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Introduction: Knowledge of the geographical distribution of Leishmania species allows guiding the sampling to little-studied areas and implementing strategies to define risk zones and priority areas for control. Objective: Given that there is no publication that collects this information, the search, review, and compilation of the available scientific literature that has identified species in Colombia is presented in this paper. Materials and methods: A bibliographic search was performed in PubMed, Web of Knowledge, Google Scholar, SciELO and LILACS with the terms “(Leishmania OR Leishmaniasis) AND species AND Colombia”, without restrictions on publication year, language or infected organism; records of national scientific events and repositories of theses from Colombian universities were also included. Results: Eighty-six scientific documents published between 1985 and 2017 were found in which the species of Leishmania and their geographical origin were indicated. The species reported, in descending order of frequency, were: Leishmania (Viannia) panamensis, L. (V.) braziliensis, L. (V.) guyanensis, L. (Leishmania) infantum, L. (L.) amazonensis, L. (L.) mexicana, L. (V.) colombiensis, L. (V.) lainsoni and L. (V.) equatorensis; the last three were found with the same frequency. Leishmania species were reported from 29 departments. Conclusion: Information on the distribution of Leishmania species in Colombia is limited; therefore, it is necessary to gather existing data and propose studies that consolidate the distribution maps of Leishmania species in Colombia. This would allow the detection of areas where species have not been identified as well as the comparison of existing parasite and vector distributions. Resumen Introducción. El conocimiento de la distribución geográfica de las especies de Leishmania permite orientar el muestreo hacia áreas poco estudiadas e implementar estrategias para detectar zonas de riesgo y áreas prioritarias de control. Objetivo. Dado que no existe una publicación que reúna esta información, se planteó la revisión y compilación de la literatura científica disponible de estudios de identificación de especies del país. Materiales y métodos. Se llevó a cabo una búsqueda bibliográfica en PubMed, Web of Knowledge, Google Académico, SciELO y Lilacs con los términos “(Leishmania OR Leishmaniasis) AND especie AND Colombia”, así como en memorias de eventos científicos nacionales y repositorios de tesis y trabajos de grado de universidades del país. Resultados. Se encontraron 86 documentos científicos publicados entre 1985 y 2017, en los cuales se informaron la especie de Leishmania y el origen geográfico. Las especies circulantes reportadas, en su orden de frecuencia, fueron: Leishmania (Viannia) panamensis, L. (V.) braziliensis, L. (V.) guyanensis, L. (Leishmania) infantum, L. (L.) amazonensis, L. (L.) mexicana, L. (V.) colombiensis, L. (V.) lainsoni y L. (V.) equatorensis, las últimas tres, con igual frecuencia. Los reportes proceden de 29 departamentos. Conclusión. La información de la distribución de las especies de Leishmania en Colombia es limitada. Por lo tanto, se necesita reunir los datos existentes y plantear trabajos que permitan consolidar el mapa de distribución de las especies en el país, lo cual permitiría detectar las zonas sin información de las especies circulantes y establecer la concordancia entre su distribución y la de los vectores.

