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Orientador: Mateus Borba Cardoso Tese (doutorado) - Universidade Estadual de Campinas, Instituto de Química Resumo: Este trabalho investiga o comportamento de nanopartículas modelo frente aos desafios impostos por diferentes vias de administração sob condições mais fidedignas à realidade. Nesse contexto, ele traz uma discussão dos possíveis aprimoramentos na engenharia de superfície desses sistemas para torná-los mais eficazes para aplicações médicas. Na Parte I desse documento, referente à administração oral, foram investigados (a) a estabilidade das nanopartículas de sílica (SiO2NPs) no meio digestivo (fluidos simulados da saliva, estômago e intestino) e (b) o transporte dessas nanopartículas através de modelos otimizados do epitélio intestinal humano. Foi observado que as SiO2NPs se mantiveram estáveis nos fluidos digestivos e não apresentaram indícios de degradação. Além disso, foi verificado que a porcentagem de SiO2NPs absorvidas e transportadas através do epitélio aumentou ao longo do tempo de incubação. Esses resultados apontam que as SiO2NPs são um modelo com grande potencial para administração por via oral, seja para o tratamento de doenças intestinais ou de outras enfermidades. Na Parte II, foi descrito o desenvolvimento de SiO2NPs coloidalmente estáveis em meio biológico e direcionáveis para células tumorais sob o contexto da administração por via intravenosa. As SiO2NPs foram funcionalizadas com um estabilizador cinético (grupos zwitteriônicos, ZW) e com um direcionador (folato) capaz de interagir seletivamente com receptores de folato, expressos em maior quantidade em linhagens tumorais. Técnicas de caracterização permitiram confirmar as etapas da funcionalização. Também foi observado que a estabilidade das SiO2NPs funcionalizadas foi preservada em meios complexos (plasma humano) e que houve diminuição na quantidade de proteínas adsorvidas, revelando que o ZW proporcionou o efeito almejado (efeito corona free). Ademais, experimentos em sangue de ratos permitiram comprovar que essas SiO2NPs não se apresentaram hemolíticas. Por fim, foi verificado que as SiO2NPs funcionalizadas foram mais internalizadas pelas células tumorais do que pelas células sadias e que quanto maior o grau de agressividade da linhagem tumoral, mais seletiva essa internalização. Para o futuro, faz-se necessário o estudo dessas nanopartículas em condições ainda mais próximas da realidade, visando obter respostas mais fiéis àquelas que seriam observadas no organismo humano. Devido ao momento sensível gerado pela pandemia do coronavírus, a via nasal também foi abordada por ser a principal porta de entrada para a infecção do vírus SARS-CoV-2. Como discutido na Parte III, o vírus foi tomado como modelo de nanopartícula e suas características físico-químicas e estruturais foram avaliadas visando entender a jornada viral por essa via de administração. As discussões apresentadas foram fundamentais para a compreensão do panorama pandêmico, que se deu a partir do estudo do efeito de diversos parâmetros (exemplos: tamanho do vírus, grupos superficiais, simetria e homogeneidade dos ligantes) sobre o tropismo viral. Esses estudos geram diretrizes para o aperfeiçoamento da síntese de nanopartículas para administrações nasal e por outras vias. As discussões realizadas nas três partes do trabalho apontam que a busca pelo melhoramento nos processos de síntese e funcionalização de nanopartículas combinada com a investigação do seu comportamento em condições mais próximas da realidade são essenciais para o desenvolvimento de nanomedicamentos eficientes para diversos tipos de aplicações médicas Abstract: This work investigates the behavior of model nanoparticles in the face of challenges imposed by different routes of administration close to the clinic conditions. This context addresses a discussion of possible surface engineering improvements of these systems to make them more effective for medical applications. In Part I of this document, referring to oral administration, we investigated (a) the stability of