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Orientador: Alessandra Alves de Souza Tese (doutorado) - Universidade Estadual de Campinas, Instituto de Biologia Resumo: As plantas apresentam receptores de membrana que são capazes de reconhecer padrões moleculares associados ao patógeno/microrganismo (PAMPs/MAMPs), os quais são cruciais para a ativação do sistema imune. O receptor EFR, restrito a família das Brassicaceae, é um dos receptores de reconhecimento de padrões (PRR) mais bem estudado. Esse receptor quinase com repetições ricas em leucina em seu domínio extracelular (LRR-RK) é capaz de perceber a proteína ET-Tu das bactérias e seu epítopo elf18. A transferência desse receptor para outras espécies revelou a possibilidade de aumentar a resistência a bacterioses em culturas como tomate, arroz, trigo e batata. Diante disso, foram desenvolvidas variedades de laranja doce superexpressando o gene EFR para conferir resistência em amplo espectro a duas das principais doenças bacterianas de citros, cancro cítrico e clorose variegada dos citros (CVC). As linhagens transgênicas foram capazes de reconhecer os peptídeos elf18Xcc e elf26Xf derivados das bactérias Xanthomonas citri e Xylella fastidiosa, respectivamente, ativando o sistema imune da planta. Além da ativação de espécies reativas de oxigênio (ROS), indução de MAPK e de genes de defesa, foi possível verificar gradual aumento da resistência ao cancro cítrico e CVC em alguns eventos em comparação com o wild-type (WT). Nesse trabalho, também foram realizadas análises in silico de um candidato a receptor LRR-RK altamente expresso em Citrus reticulata (resistente a CVC). Os resultados mostraram que o receptor putativo CrLRR-RK e seu ortólogo em Citrus sinensis (espécie suscetível) codificam proteínas com domínios conservados. Contudo, existem substituições de aminoácidos entre elas que sugerem mudanças conformacionais na estrutura tridimensional das proteínas, de acordo com a predição do modelo proteico gerado pelo I-Tasser. Isso poderia explicar as diferenças no reconhecimento de patógeno por laranja doce e tangerina, sendo um indicativo de que CrLRR-RK está associado ao reconhecimento de PAMPs derivados de X. fastidiosa. Para provar essa hipótese, foram produzidas plantas de Arabidopsis expressando CrLRR-RK e receptores quiméricos entre CrLRR-RK e o receptor FLS2. Essas plantas darão suporte a estudos futuros para comprovar empiricamente a funcionalidade desse receptor e buscar por PAMPs capazes de se ligarem ao domínio extracelular da proteína. Também foram produzidas variedades comerciais de laranja doce expressando o gene CrLRR-RK na tentativa de se obter maior nível de tolerância a patógenos bacterianos de citros. Juntos, esses resultados indicam que a utilização de receptores LRR-RK é uma estratégia que possui grande potencial para aumentar a resistência em amplo espectro em citros e futuramente poderão suportar os programas de melhoramento genético Abstract: Plants employ cell surface receptors that recognize pathogen (or microbe)-associated molecular patterns (PAMPs/MAMPs), which are crucial for immune system activation. The EFR receptor, restrict to the Brassicaceae family, is one of the well-studied pattern recognition receptors (PRR). This leucine-rich repeat receptor kinase (LRR-RK) is capable to recognize the widely conserved bacterial PAMP EF-Tu and its derived peptide elf18. The interfamily transference of the EFR receptor revealed the possibility to increase crop disease resistance in species such as tomato, rice, wheat and potato. Here, we developed sweet orange varieties expressing EFR to confer broad-spectrum resistance, focused on the to two major citrus bacterial diseases citrus canker and citrus variegated chlorosis (CVC). The transgenic lines were able to sense elf18Xcc and elf26Xf derived peptides from Xanthomonas citri and Xylella fastidiosa, respectively, activating the immune system of the plant. A quick oxidative burst was detected, followed by MAPK activation and induction of defense marker genes. In addition, it was possible to verify a gradual increase of resistance to citrus canker and CVC and a greater capacity to control bacterial growth in some transgenic lines compared to the wild type (WT). Here, we also performed in silico analyzes of an overexpressed LRR-RK receptor on Citrus reticulata (CVC resistant). The results showed that the putative receptor CrLRR-RK and its ortholog in Citrus sinensis (susceptible species) encode conserved domain proteins. However, there are amino acid substitutions between them that led to conformational changes in the 3D structure of proteins, according to the protein model generated by I-Tasser. This would explain the differences in pathogen recognition by sweet orange and mandarin, indicating that CrLRR-RK is associated with the recognition of X. fastidiosa-derived PAMPs. To prove this hypothesis, Arabidopsis plants expressing CrLRR-RK and chimeric receptors between CrLRR-RK and the FLS2 receptor were produced. These plants will support future studies to empirically prove the receptor functionality and seek for PAMPs capable of binding in the extracellular domain. We also produced commercial varieties of sweet orange expressing the CrLRR-RK gene in order to obtain a higher level of tolerance against citrus bacterial pathogens. Together, these results indicate that the use of LRR-RK receptors is a strategy that has great potential for increasing broad-spectrum resistance in citrus and hereafter support breeding programs Doutorado Genética Vegetal e Melhoramento Doutora em Genética e Biologia Molecular CAPES CNPQ 208406/2017; 142014/2015-0