Resumen Introduction: Multilocus enzyme electrophoresis (MLEE) is the reference standard for the characterization of Leishmania species. The test is restricted to specialized laboratories due to its technical complexity, cost, and time required to obtain results. Polymerase chain reaction-restriction fragment length polymorphism (PCR-RFLP) is used to identify Leishmania species. Objective: To establish the concordance between the two tests as identifying methods for circulating species in Colombia. Materials and methods: A total of 96 isolates from patients with cutaneous or mucosal leishmaniasis were selected and identified by MLEE and PCR-RFLP with miniexon and hsp70 as the molecular targets, which were used sequentially. Restriction enzymes HaeIII and BccI were similarly applied. Cohen’s kappa coefficient and the 95% confidence interval (CI) were calculated. Results: The kappa coefficient and the 95% CI between MLEE and PCR-RFLP displayed “very good” concordance with a coefficient of 0.98 (CI95%: 0.98 to 1.00). The identified species were Leishmania Viannia braziliensis, Leishmania Viannia panamensis, Leishmania Viannia guyanensis and Leishmania Leishmania amazonensis. A total of 80 of the 96 isolates were sequenced and the results obtained by PCR-RFLP were confirmed. Conclusion: Due to the concordance obtained between tests results with the amplification of the genes miniexon and hsp70, PCR-RFLP is proposed as an alternative for identifying circulating Leishmania species in Colombia. Abstract Introducción. La electroforesis de enzimas multilocus (Multilocus Enzyme Electrophoresis, MLEE) es el estándar de referencia para la tipificación de las especies de Leishmania. La prueba está restringida a laboratorios especializados por su complejidad técnica, sus costos y el tiempo necesario para obtener resultados. La PCR-RFLP (Polymerase Chain Reaction-Restriction Fragment Length Polymorphism) se utiliza para tipificar especies de Leishmania. Objetivo. Establecer la concordancia entre las dos pruebas como métodos de tipificación de las especies circulantes en Colombia. Materiales y métodos. Se seleccionaron 96 aislamientos de pacientes con leishmaniasis cutánea o mucocutánea y se tipificaron mediante MLEE y PCR-RFLP con los blancos moleculares miniexon y hsp70 usados en serie. Las enzimas de restricción aplicadas fueron la HaeIII y la BccI, respectivamente. Se calculó el coeficiente kappa y un intervalo de confianza (IC) de 95 %. Resultados. Se determinó que la concordancia fue “muy buena” al obtener un coeficiente de 0,98 (IC95%: 0,98-1,00). Las especies identificadas fueron: Leishmania Viannia braziliensis, L. (V.) panamensis, L. (V.) guyanensis y L. (L,) amazonensis. De los 96 aislamientos, 80 se enviaron a secuenciación y se confirmaron los resultados obtenidos mediante PCR-RFLP. Conclusión. Dada la concordancia obtenida con la PCR-RFLP amplificando los genes miniexon y hsp70, se propone esta prueba como alternativa para la tipificación de especies de Leishmania circulantes en Colombia.

Las leishmaniasis son un grupo de enfermedades causadas por diferentes especies de parásitos del género Leishmania. En el desarrollo de la enfermedad el establecimiento de la infección es obligatorio y se da en parte, por la supervivencia y replicación del parásito en el macrófago. Por lo anterior es importante estudiar los mecanismos moleculares implicados en la interacción macrófago-Leishmania. La mayoría de los trabajos realizados sobre el efecto de la infección de Leishmania en la expresión de genes del macrófago se ha desarrollado con especies del subgénero Leishmania y en momentos iniciales de la infección. El objetivo de este trabajo fue identificar en la etapa del establecimiento de la infección, los genes y los procesos biológicos del macrófago potencialmente importantes en la interacción macrófago - L. braziliensis y caracterizar un modelo celular que permita la evaluación funcional de los genes identificados. El perfil de expresión de genes diferencialmente expresados entre macrófagos no infectados e infectados, se determinó por ensayos de microarreglos y los procesos biológicos por análisis de enriquecimiento funcional. Se evaluó el modelo celular: macrófagos derivados de la línea celular U937, en términos de su capacidad para ser modificado genéticamente, permitir el silenciamiento de genes por RNA de interferencia (shRNA) y permitir la identificación de cambios fenotípicos de infección, causados por dicho silenciamiento genético. Para lo anterior se expresó y silenció el gen gfp y se silenciaron los genes lmna y gro-β. El silenciamiento de los genes fue evaluado midiendo los niveles de expresión de la proteína por western blot y el efecto del silenciamiento, evaluando el fenotipo de infección de los macrófagos en términos de carga parasitaria y porcentaje de macrófagos infectados en las líneas silenciadas y en las líneas