silica nanoparticles (SiO2NPs) in the digestive media (simulated fluids from saliva, stomach, and intestine) and (b) the transport of these nanoparticles through optimized models of the human intestinal epithelium. We observed that SiO2NPs remained stable in digestive fluids and showed no signs of degradation. Furthermore, we verified that the percentage of SiO2NPs absorbed and transported through the epithelium increased along the incubation time. These results indicate that SiO2NPs are a model with great potential for oral administration, whether for the treatment of intestinal diseases or other diseases. In Part II, we described the development of SiO2NPs, which are colloidally stable in biological media and targetable to tumor cells in the context of intravenous administration. SiO2NPs were functionalized with a kinetic stabilizer (zwitterionic groups, ZW) and a targeting agent (folate) capable of selectively interacting with folate receptors, highly expressed in tumor cell lines. Characterization techniques allowed us to confirm the functionalization steps. We also observed that the stability of functionalized SiO2NPs was preserved in complex media (human plasma) and that there was a decrease in the number of adsorbed proteins, revealing that ZW provided the desired effect (corona free effect). Moreover, experiments in rat blood proved that these SiO2NPs were not hemolytic. Finally, we verified that the functionalized SiO2NPs were more internalized by the tumor cells than by the healthy ones and that the higher the aggressiveness of the tumor lineage, the more selective this internalization. For the future, these nanoparticles should be evaluated under conditions even closer to reality, aiming to obtain responses more like those that would be observed in the human organism. Due to the critical moment generated by the coronavirus pandemic, the nasal route was also addressed as the main gateway for the infection of the SARS-CoV-2 virus. As discussed in Part III, the virus was taken as a model nanoparticle, and its physicochemical and structural characteristics were evaluated to understand the viral journey through this route of administration. The discussions were fundamental for understanding the pandemic scenario, which was based on studying the effect of several parameters (examples: virus size, surface groups, symmetry, and homogeneity of ligands) on viral tropism. These studies generate guidelines for improving the synthesis of nanoparticles for nasal and other administrations. The discussions carried out in the three parts of the work point out that the search for improvement in the synthesis and functionalization of nanoparticles combined with the investigation of their behavior in conditions closer to reality are essential for the development of efficient nanomedicines in different types of medical applications Doutorado Físico-Química Doutora em Ciências FAPESP 2017/21318-0

Orientador: Marcelo Ganzarolli de Oliveira Dissertação (mestrado) - Universidade Estadual de Campinas, Instituto de Química Resumo: S-nitrosotióis (RSNOs) são moléculas doadoras de óxido nítrico (NO) que podem ser encontradas endogenamente no organismo humano e que exercem várias funções biológicas, como vasodilatação, regulação de processos inflamatórios e cicatrização. A liberação de NO a partir de RSNOs pode ocorrer por via térmica ou fotoquímica, gerando como subprodutos dímeros RSSR, que contém ligações dissulfeto. Quitosana (QT) é um polissacarídeo amplamente utilizado na fabricação de biomateriais e dispositivos biomédicos. A funcionalização de QT para conter grupos SNO pode ser uma estratégia interessante para fabricar biomateriais capazes de liberar NO de forma lenta e controlada. Neste trabalho foram desenvolvidas duas estratégias para a modificação química da QT, produzindo QTs S-nitrosadas doadoras de NO. 1. Funcionalização da QT com ácido tioglicólico (QT-ATG) ou ácido mercaptosuccínico (QT-AMS) em solução, mediada por carbodiimida, seguida de reação de S-nitrosação para obtenção das QTs S-nitrosadas correspondentes (QT-ATG(SNO) e