0 Cover and acknowledgements i-xiv 1 Introduction 1 1.1 Biological thermodynamics 1 1.2 An intuitive notion of energy and entropy 2 1.3 From steam engines to actin filaments: the laws of thermodynamics 5 1.4 Free energy in processes involving proteins 6 1.4.1 Predicting ligand binding and protein- protein interactions 7 1.4.2 Conformational entropy 8 1.5 The statistical in mechanics 9 1.5.1 Information over matter and energy 10 1.6 Entropy is a logarithmic counting of microstates 11 1.6.1 Stabilization by conformational entropy 13 1.6.2 Acceptable errors in theoretical estimations of protein thermodynamics 15 1.7 The entropy of polymers 16 1.7.1 Connection of thermodynamics to information theory 17 1.8 Medical applications of protein and drug thermodynamics 17 1.9 Aim of this work 19 1.10 References for Chapter 1 20 2 Balanced and bias-free computation of conformational entropy differences for molecular trajectories 27 2.1 Introduction 27 2.1.1 Experimental measurements of conformational entropy 28 2.1.2 Theoretical estimation of conformational entropy 29 2.2 Analytical derivation: Configurational entropy of a macromolecule 30 2.2.1 Absolute and relative configurational entropies 30 2.2.2 Sackur-Tetrode equation as a limiting case for ideal gas 33 2.2.3 Entropy using local spherical polar (BAT) coordinates 34 2.2.3.1 Relative conformational entropy in terms of BAT coordinates 37 2.3 Numerical method to estimate conformational entropy differences 38 2.3.1 Automated selection of BAT coordinates 39 2.3.1.1 Continuity maximization for torsions 39 2.3.1.2 Phase angles 40 2.3.2 Mutual Information expansion in low dimensional subspaces 40 2.3.3 Discretization 42 2.3.4 Bias-Removal 44 2.3.5 Balancing 44 2.3.6 Generating molecular conformations in a canonical ensemble 46 2.3.7 Benchmark Entropy 46 2.4 Model system 1: Monte Carlo simulation of a three-atom molecule in a cage 48 2.4.1 Simulation procedure 48 2.4.1.1 Monte Carlo algorithm 49 2.4.2 Clustering of conformations 49 2.4.3 Entropy estimation 50 2.5 Model system 2: Molecular Dynamics simulation of trialanine 52 2.5.1 Simulation procedure 52 2.5.2 Clustering of conformations 53 2.5.3 Entropy estimation 54 2.5.4 Convergence of benchmark entropy, energy and free energy 54 2.5.5 Detailed results for entropy estimates using the MI expansion (MIE) 57 2.5.5.1 MIE1 using all BAT coordinates 57 2.5.5.2 MIE2 using all BAT coordinates 58 2.5.5.3 MIE3 using all BAT coordinates 59 2.5.5.4 MIE Using only soft degrees of freedom 60 2.5.6 Convergence of the entropy estimates 63 2.5.6.1 Importance of choosing frames at random in the balancing method 64 2.5.7 Summary of results for model system 2 64 2.6 Discussion 69 2.6.1.1 BAT coordinates represent phase space compactly 69 2.6.1.2 Approximate cancellation of the Jacobian term of the entropy 70 2.6.1.3 Entropy estimation in signal processing versus molecular simulations 70 2.7 Conclusion 71 2.8 References for Chapter 2 74 3 Influence of Spacer-Receptor Interactions on the Stability of Bivalent Ligand-Receptor Complexes 81 3.1 Introduction 81 3.1.1 Biological and pharmaceutical relevance of multivalency 81 3.1.2 Polymer spacer-receptor interactions 82 3.1.3 Comparison of our model to experiment 82 3.2 Conclusions 83 3.2.1 Receptor topography: concave, planar or convex 83 3.2.2 Interaction thermodynamics: repulsive or attractive 83 3.3 References for Chapter 3 84 4 Summary 87 4.1 Abstract in English 87 4.1.1 Balanced and bias-free computation of conformational entropy differences for molecular trajectories 87 4.1.2 Influence of spacer-receptor interactions on the stability of bivalent ligand-receptor complexes 88 4.2 Zusammenfassung in deutscher Sprache 90 4.2.1 Ausbalancierte und von systematischen Fehlern bereinigte Berechnung konformationeller Entropiedifferenzen für molekulare Trajektorien 90 4.2.2 Einfluss von Spacer-Rezeptor-Wechselwirkungen auf die Stabilität von bivalenten Ligand-Rezeptor-Komplexen 91 