control. El proceso de silenciamiento fue exitoso para los tres genes estudiados obteniendo reducción del 88.9% en los niveles de GFP, del 87,5% en los niveles de LMNA y del 74,4% para Gro-β. El modelo celular permitió evidenciar cambios en la susceptibilidad de la infección de los macrófagos infectados por L. braziliensis, como consecuencia del silenciamiento genético. Los ensayos de microarreglos permitieron identificar 218 genes diferencialmente expresados entre macrófagos no infectados e infectados con L. (V.) braziliensis, y con base en los ensayos de enriquecimiento funcional se determinó que la biosíntesis de esteroles, específicamente la del colesterol era el principal proceso asociado. Los genes asociados a la biosíntesis del colesterol estaban regulados negativamente. Este es el primer estudio que reporta el perfil de expresión génica de macrófagos infectados por L. (V.) braziliensis y el proceso biológico principalmente asociado durante el establecimiento de la infección. Abstrat. The leishmaniasis are a group of diseases caused by different species of parasites of the genus Leishmania. In the development of the disease the establishment of infection is mandatory and is given partially by the survival and replication of the parasite in the macrophage. Therefore, it is important to study the molecular mechanisms involved in the interaction of macrophage-leishmania. Most of the work carried out on the effect of Leishmania infection in macrophage gene expression has been developed with species of the subgenus Leishmania and early moments of infection. The objective of this study was to identify, in the time of the establishment of infection, the macrophage´s genes and biological processes potentially important in the interaction macrophage - L. (V.) braziliensis; and characterize a cellular model that allows the functional evaluation of the genes identified. The expression profile of genes differentially expressed between macrophages uninfected and infected was determined by microarrays assays and biological processes by performance of functional enrichment analysis. The cellular model was assessed in terms of in terms of its ability to be genetically modified, if it allows gene silencing by RNA interference (shRNA) and if it allows the identification of phenotypic changes of infection, caused by gene silencing. In order to evaluate the parameters mentioned above, expression and silencing of gfp gene was performed as well as silencing of lmna and gro-β genes. The silencing of these genes was assessed by measuring the levels of protein expression by western blot and the effect of silencing process was evaluated identifying the phenotype of infection of macrophages in terms of parasite load and percentage of macrophages infected in silenced lines and control lines. The silencing process was successful for the three genes studied to obtaining reduction of 88.9% in levels of GFP, 87.5% in levels of LMNA and 74.4% to Gro-β. The cell model allowed identification of changes in the susceptibility of infection of macrophages infected by L. (V.) braziliensis, as a result of the gene silencing. The microarray assays helped identify 218 differentially expressed genes between macrophages uninfected and infected with L. (V.) braziliensis. Functional enrichment analysis determined that the biosynthesis of sterols, specifically the cholesterol, was the main associated process. The genes associated with cholesterol biosynthesis were downregulated. This is the first study that reports the profile of gene expression in macrophages infected with L. (V.) braziliensis and the main biological process associated during the establishment of the infection. Doctorado

La leishmaniasis es una enfermedad de transmisión vectorial, endémica en regiones tropicales y subtropicales, que puede tener compromiso en piel, mucosa y vísceras dependiendo de la especie infectante y la condición inmunológica del huésped. Es una enfermedad de baja mortalidad y alta morbilidad con cerca de 2.4 millones de años de vida ajustados por discapacidad. En Colombia la forma cutánea aporta el 95% de los casos reportados anualmente y aunque su pronóstico es más favorable se presentan como principales complicaciones la falla terapéutica o no respuesta al tratamiento y la producción de cuadros con compromiso mucoso. La falla terapéutica o no respuesta al tratamiento se registra en alrededor del 25% de los casos tratados con antimoniato de meglumina, primeria línea de tratamiento en el país. La respuesta al tratamiento está asociada a múltiples factores que incluyen la especie del parásito, la edad y estatus inmunológico del huésped, la localización de las lesiones y la vía de administración y duración del tratamiento. Del 3-10% de las personas que padecen Leishmaniasis cutánea (LC) pueden desarrollar leishmaniasis mucosa (LM) de manera concomitante o tardía. Esta forma