QT-AMS(SNO), que foram avaliadas quanto à liberação fotoquímica de NO. 2. Funcionalização da QT com metacrilato de glicidila (MG) para a inserção de grupos metacrilato pendentes, seguida da fotorreticulação dos grupos metacrilatos e funcionalização com os ácidos S-nitrosotioglicólico (ATG(SNO)) ou S-nitrosomercaptosuccínico (AMS(SNO)), mediadas por carbodiimida, e posterior liofilização para obtenção de criogéis de QT (QT-ATG(SNO) e QT-AMS(SNO)), capazes de liberar NO termicamente em reações mediadas pela hidratação. As QTs funcionalizadas foram caracterizadas por FTIR e RMN 1H e pelo método colorimétrico de Ellman, que no caso das QTs em solução determinou concentrações de tióis de 88 ?mol g-1 (QT-ATG) e 126 ?mol g-1 (QT-AMS). A espectrofotometria UV-Vis revelou cinéticas de liberação fotoquímica de NO de primeira ordem, com meias vidas de 33 min tanto para QT-ATG(SNO) quanto QT-AMS(SNO). Além disso, as soluções apresentaram boa estabilidade térmica a 8 °C, apresentando meias vidas de 36,3 dias (QT-ATG(SNO)) e 16,1 dias (QT-AMS(SNO)). Os criogéis apresentaram grau de intumescimento superior a 1000% e cargas de NO medidas por quimiluminescência de 58 ?mol g-1 (QT-ATG(SNO)) e 26 ?mol g-1 (QT-AMS(SNO)), que resultaram em taxas de liberação de NO de 0,42 nmol cm-2 min-1 (QT-ATG(SNO)) e 1,26 nmol cm-2 min-1 QT-AMS(SNO)). Estes resultados demonstram que as estratégias reacionais utilizadas permitem obter duas formas diferentes de apresentação de QTs S-nitrosadas doadoras de NO, com potencial para liberação localizada de NO em aplicações biomédicas Abstract: S-nitrosothiols (RSNOs) are nitric oxide (NO) donor molecules that can be found endogenously in the human body that exerts several biological functions, such as vasodilation, regulation of inflammatory processes, and wound healing. The NO release from RSNOs may occur via thermal or photochemical processes, generating RSSR dimers as byproducts, which contain disulfide bonds. Chitosan (CS) is a polysaccharide widely used in the fabrication of biomaterials and biomedical devices. CS functionalization to contain SNO groups is an interesting strategy to fabricate biomaterials that can release NO in a controlled fashion and at slow rates. In this work, two strategies were developed for the chemical modification of CS to obtain S-nitroso CSs as NO donors. 1. Functionalization of CS with thioglycolic acid (CS-TGA) and mercaptosuccinic acid (CS-MSA) in solution, mediated by carbodiimide, with subsequent S-nitrosation of sulfhydryls to obtain the corresponding S-nitroso CS (CS-TGA(SNO) and CS-MSA(SNO)) that were evaluated for their photochemical NO release. 2. Functionalization of CS with glycidyl methacrylate (GM) for the insertion of methacrylate groups, followed by the methacrylate group photocrosslinking, further functionalization with S-nitrosothioglycolic and S-nitrosomercaptosuccinic acids, mediated by carbodiimide, and followed by freeze-drying for the obtention of crosslinked CS cryogels (CS-TGA(SNO) and CS-MSA(SNO)) that are capable of releasing NO thermally in reactions mediated by the cryogel hydration. The functionalized CS were characterized by FTIR, 1H NMR and the Ellman’s colorimetric method, which determined thiol concentrations of 88 ?mol g-1 (CS-TGA) and 126 ?mol g-1 (CS-MSA) for the S-nitroso CSs in solution. UV-Vis spectrophotometry revealed first-order kinetics of NO release with half-lives of 33 min for both CS-TGA(SNO) and CS-MSA(SNO). In addition, the solutions showed good thermal stability at 8 °C with half-lives of 36.3 days (CS-TGA(SNO) and 16.1 days (CS-MSA(SNO)). The cryogels showed swelling degrees above 1000% and NO loadings of 58 ?mol g-1 (CS-TGA(SNO)) and 26 ?mol g-1 (CS-MSA(SNO)), measured by chemiluminescence, that resulted in NO release rates of 0.42 nmol cm-2 min-1 (CS-TGA(SNO)) and 1.26 nmol cm-2 min-1 (CS-MSA(SNO)). These results demonstrate that the reaction strategies used allowed the obtention of two different forms of S-nitroso CS, with the potential for localized NO release in biomedical applications Mestrado Química Inorgânica Mestre em Química CAPES 001 FAPESP 2016/02414-5