Submitted manuscript Influence of Spacer-Receptor Interactions on the Stability of Bivalent Ligand- Receptor Complexes (print version only) 94 Supporting information for manuscript (print version only) 119, Although thermodynamics was born from the desire to optimize industrial processes, its wide applicability has recently afforded it a place in biology. Accurate estimation of thermodynamic variables for processes involving biological macromolecules is an important goal in theoretical chemistry. For macromolecules and soft matter in general, understanding of the driving forces that comprise a given free energy or binding constant requires consideration of flexibility for all molecular degrees of freedom. The entropic contribution to free energy is thus an essential ingredient, whether explicitly quantified or included in a model in the form of a correct enumeration of the multiplicity of conformations. This doctoral thesis offers two contributions to the problem of computing entropy: (a) A numerical method for estimating conformational entropy differences for macromolecules was developed. It uses techniques borrowed from information theory and applies them to statistical mechanics. The method is applicable to conformational transitions and protein- ligand binding. (b) A model to describe the enhancement of the binding affinity for a bivalent ligand tethered with a polymer spacer was expounded. The novelty of the model consists in the inclusion of spacer-receptor interactions. (a) Balanced and bias-free computation of conformational entropy differences for molecular trajectories The mutual information expansion (MIE) is applied to estimate conformational entropy differences of macromolecules applicable to molecular dynamics or Monte Carlo simulation data on oligopeptides, polymers, proteins and ligands. The MIE serves to reduce the high dimensionality of the probability density of the conformational space of a macromolecule. The individual terms of the MIE are evaluated with a histogram method. Internal bond-angle-torsion (BAT) coordinates are used to avoid spurious correlations present when using Cartesian coordinates, which would demand using higher order terms in the MIE. Practically all entropy estimation methods from finite samples suffer from an inherent systematic error or bias. Two approaches are applied that compensate for systematic errors that occur with a histogram method: (1) Simulation data are balanced by using the same number of coordinate sets (frames) for both conformer domains. Balancing puts fluctuations of the histogram bin contents on the same level for both conformers, allowing for efficient error cancellation. (2) Bias- removal corrects for systematic deviations due to finite number of frames per bin. Applying both corrections improves the precision of entropy differences enormously. Estimates of entropy differences are compared to thermodynamic benchmarks of polymer and peptide models, where excellent agreement is found. For trialanine as model system, the average error for the estimated conformational entropy difference is only 0.3 J/(mol K), which is 100 times smaller than without applying the two corrections. Guidelines are provided for efficiently estimating conformational entropies. The complete method, including 1st to 3rd order MI expansion, balancing and bias-removal can be performed with the program ENTROPICAL. It can be obtained from the author and used with CHARMM and NAMD topologies and trajectories. (b) Influence of spacer-receptor interactions on the stability of bivalent ligand-receptor complexes Experiments show that a ligand-receptor complex formed by binding a bivalent ligand (D) in which the two ligating units are joined covalently by a flexible polymeric spacer (S) can be orders of magnitude more stable than the corresponding complex formed with monomeric ligands. Up until now, the molecular models that have been proposed to rationalize this "enhancement