complicada de la LC que se caracteriza por afectar principalmente la mucosa nasofaríngea, es producto de una diseminación linfo-hematógena de los parásitos de Leishmania spp. a partir de una lesión cutánea distante o del inoculo del parásito en proximidad de las regiones nasal u oral. En Colombia representa el 1.3% de los casos de Leishmaniasis según informó el Sistema Nacional de Vigilancia en Salud Pública (SIVIGILA) para el año 2015. Esta complicación es de gran impacto en la población por ser altamente deformante e incapacitante. La presentación de la complicación LM es considerada de origen multifactorial, involucrando componentes asociados tanto al huésped como al parásito. Actualmente una hipótesis que ha tomado fuerza para explicar las complicaciones de la LC, ya sea la falla terapéutica y/o el compromiso a nivel mucoso, es la infección del parásito infectante por un virus de familia Totiviridae y género Leishmaniavirus. Este virus podría estar involucrado en una exacerbación de la respuesta inmune y la persistencia del parásito en los macrófagos. Sin embargo las frecuencias reportadas del virus varian entre 0 y e 87% en los pacientes con LM o LC en falla terapéutica, hecho que refleja una alta variablidad en la presencia del virus que puede deberse a multiples factores incluyendo componenetes técnicos asociados a la muestra y el método usado para la detección viral. El presente estudio pretendió determinar la frecuencia con la que se detecta el virus en una serie de biopsias y aislamientos parasitarios provenientes de pacientes con LM o LC en falla terapéutica. Lo anterior fue posible mediante la combinación de técnicas de RTPCR y RT-qPCR que han sido descritas de manera individual en la detección de los virus pertenecientes a este género. Se describen los hallazgos obtenidos al analizar un total de 31 muestras clinicas: 10 biopsias de pacientes con LM, 6 aislamientos parasitarios a partir de lesiones mucosas y 15 aislamientos parasitarios a partir de pacientes que presentaron falla terapéutica o recidiva al tratamiento con Glucantime®. Se construyó un algoritmo diagnóstico que permitió detectar el virus en el 56.67% del total de las muestras analizadas, las cuales estaban infectadas por parásitos de la especie L. (V.) braziliensis, L. (V.) panamensis y Leishmania sp. y no se detectó un patrón de distribucion geográfico predominante. En los aislamientos parasitarios asociados a la falla terapéutica o recidiva en las lesiones cutáneas tratadas con Glucantime®, la presencia viral no se relacionó con el porcentaje de infectividad ni con la sensibilidad “in vitro” de los amastigotes intracelulares al Glucantime® Abstract. Parasites from leishmania genus are associated with pleiomorphic human disease with visceral or cutaneous manifestations. The clinical behaviour of the disease depends on host’s factors and on parasites species. Leishmania genus has a worldwide distribution on tropical regions, however the species circulating at the Old world have differences with those found at the New world, particularly with species grouped into the Leishmania Viannia subgenus. Those last are predominant in South America where they generate complicated cutaneous forms of the diseases as mucosal (ML) form and non-responding cutaneous leishmaniasis (NRCL) without parasite resistance. The occurrence of the above-mentioned complications could be associated with the presence of a cytoplasmic virus in the infecting parasite, known as Leishmania RNA virus (LRV1). However the frequency of the virus in clinical samples ranges from 0 to 87% without regular data that strongly support association. Those apparent inconsistent results could obey to: the use of a diverse sort of experimental approaches, overlooking the parasite species factor and the type of clinical samples that had been analysed. In order to avoid detection bias when looking for LRV1 in clinical samples, the present study used complementary approaches to assurance the reliability in the LRV1 frequency informed. Taking into the account the parasites species and looking for differences in the result when the source sample corresponds with isolates parasite of with lesion biopsies. Also to determine the impact of the LRV-1-infection on the amastigote fitness, the percentage of infections on human macrophages has been assessed as their in vitro susceptibility to the first choice drug in South America for this parasite, Glucantime®. 