Orientador: Marcelo Ganzarolli de Oliveira Dissertação (mestrado) - Universidade Estadual de Campinas, Instituto de Química Resumo: Condições fisiológicas associadas à diminuição do nível de óxido nítrico (NO) na vasculatura, como na síndrome de Raynaud e na angiopatia diabética, têm estimulado o desenvolvimento de novos biomateriais capazes de liberar NO topicamente. Neste trabalho efetuamos a modificação do poli(álcool vinílico), PVA, pela sua reticulação química através da esterificação com o ácido mercaptosuccínico. Esta reação permitiu a moldagem de filmes de PVA sulfidrilados (PVA-SH). A calorimetria diferencial de varredura e a difratometria de raios X mostraram que a reação de reticulação suprimiu a cristalização do PVA, levando a um material sem poros, com uma distribuição homogênea de grupos sulfidrila(-SH). Os grupos hidroxila remanescentes na rede de PVA-SH conferiram hidrofilicidade parcial ao material, associada a um grau de intumescimento de 80 a 120 % em meio aquoso. Os filmes de PVA-SH, foram submetidos a uma reação de S-nitrosação dos grupos ¿SH produzindo um PVA contendo grupos S-nitrosotióis (PVA-SNO). Medidas amperométricas e por quimiluminescência mostraram que os filmes de PVA-SNO contém ca. 6 nmols de NO/mg de filme e são capazes de liberar NO espontaneamente após imersão em meio fisiológico. A fluxometria por laser Doppler, usada para medir o fluxo sanguíneo na microcirculação dérmica, permite verificar que a aplicação tópica dos filmes de PVA-SNO hidratados sobre a pele saudável leva a um aumento dependente da dose e do tempo de mais de 5 vezes no fluxo sanguíneo basal em menos de 10 min de aplicação com uma ação prolongada de mais de 4 h durante a aplicação contínua. Estes resultados mostram que os filmes de PVA-SNO podem representar um novo material com potencial para o tratamento tópico no tratamento de desordens microvasculares da pele Abstract: Pathological conditions associated with the impairment of nitric oxide (NO) production in the vasculature, like Raynaud¿s syndrome and diabetic angiopathy, have stimulated the development of new biomaterials capable of delivering NO topically. In this work, we have modified poly(vinyl-alcohol) (PVA) by chemically crosslinking it via esterification with mercaptosuccinic acid. This reaction allowed the casting of sulfhydrylated PVA (PVA-SH) films. Differential scanning calorimetry and X-ray diffractometry showed that the crosslinking reaction suppressed the crystallization of PVA, leading to a non-porous material with a homogeneous distribution of -SH groups. The remaining hydroxyl groups in the PVA-SH network confered partial hydrophylicity to the material, associated with a swelling degree of 80 to 120 % in aqueous medium. The PVA-SH films were subjected to an S-nitrosation reaction of the SH groups yielding a PVA containing S-nitrosothiol groups (PVA-SNO). Amperometric and chemiluminescence measurements showed that the PVA-SNO films contain ca. 6 nmol NO/mg of film and are capable of releasing NO spontaneously after immersion in physiological medium. Laser Doppler-flowmetry, used to assess the blood flow in the dermal microcirculation, showed that the topical application of hydrated PVA-SNO films on the health skin leads to a dose and time dependent increase of more than 5-fold in the dermal baseline blood flow in less than 10 min with a prolonged action of more than 4 h during continuous application. These results show that the PVA-SNO films may represent a new material with potential for the topical treatment of microvascular skin disorders Mestrado Físico-Química Mestre em Química

Orientador : Marcelo Ganzarolli de Oliveira Dissertação (mestrado) - Universidade Estadual de Campinas, Instituto de Quimica Mestrado

