Search

Dissertação de Mestrado em Antropologia Forense apresentada à Faculdade de Ciências e Tecnologia A identificação de restos humanos severamente degradados, tais como vítimas carbonizadas e restos cremados de mortes de desastres em massa e crimes contra a humanidade, apresenta um desafio particular na antropologia forense. O presente estudo investiga experimentalmente como a combustão da parte petroseal do temporal humano afecta o ADN presente na cóclea. Além dis-so, foi analisada a descoloração dos ossos e a perda de peso devido à exposição ao calor. As porções petroseais (n = 8, quatro deles antigos e quatro modernos) foram aleatoriamente submetidos a uma temperatura entre 145 °C e 500 °C, com uma amostra moderna sempre a seguir a uma antiga, e aquecida à temperatura selecionada num forno eléctrico de mufla com um termóstato. A cóclea era então extraída e moída em pó de osso. O ADN foi extraído do pó ósseo usando o protocolo Dabney (Dabney et al., 2013a) e sequenciado usando um método de sequenciação da Next Generation. Os resultados mostram que embora altamente fragmentado, ainda pode ser extraído ADN valioso das amostras até uma temperatura de 500 °C. Além disso, existe uma relação proporcional entre a intensidade da exposição ao calor e a perda de peso das amostras. A cor da superfície dos ossos também muda gradualmente com a intensidade de calor de castanho pálido para uma cor cinzenta clara. Dados os resultados promissores deste estudo piloto, é necessária mais investigação para investigar métodos apropriados de extração e sequenciação de ADN para amostras forenses severamente degradadas para ajudar e facilitar o processo de identificação positiva de restos humanos de contextos particularmente desafiantes. The identification of severely degraded human remains, such as burn victims and cremated remains from mass fatalities or crimes against humanity, present a particular challenge in Foren-sic Anthropology. The present study experimentally investigated how the combustion of human petrous bones affects the DNA present in the cochlea. In addition, the discolouration of the bones and the weight loss due to the exposure to heat were analysed. The petrous bones (n = 8, four of them ancient and four modern) were randomly assigned to a temperature between 145 °C and 500 °C, with a modern sample always following an ancient one, and heated to the selected temperature in an electric muffle-furnace with a thermostat. The cochlea was then extracted and milled into bone powder. DNA was extracted from the bone powder using the Dabney protocol (Dabney et al., 2013a) and sequenced using a Next Genration Sequencing method. The results show that although highly fragmented, valuable DNA material could be extracted from the samples up to a temperature of 500 °C. Furthermore, there is a proportional relationship between the intensity of the heat exposure and the weight loss of the samples. The surface colour of the bones also changes gradually to the heat intensity from pale brown to a light grey colour. Given the promising results of this pilot study, further research is needed to investigate appropriate DNA extraction and sequencing methods for severely degraded forensic samples to help facilitate the process towards positive identification of human remains from particularly challenging contexts.

Dissertação de Mestrado em Bioquímica apresentada à Faculdade de Ciências e Tecnologia da Universidade de Coimbra Gene therapy is believed to have the necessary characteristics to become a frontline treatment in a variety of diseases, including cancer. To reach its full potential it is still necessary to develop suitable vectors for the transport and delivery of genetic material into target cells. Currently, the most used vectors are of viral type. However, non-viral strategies have been emerging in the last decades as promising alternatives, and the most prominent examples are liposomes and cationic polymers. These are advantageous especially due to the fact that they are safe and their properties are easy to manipulate. In spite of these advantages, most of the used non-viral systems still demonstrate low efficiencies in transfection. The objective of this work was to investigate the gene delivery potential of novel non-viral vectors, constituted by different combinations of two polymers, to efficiently transport and delivery DNA into target cancer cells. In order to do so, their transfection activity was measured in different cell lines through luminescence, fluorescence microscopy and flow cytometry. Other parameters like their cytotoxicity, degree of DNA condensation, size and surface charge were also evaluated. The obtained results have demonstrated that our formulations are good candidates for gene delivery, due to their potent transfection efficiencies when compared to a “golden standard” polymeric-based gene delivery system, branched polyethylenimine (bPEI). From the developed combined formulations, CE-based polyplexes, prepared at the 100/1 N/P ratio, were selected as the best formulation, owing to their great transfection activity, even in the presence of serum, that is much higher than that obtained with polyplexes prepared with each one of the two polymers, and to their reduced levels of cytotoxicity. Furthermore, the other experimental studies revealed that the polyplexes designed with this combination of polymers present suitable physicochemical properties for in vivo applications, namely a high level of DNA protection and a reduced mean diameter. A terapia génica é considerada uma estratégia terapêutica com as características necessárias para se tornar um tratamento de primeira linha para uma grande variedade de doenças, incluindo o cancro. Apesar disso, para atingir o seu potencial ainda é necessário desenvolver vectores adequados para o transporte e entrega de material genético às células alvo. Actualmente, a maioria dos vectores utilizados são de tipo viral. No entanto, nas últimas décadas, as estratégias do tipo não-viral têm vindo a impor-se como alternativas promissoras, sendo os mais proeminentes exemplos os lipossomas e os polímeros catiónicos. Estes sistemas são vantajosos especialmente na medida em que são seguros e as suas propriedades são fáceis de manipular. Apesar destas vantagens, a maioria destes vectores ainda demonstra uma baixa eficiência de transfecção. O objectivo deste trabalho foi investigar o potencial de novos vectores não-virais, constituídos por diferentes combinações de dois polímeros, para transportar e entregar o material genético de forma eficiente a células cancerígenas. Para tal, a eficiência de transfecção foi avaliada em diferentes linhas celulares através dos ensaios de luminescência, microscopia de fluorescência e citometria de fluxo. Foram também avaliados outros parâmetros como a sua citotoxicidade, capacidade de condensação do DNA, tamanho e carga superficial. Os resultados obtidos mostraram que as nossas formulações são bons candidatos para entrega de material genético, devido à sua potente eficiência de transfecção quando comparada com a obtida com a referência padrão dos sistemas de base polimérica, polietilenimina ramificada (bPEI). Das formulações desenvolvidas envolvendo a combinação de polímeros, os poliplexos com base na combinação CE preparados na razão N/P de 100/1 foram selecionados como a melhor formulação, devido à sua elevada atividade de transfecção, mesmo na presença de soro, que é muito superior à obtida com os poliplexos preparados com cada um dos dois polímeros individualmente, e aos reduzidos níveis de citotoxicidade. Adicionalmente, os outros ensaios experimentais demonstraram que os poliplexos desenvolvidos com esta combinação de polímeros apresentam propriedades físico-químicas favoráveis à sua aplicação in vivo, nomeadamente elevada proteção de material genético e um diâmetro médio reduzido.