31 samples were analysed from different clinical background 16 samples from patients with ML (10 biopsies and 6 isolates), 15 from patients with NRCL and 1 reference isolate. Analysing data by type of approach LRV1 observed frequencies were in RT-PCR and RTqPCR: 42.86%. Nested PCR: 88.8%. By clinical condition ML: 73.3%, NRCL: 40%. By type of sample: biopsies: 88.8% and isolates: 42.86%, by parasite species: L. (V.) braziliensis: 76,4%, L. (V.) panamensis: 11,76% y Leishmania sp.: 11,76%. Using One-way ANOVA on ranks, nor differences in Infectivity to the macrophages (p=0.523) neither in Glucantime® susceptibility (p=0.728) were observed between L. braziliensis-LRV1 positive (median value of infectivity 47.7% and of IC50, 120.7 ug/ml) and L. braziliensis-LRV1 negative (median value of infectivity 44.9% and of IC50, 121.6 ug/ml). Suggesting that the presence of the virus does not affect intracellular parasite fitness at least at those levels. Findings from the present study indicate that LRV-1 detection is highly dependent on the type of sample, the parasite load and the experimental approach. They also suggest that LRV1 is associated to L. (V.) braziliensis linked to ML in a higher frequency than to parasites from same species related to NRCL. Also there is a higher detection of the virus in biopsies than in isolates and this was always found in L. (V.) braziliensis but not L. (V.) panamensis. Maestría

El desarrollo de mecanismos de prevención y control de las leishmaniasis se ha dificultado en parte por las pocas opciones terapéuticas y por los vacíos en el conocimiento de la interacción entre el parásito y el hospedero. El parásito posee varios mecanismos para modular la respuesta del macrófago, entre estos, la alteración de la expresión genética del macrófago durante la infección. En un trabajo previo del grupo de investigación, por análisis de microarreglos se reportaron los cambios en la expresión de genes de macrófagos derivados de células U937 infectados durante 72 horas con Leishmania Viannia braziliensis. A partir de estos resultados se seleccionó un grupo de genes para ser validados funcionalmente durante la infección in vitro. El gen RhoB que codifica para una pequeña GTPasa hace parte de un grupo de genes expresados diferencialmente entre macrófagos infectados y no infectados. El control de la expresión de esté gen está relacionado con la síntesis del colesterol, proceso que se ha reportado como alterado durante la infección. El objetivo de este trabajo fue validar de manera cuantitativa los niveles de expresión del gen RhoB en los macrófagos infectados y determinar el efecto del silenciamiento genético de RhoB sobre el fenotipo de infección, medido éste como carga parasitaria y porcentaje de infección en los macrófagos infectados con L. (V.) braziliensis. Los niveles de expresión del gen RhoB fueron medidos por PCR en tiempo real en macrófagos entre las 0 y las 120 horas después de la infección in vitro, con el fin de describir la cinética de expresión del gen durante la infección. Posteriormente, se utilizó transducción lentiviral para generar líneas celulares derivadas de U937 con expresión constitutiva de shRNAs dirigidos contra RhoB. El silenciamiento de RhoB y la cantidad de RhoB-activa en las líneas celulares fue determinado por western blot y ensayo de pull-down. Las líneas celulares con mayor nivel de silenciamiento fueron infectadas in vitro para determinar mediante tinción fluorescente y análisis de imágenes el efecto del silenciamiento sobre el porcentaje de infección y la carga parasitaria. Los resultados evidenciaron que el gen RhoB no presenta cambio en su expresión en los macrófagos entre las 0 y las 24 horas después de la infección, pero si se sobre-expresa entre las 48 y las 96 horas, resultados concordantes con los obtenidos previamente con microarreglos. Mediante la evaluación funcional usando shRNAs se encontró que el silenciamiento de RhoB se asocia con reducción en la carga parasitaria y en el porcentaje de infección in vitro. Estos resultados permiten preguntarse si la expresión del gen RhoB podría relacionarse con el establecimiento de la infección, teniendo cuenta que el intervalo de tiempo en que se sobre-expresa el gen coincide con el intervalo reportado en el que los amastigotes se multiplican activamente en el macrófago. Abstract: The development of mechanisms for prevention and control of leishmaniasis has been hampered in part by the few therapeutic options and gaps in the knowledge of the interaction between the parasite and the host. The parasite has several mechanisms to modulate macrophage response, among these, altered macrophage gene expression during infection. In a previous work of the research group, were reported the changes in the expression of genes derived macrophages infected U937 cells for 72 hours with Leishmania Viannia braziliensis by microarray analysis. From these results, a group of genes to be functionally validated for in vitro infection was selected. The RhoB gene encodes a small GTPase is part of a group of genes differentially expressed between infected and uninfected macrophages. The expression controlling of this gene it is associated with cholesterol synthesis, a process that has been reported as altered during infection. The aim of this study was to quantitatively validate the levels of RhoB gene