Orientador: Marcelo Ganzarolli de Oliveira Dissertação (mestrado) - Universidade Estadual de Campinas, Instituto de Química Resumo: Muitas pesquisas têm sido realizadas visando o desenvolvimento de biomateriais poliméricos degradáveis como sistemas de liberação de fármacos, especialmente aqueles projetados para uso em dispositivos médicos implantáveis. A liberação localizada de óxido nítrico (NO) surge como uma possibilidade promissora a ser combinada com esses dispositivos, devido às suas diversas ações terapêuticas que promovem uma melhor integração tecidual no local do implante. Por isso, o objetivo deste projeto foi desenvolver uma blenda polimérica degradável de poli(ácido L-láctico) e poli(acetato de vinila), PLLA/PVAc, carregada com o doador de NO S-nitroso-N-acetil-D-penicilamina (SNAP) para a liberação localizada de NO. O PLLA foi sintetizado através da policondensação por desidratação azeotrópica do ácido L-láctico e apresentou Mw de 14100 g mol-1 e polidispersidade de 2,27. A SNAP foi sintetizada pela S-nitrosação da N-acetil-D-penicilamina (NAP) com ácido nitroso. A blendagem do PLLA com um PVAc comercial (Mw 100000 g mol-1), nas composições 70:30, 60:40 e 50:50 % (m/m), foi realizada através da obtenção de filmes por evaporação de solvente. A blenda 50:50 foi escolhida para ser carregada com SNAP devido à sua maior flexibilidade. Testes de degradação hidrolítica mostraram que a blenda 50:50 sofre uma perda de massa relacionada à hidrólise do PLLA de 2,2 % a 37 °C e 13,5 % a 60 °C, após 15 dias, o que representa uma alta taxa de degradação hidrolítica em comparação com um PLLA de alta massa molar. A liberação de NO da blenda carregada com SNAP, imersa em solução tampão (pH 7,4) a 37 °C, foi caracterizada por quimiluminescência. Os filmes apresentaram uma taxa de liberação de NO dose-dependente, variando na faixa de 69 a 296 pmol cm-2 min-1 para doses de SNAP entre 3,0 e 7,5 % (m/m), respectivamente. Esses valores estão diretamente correlacionados com a quantidade de SNAP eluída dos filmes para o meio aquoso. Esses resultados indicam que a blenda de PLLA/PVAc carregada com SNAP possui potencial para ser usada como um recobrimento degradável liberador de NO em dispositivos de implante Abstract: Many researches have been carried out to develop degradable polymeric biomaterials as drug release systems, especially those intended for use in implantable medical devices. Local release of nitric oxide (NO) rises as a promising possibility to be combined with these devices, due to its diverse therapeutic effects that promote an enhanced tissue integration in the implant site. Therefore, the aim of this project was to develop a degradable polymeric blend based on poly(L-lactic acid) and poly(vinyl acetate), PLLA/PVAc, loaded with the NO donor S-nitroso-N-acetyl-D-penicillamine (SNAP) for local release of NO. PLLA with a Mw of 14,100 and a polydispersity of 2.27 was synthesized by azeotropic dehydrative polycondensation of L-lactic acid. SNAP was synthesized by S-nitrosation of N-acetyl-D-penicillamine (NAP) using nitrous acid. Films of PLLA blended with a commercial PVAc (Mw 100,000), in the compositions 70:30, 60:40 and 50:50 wt%, were prepared by casting. The blend of composition 50:50 was chosen to be loaded with SNAP due to its higher flexibility. Hydrolytic degradation tests showed that the 50:50 blend undergoes mass losses related to PLLA hydrolysis of 2.2 wt% at 37 °C and 13.5 wt% at 60 °C, after 15 days, which represent a high hydrolytic degradation rate compared to a high molecular weight PLLA. The NO release from the SNAP-loaded blend, immersed in buffer solution (pH 7.4) at 37 °C, was characterized by chemiluminescence. The films showed a dose-dependent NO release rate, ranging from 69 to 296 pmol cm-2 min-1 for doses of SNAP in the range of 3.0 to 7.5 wt%, respectively. These values are directly correlated with the amount of SNAP eluted from the films to the aqueous medium. These results suggest that the SNAP-loaded PLLA/PVAc blend has potential for use as a NO-releasing degradable coating in implantable devices Mestrado Físico-Química Mestre em Química CNPQ 130960/2016-0 FAPESP 2016/02414-5

Orientador: Teresa Dib Zambon Atvars Dissertação (mestrado) - Universidade Estadual de Campinas, Instituto de Quimica Mestrado Físico-Química Mestre em Química