COELHO, João Pedro Valente de Oliveira - Unwarping heated bones : a quantitative analysis of heat-induced skeletal deformations using 3D geometric morphometrics. Coimbra : [s.n.], 2015. Dissertação de Mestrado em Evolução e Biologia Humanas. Restos humanos queimados representam um desafio interpretativo para os bioantropólogos. No caso do esqueleto, devido às extensas e caóticas transformações que os ossos e os dentes sofrem por transferência de calor, os métodos para estimativa do perfil biológico, caso aplicáveis, tendem a ser enviesados. Têm havido esforços em prol dos avanços metodológicos, particularmente em estimativa do sexo, contudo muito permanece por fazer. O encolhimento e o arqueamento ósseos induzidos pelo calor são dos principais impedimentos ao uso dos métodos osteométricos tradicionais. Estes dois fenómenos observáveis foram aqui reinterpretados como sendo modificações de tamanho e forma, respectivamente. Apesar desta intuição parecer simplista, permite uma reformulação teórica do problema presente. Visto que a análise quantitativa e comparativa do tamanho e da forma em entidades anatómicas são questões que foram resolvidas pela Síntese Morfométrica. Considerando as vantagens da abordagem acima referida, é notável não terem sido encontradas referências na literatura de restos esqueléticos queimados utilizando por base os métodos da morfometria geométrica. Portanto, este estudo preliminar é o primeiro do seu género e já apresenta ter algum potencial para a criação de modelos preditivos com relevância para as ciências forense. Demonstrou-se que o combinar da morfometria geométrica com métodos computacionais de aprendizagem automatizada traduz-se numa abordagem muito promissora para a análise da forma em material osteológico termicamente alterado. Ao aplicar um Logistic Model Trees em componentes principais das coordenadas de Procrustes, obteve-se um modelo capaz de prever a temperatura máxima da queima do osso com uma exatidão de 82%. Utilizou-se técnicas de regressão multivariada dentro do contexto comparativo de uma ANOVA de Procrustes, o que pode vir a ter algum potencial para regredir a forma a partir de um pequeno conjunto de variáveis. Contudo, cautela é indispensável com os resultados obtidos: o tamanho da amostra ainda é reduzido e é necessário realizar validação dos resultados com outra amostra similar. Human burnt remains are a tremendous challenge for bioanthropologists. In the case of skeletons, due to the extensive and chaotic transformations bones and teeth undergo throughout heat-transfer, methods for estimating the biological profile are biased if applicable. Many attempts have been successful in improving techniques, mainly in accessing sex, although there is still much room for improvement. Two particularly problematic heat-induced changes that undermine trust in traditional osteometric methods are skeletal shrinking and warping. In the present framework these two observable occurrences have been reinterpreted as size and shape changes, respectively. Despite seeming a quite simple intuition, it allows theoretical reformulation of the problem at hand. Bearing in mind that quantitative estimation, interpretation and comparison of size and shape in anatomical entities are issues that have already been solved by the Geometric Morphometrics Synthesis. Given the advantage of current statistical shape analysis approaches outlined in the previous paragraph, it is quite remarkable that no previous instances of researching burnt remains from such perspective were found in the literature. Therefore, this preliminary study is the first of its kind and it already showed some potential for the creation of predictive models relevant for the forensic sciences. It was demonstrated that combining Geometric Morphometrics and Machine Learning is a very promising route for shape analysis of heat-altered osteological material. By applying Logistic Model Trees on the Relative Warps of Procrustes Shape coordinates, the maximum temperature at which a bone was burnt was predicted with an overall accuracy of 82%. Multivariate regression in the context of Procrustes ANOVA also shows promise to regress bone shape by using only a few variables. However, caution should be taken with the provided results: sample size is quite small, and a comprehensive validation is yet to be done.