expression in infected macrophages and determine the effect of RhoB gene silencing on the phenotype of infection, measured as parasite load and percentage of infection in L. (V.) braziliensis infected macrophages. The expression levels of the RhoB gene were measured by real-time PCR in macrophages between 0 and 120 hours after in vitro infection, in order to describe the kinetics of gene expression during infection. Subsequently, lentiviral transductions were used to generate cell lines derived from U937 with constitutive expression of shRNAs directed against RhoB. RhoB silencing and the amount of RhoB-active in the cell lines was determined by western blot and pull-down assay. Cell lines with higher silencing was infected in vitro to determine the effect on the rate of infection and parasite load by fluorescent staining and image analysis silencing. The results showed that RhoB was not change in gene expression in macrophages between 0 and 24 hours after infection, but is over-expressed between 48 and 96 hours, consistent with the results previously obtained by microarrays. The RhoB gene silencing was associated with reduction in parasite load and percentage of in vitro infection. These results raise the question whether RhoB gene expression could be related to the establishment of infection, taking account that the time interval in which over-expresses the gene matches the reported range in which they thrive amastigotes in macrophage. Maestría

Investigaciones sobre la expresión genética de macrófagos infectados por diferentes especies de Leishmania en diferentes modelos celulares, han identificado a las metalotioneinas como genes modulados positivamente durante la infección, implicándolas en el proceso. Sin embargo, estos estudios de expresión genética no han validado la presencia de MT a nivel de proteína durante la infección. En la presente investigación se evaluó por medio de inmunofluorescencia, la dinámica de expresión proteica de las metalotioneinas en macrófagos derivados la línea celular U937 (Macrófago U937) no infectados e infectados con Leishmania braziliensis, a las 0h, 24h, 48h y 72h post-infección. Además, se determinó por medio de RT-PCR, cuales isoformas de metalotioneina son expresadas en los macrófagos U937 no infectados e infectados por Leishmania braziliensis. Se mostró la presencia de MT a nivel de proteína en los macrófagos U937 infectados, sobre los cuales se encontró diferencia en los niveles de expresión respecto de los macrófagos U937 no infectados. También, se identificó un patrón de distribución caracterizado por un aumento en la intensidad de fluorescencia de MT sobre lo que posiblemente corresponde al cuerpo del parasito dentro del citoplasma de los macrófagos U937 infectados. Este patrón de distribución se denominó fenotipo tipo vesicular. Además, se identificó las isoformas de metalotioneina expresadas en macrófagos U937 no infectados e infectados por Leishmania braziliensis: MT1E, MT1F, MT1G, MT1X y MT2A. Finalmente, se diseñaron shRNAs para silenciamiento simultaneo y específico para cada una de las MTs expresadas en macrófagos U937 infectados por Leishmania braziliensis. Los resultados obtenidos sugieren que las metalotioneinas están involucradas durante la infección por L. braziliensis. Abstract. Studies on gene expression in macrophages infected by different Leishmania species have been identified the metallothionein genes modulated positively during infection involving them in the process. However, these gene expression studies were not validated the presence of MT protein level during infection. In the present investigation was assessed by immunofluorescence , the dynamics of protein expression of metallothioneins in macrophage -derived cell line U937 (macrophage U937) uninfected and infected with Leishmania braziliensis , at 0h , 24h, 48h and 72h post- infection . In addition , it was determined by RT -PCR, which metallothionein isoforms are expressed in the macrophages U937 infected and uninfected by Leishmania braziliensis. This investigation showed the presence of MT protein level in infected U937 macrophages for which differences were found in the expression levels compared to the uninfected U937 macrophages. Distribution pattern characterized by an increase in fluorescence intensity of MT on possibly corresponds to the body of the parasite within the cytoplasm of macrophages infected U937 are also identified. This distribution pattern is called phenotype like vesicule. Also, metallothionein isoforms expressed in U937 macrophages uninfected and infected by Leishmania braziliensis was identified: MT1E, MT1F, MT1G, MT1X and mT2a. Finally, shRNAs were designed for simultaneous and specific to each of the MTs expressed in macrophages infected with Leishmania braziliensis U937 silencing. The results suggest that metallothioneins are involved during infection by L. braziliensis. Maestría