Orientador: Marcelo Ganzarolli de Oliveira Dissertação (mestrado) - Universidade Estadual de Campinas, Instituto de Quimica Resumo: Stents são malhas metálicas expansíveis usadas em procedimentos de angioplastia, para a desobstrução das artérias coronárias. Atualmente há um grande interesse na obtenção de stents revestidos com matrizes poliméricas eluidoras de drogas que impeçam a reoclusão da artéria (reestenose). S-nitrosotióis doadores de óxido nítrico (NO) como a S-nitrosoglutationa (GSNO) possuem potencial para a inibição da reestenose. Neste trabalho, placas metálicas e stents foram revestidos com filmes de PVA contendo GSNO (107 µmol/g) através da imersão em soluções de PVA/GSNO com concentrações de PVA de 0,5 a 10,0% m/v. Filmes de PVA/GSNO foram submetidos a ciclos de congelamento/descongelamento (C/D), e analisados em relação ao seu grau de cristalinidade, dissolução, intumescimento, morfologia e propriedades de difusão e eluição da GSNO. Análises por DSC e difração de raios X, mostraram que o grau de cristalinidade do PVA aumenta com o número de ciclos de C/D, e com a secagem por sublimação do filme congelado. O aumento da cristalinidade se reflete em uma diminuição da velocidade de eluição da GSNO para a fase aquosa e da velocidade de dissolução e grau de intumecimento da matriz. Os coeficientes de difusão (D) da GSNO através de filmes de PVA foram medidos utilizando-se uma cela tipo Franz com monitoramento espectrofotométrico. Verificou-se que os valores de D são menores nos filmes secos por sublimação e submetidos a um ciclo de C/D. Este resultado foi atribuído ao aumento da densificação da fase amorfa, obtido na secagem por sublimação. Os filmes secos por esta técnica, apresentaram uma estrutura tridimensional esponjosa constituída por filamentos interligados, revelada por microscopia eletrônica de varredura (MEV). Estimou-se que stents revestidos com PVA/GSNO, a partir de soluções de PVA 0,5 % (m/v) esterilizados com óxido de etileno a 45-55°C podem liberar cerca de 30 µmoles/g de PVA para a parede arterial e levaram à obtenção de revestimentos sem filmes entre as hastes metálicas Abstract: Stents are expansible wire mesh tubes used in angioplasty procedures in order to widening the luminal diameter of the coronary arteries. There is currently a great interest in the development of stents coated with drug-eluting polymeric matrices, which are able to prevent future closure of artery (restenosis). S-nitrosothiols which are nitric oxide (NO) donors, like S-nitrosoglutathione (GSNO) have potential to inhibit restenosis. In the present work, metallic plates and stents were coated with GSNO (107 µmol/g)- containing PVA films through their immersion in PVA/GSNO solutions with PVA concentration ranging from 0.5 to 10.0% wt/v. PVA/GSNO films were submitted to freezing/thawing cycles (F/T) and analyzed concerning their crystallinity dissolution, swelling, morphology and GSNO diffusion and elution properties. DSC and X Ray diffraction analysis have shown that the PVA crystallinity degree increases with the increase in the number of F/T cycles, and with the drying of the frozen film by sublimation. The increase in cristallinity was reflected in a decrease of the rate of GSNO elution to the aqueous phase, dissolution rate and swelling degree of the matrix. The diffusion coefficients of GSNO through PVA films were measured using a Franz-like cell with spectrophotometric monitoring. It was verified that D values are lower in the films dried by sublimation and submitted to one FT cycle. This result was attributed to the increase in the densification of the amorphous phase obtained in the drying by sublimation. The films dried by this technique, displayed a spongelike three-dimensional structure made by interconnecting filaments, revealed by scanning electron microscopy (SEM). Stents coated with PVA/GSNO, from solution of PVA 0.5 % (wt/v) have avoided the formation of films between the wires of the stent mesh. It was estimated that these stents are able to release ca. 30 µmols/g of PVA to the arterial wall after sterilization with ethylene oxide at 45-55 °C Mestrado Físico-Química Mestre em Química