effect" neglect spacer-receptor (S-R) interactions. These interactions can nevertheless substantially influence the relative stability of complexes. Here, the results of a computational study designed to assess the impact of S-R interactions in the prototypic bivalent complex are presented and compared with results of experiments. The S-R interactions mimicking general features of biological systems are modeled by contoured R surfaces with hills (or depressions) at the binding sites. In the fictitious limit of vanishing S-R interactions, the enhancement is pronounced. This enhancement is in line with the experimental observations, although the S-R interactions, which surely occur in reality, were neglected. For strictly repulsive S-R interactions (hard R surface) the enhancement vanishes, or even reverses. This is particularly the case if the R surface is convex (i.e. rising between the binding sites), while the enhancement is only moderately reduced if the R surface is concave. Alternatively, a weak S-R attraction close to the R surface can increase the enhancement. It is concluded that large enhancement should be observed only if both features are present: a concave R surface plus a weak S-R attraction. The latter occurs for spacer material such as polyethylene glycol (PEG), which is weakly hydrophobic and thus attracted by protein surfaces. It is shown that the enhancement of bivalent binding can be characterized by a single key parameter, which may also provide guidelines for the design of multivalent complexes with large enhancement effect., Obwohl die Thermodynamik ursprünglich zur Optimierung industrieller Prozesse entwickelt wurde, hat sie sich durch ihre breiten Anwendungsmöglichkeiten in letzter Zeit auch einen Platz in der Biologie gesichert. Ein wichtiges Ziel in der theoretischen Chemie stellt die genaue Abschätzung thermodynamischer Variablen für Prozesse dar, an denen biologische Makromoleküle beteiligt sind. Das Verständnis der Triebkräfte, die eine gewisse freie Energie bei Makromolekülen und allgemein weicher Materie ausmachen, bedarf der Miteinbeziehung der Flexibilität aller molekularen Freiheitsgrade. Der entropische Beitrag zur freien Energie ist also ein unentbehrlicher Bestandteil, unabhängig davon, ob er explizit quantifiziert wird oder bei einem Modell in Form einer richtigen Aufzählung der Vielfachheit der Konformationen mit einbezogen wird. Die vorliegende Dissertation liefert zu dem Problem der Entropieberechnung zwei Beiträge: (1) Eine numerische Methode zur Berechnung von Entropiedifferenzen bei Makromolekülen wurde entwickelt. Sie entlehnt Techniken aus der Informationstheorie und wendet sie in der statistischen Mechanik an. Die Methode ist bei Konformationsänderungen und Protein-Ligandbindung verwendbar. (2) Zur Beschreibung der Verstärkung der Bindungsaffinität bei bivalenten Liganden, die mit einem Polymer-Spacer verknüpft sind, wurde ein geeignetes Modell entwickelt. Neu bei diesem Modell ist die Einbeziehung von Spacer-Rezeptor-Wechselwirkungen. (a) Ausbalancierte und von systematischen Fehlern bereinigte Berechnung konformationeller Entropiedifferenzen für molekulare Trajektorien Die Reihenentwicklung der wechselseitigen Information (mutual information expansion, MIE) wird benutzt, um Differenzen in konformationeller Entropie bei Makromolekülen zu berechnen. Die Methode ist auf Moleküldynamik- oder Monte-Carlo-Simulationsdaten von Polymeren, Proteinen und Liganden anwendbar. Die MIE dient der Dimensionsreduktion der Wahrscheinlichkeitsdichte des konformationellen Raums eines Makromoleküls. Die einzelnen Entwickungsterme der MIE werden mit Hilfe einer Histogrammmethode ausgewertet. Ein internes Koordinatensystem (Bindungslänge, Bindungswinkel und Torsionswinkel, das sogenannte BAT-System) wird benutzt, um die, bei kartesischen Koordinaten anwesenden, störenden Korrelationen zu vermeiden, die Entwickungsterme höherer Ordnung in der MIE benötigen