biopsias que emplean una variedad de coloraciones especiales tales como Wright, Giemsa y plata metenamina, entre otras, así como por cultivo; este último representa el estándar de oro. Se emplean, igualmente, métodos indirectos que incluyen la detección de anticuerpos y antígenos. Los valores de sensibilidad y especificidad en ambos métodos son variables, y los resultados dependen, a su vez, de la forma clínica de la enfermedad que presente el paciente y de su estado inmune. Recientemente, la biología molecular ha permitido introducir nuevas herramientas que han sido utilizadas para la detección e identificación de H.capsulatum, una de ellas es la PCR anidada que se caracteriza por sus altos niveles de sensibilidad y especificidad. De igual forma, estas técnicas moleculares han permitido realizar análisis evolutivos, estudios de diversidad genética y un sinnúmero de estudios de epidemiología molecular, a partir de los cuales se ha logrado recopilar información valiosa sobre la variabilidad genética de este microorganismo. En esta revisión se describen los métodos de laboratorio convencionales y las técnicas moleculares más empleadas para el diagnóstico de la histoplasmosis; así como también algunas de sus aplicaciones en la epidemiología y biología molecular de este hongo. Histoplasma capsulatum is the causative agent of histoplasmosis, a systemic and endemic mycosis widely distributed in the Americas. Diagnosis of histoplasmosis is traditionally accomplished by means of direct preparations and biopsies stained by especial methods, as well as by isolation of fungus in culture; the latter is considered the gold standard. Indirect methods, including immunological tests to detect antibodies and/or antigens, are also valuable; both direct and indirect methods present sensitivity and specificity ranges that vary depending on the clinical form of the disease and the immune status of the host. Recently, molecular biology has allowed implementing new tools to detect and identify H. capsulatum, and several molecular tests, such as nested-PCR, are being used for the diagnosis of histoplasmosis, and so provide high sensitivity and specificity values. In addition, these molecular techniques have made it possible to perform evolution analysis, genetic diversity research, and molecular epidemiology, thus compiling valuable information on the genetic variability of this microorganism. In this review, the conventional and molecular methods employed for the diagnosis of histoplasmosis have been described, as have some of the applications of these molecular techniques to this fungal pathogen's epidemiology and molecular biology.