würden. Praktisch alle Entropieschätzungsmethoden, die über eine endliche Menge von Daten verfügen, leiden an systematischen Fehlern (Bias). Zwei Korrekturmethoden werden eingesetzt, um diese systematischen Fehler von Histogrammmethoden auszugleichen: (1) Die Simulationsdaten werden ausbalanciert, indem die gleiche Anzahl von Koordinatensätzen (Einzelbildern) für beide Konformerdomänen benutzt wird. Durch dieses Ausbalancieren werden die Schwankungen der Belegungen einzelner Histogrammsäulen für beide Konformere im Mittel gleich groß. Dies führt zu einem effizienten Fehlerausgleich. (2) Die Bereinigung der systematischen Fehler (Bias) kompensiert Abweichungen, die auf Grund der endlichen Menge von Daten pro Histogrammsäule entstanden sind. Die gleichzeitige Verwendung beider Korrekturen verbessert die Genauigkeit der Abschätzung von Entropiedifferenzen erheblich. Die geschätzten Entropiedifferenzen werden mit thermodynamischen Bezugswerten für Polymer- und Peptidmodelle verglichen und stimmen mit diesen ausgezeichnet überein. Für das Modellsystem Trialanin betrug der durchschnittliche Fehler für die geschätzte konformationelle Entropiedifferenz nur 0.3 J (mol K), welcher 100-mal kleiner ist als bei Weglassen beider Korrekturmethoden. Leitlinien zur effizienten Berechnung konformationeller Entropie werden angegeben. Die komplette Methode, einschließlich MIE 1. bis 3. Grad, Ausbalancieren und Bereinigung von systematischen Fehlern, kann mit Hilfe des Programms ENTROPICAL ausgeführt werden. Das Programm arbeitet auf CHARMM- und NAMD-Topologien und -Trajektorien und wird vom Autor auf Anfrage zur Verfügung gestellt. (b) Einfluss von Spacer-Rezeptor-Wechselwirkungen auf die Stabilität von bivalenten Ligand-Rezeptor-Komplexen Experimente zeigen, dass ein durch einen bivalenten Liganden (D) gebildeter Ligand-Rezeptor- Komplex, in dem beide bindenden Einheiten mit Hilfe eines flexiblen Polymer- Spacers kovalent verknüpft werden, um Größenordnungen stabiler sein kann als der entsprechende, durch monomere Liganden gebildete Komplex. Bislang haben molekulare Modelle der bivalenten Bindung den Verstärkungseffekt erklärt, ohne die Wechselwirkungen zwischen Spacer und Rezeptor (S-R) zu berücksichtigen. Letztere können aber die relative Stabilität der Komplexe entscheidend beeinflussen. Wir haben Computersimulationen an geeigneten, prototypischen Modellsystemen für den bivalenten Komplexe durchgeführt, um die Auswirkungen der S-R-Wechselwirkungen auf die Bindungseffizienz zu untersuchen und mit experimentellen Ergebnissen verglichen. Die modellierten S-R-Wechselwirkungen bilden die allgemeinen Merkmale biologischer Systeme nach und werden als R-Oberfläche mit Bergen (bzw. Tälern) an den Bindungsstellen modelliert. Im fiktiven Grenzfall verschwindender S-R-Wechselwirkungen ist die Verstärkung der Bindungseffizienz groß. Dies deckt sich mit experimentellen Beobachtungen, obwohl die in der Realität sicher auftretenden S-R-Wechselwirkungen vernachlässigt wurden. Bei rein abstoßenden S-R-Wechselwirkungen (harter R-Oberfläche) verschwindet die Verstärkung oder kehrt sich gar um. Das ist insbesondere bei konvexer (also zwischen den Bindungsstellen gewölbter) R-Oberfläche der Fall, wobei die Verstärkung bei einer konkaven Oberfläche nur unwesentlich verringert ist. Alternativ kann eine schwache S-R-Anziehung nahe der R-Oberfläche die Verstärkung erhöhen. Es wird geschlussfolgert, dass nur in dem Fall, dass beide Merkmale anwesend sind, eine hohe Verstärkung zu erwarten ist: d. h. bei einer konkaven R-Oberfläche und einer schwachen S-R-Anziehung. Letzteres tritt bei Spacermaterialien wie Polyethylenglycol (PEG) auf, welches geringfügig hydrophob ist und aus diesem Grund von Proteinoberflächen angezogen wird. Es wird gezeigt, dass die Verstärkung bivalenter Bindung mit einem einzelnen Parameter gekennzeichnet werden kann, woraus sich Leitlinien für den Entwurf multivalenter Komplexe mit hoher Verstärkung gewinnen lassen.