Submitted by Boris Flegr (boris@uerj.br) on 2021-01-07T15:14:11Z No. of bitstreams: 1 TESE_FINAL_PUBLICADA_Thais_Bezerra_Ferreira.pdf: 14103897 bytes, checksum: dc92fed50b3a2044f991ca570e4d454d (MD5) Made available in DSpace on 2021-01-07T15:14:11Z (GMT). No. of bitstreams: 1 TESE_FINAL_PUBLICADA_Thais_Bezerra_Ferreira.pdf: 14103897 bytes, checksum: dc92fed50b3a2044f991ca570e4d454d (MD5) Previous issue date: 2017-10-06 Coordenação de Aperfeiçoamento de Pessoal de Nível Superior Multiple sclerosis is an autoimmune, demyelinating disease, of the Central Nervous System, in which the onset and severity depends on the influence of environmental factors, including psychological stress and infections, on the immune system of individuals with genetic predisposition to the disease. In light of that, in our first paper, we observed that the in vitro blockage of IL-6 receptor, using anti-IL-6R IgG, reduced the Th17-related cytokines production. In addition, the ability of supernatants from lipolyssacharide (LPS)-activated monocytes cultures, in increasing IL-17 production and reducing IL-10 levels by autologous CD4+ T cells was abolished after neutralization of IL-6R signaling in these phagocytes' cultures. Interestingly, the addition of this monoclonal antibody increased the ability of hydrocortisone in inhibiting proliferation and IL-17 production by CD4+ and CD8+ T cells from MS patients. In our second paper, we observed that the stress-related dopamine levels, by IL-6-depending mechanisms, elevated the cytokine production by CD4+ T cells with an encephalitogenic profile and hydrocortisone-resistance. In our third and last paper, an elevated percentage of circulating CD4+ and CD8+ T cells capable of expressing toll-like receptors (TLR)2, TLR4 and TLR9 was detected in MS patients samples as compared to the control group. Among these cells, the subtypes of CD4+ and CD8+ T lymphocytes able to produce IL-17 with along IL-6 or IFN-gamma were positively related with the number of active brain lesions and the neurological disability. When CD4+ and CD8+ T cells were maintained in the presence of TLR ligands alone, greater levels of Th17-related cytokines were dosed at the supernatants of cell cultures stimulated with the TLR2L, Pam3CSK4. In these cell cultures, the levels of IL-6 and IL-17 in response to Pam3CSK4 were positively related to clinical parameters of the disease. Finally, CD4+ T cells cultures from patients with severe MS symptoms released higher levels of GM-CSF and IFN-gamma. Collectively, our findings suggest that IL-6 has an important role in MS immunopathogenesis and the production of this cytokine, as well as others Th17-related ones, are increased by dopamine and different PAMPs. The findings obtained here help not only to explain how psychological stress and infectious diseases are considered risk factors for MS, but they offer information that could aid in the development of new therapeutic strategies. A esclerose múltipla (EM) é uma doença desmielinizante, de caráter autoimune, do sistema nervoso central, cujo o desenvolvimento e gravidade dependem da influência de fatores ambientais, incluindo estresse psicológico e infecções, no sistema imune de indivíduos com predisposição genética para a doença. Os mecanismos pelos quais esses fatores impactam negativamente na EM podem estar relacionados ao favorecimento de vias de ativação e expansão de clones de linfócitos T encefalitogênicos. Diante do exposto, em nosso primeiro artigo, observamos que o bloqueio in vitro do receptor de IL-6 reduziu a produção de citocinas relacionadas ao perfil Th17. Ademais, a capacidade dos sobrenadantes de monócitos, ativados com lipopolissacarídeo (LPS), em potencializar a produção da IL-17 e reduzir os níveis de IL-10 pelas células T CD4+ de pacientes com EM foi anulada após a neutralização da sinalização via IL-6R nas culturas desses fagócitos. De forma interessante, a adição desse anticorpo monoclonal potencializou a capacidade da hidrocortisona (HC) em inibir a proliferação e produção de IL-17 pelas células T CD4+ e T CD8+ dos pacientes com EM. No segundo artigo, nós observamos que níveis de dopamina relacionados ao estresse, por mecanismos dependentes da IL-6, elevaram a produção de citocinas por células T CD4+ com perfil encefalitogênico e resistentes à HC. Em nosso último artigo, elevada percentagem de células T CD4+ e T CD8+ circulantes capazes de expressar receptores do tipo Toll (TLR)2, TLR4 e TLR9 foram detectadas no sangue periférico dos pacientes com EM quando comparado ao grupo controle. Dentre essas células, os subtipos de células T CD4+ e T CD8+ capazes de produzir simultaneamente IL-17 com IL-6 ou com IFN-γ foram diretamente associados ao número de lesões cerebrais ativas e grau de incapacidade neurológica. Quando as células T CD4+ e T CD8+ foram mantidas na presença apenas de ligantes de TLR (TLR-L), maiores níveis de citocinas relacionados ao fenótipo Th17 foram dosados nos sobrenadantes recolhidos nas culturas estimuladas com TLR2-L, o Pam3CSK4. Nessas culturas, os níveis de IL-6 e IL-17 em resposta ao Pam3CSK4 foram diretamente correlacionados aos parâmetros clínicos da doença. Finalmente, culturas de células T CD4+ dos pacientes com EM mais grave responderam ao agonista de TLR2 liberando elevados níveis de GM-CSF e IFN-γ. Coletivamente, nossos achados sugerem que a IL-6 exerce um papel importante na imunopatogênese da EM, sendo a produção dessa citocina, assim como de outras relacionadas a diferentes subtipos de células Th17, elevada pela dopamina e diferentes padrões moleculares associados a patógenos. Os achados obtidos aqui ajudam não apenas a explicar como o estresse psicológico e doenças infecciosas são considerados fatores de risco para a EM, como também podem ajudar na criação de novas estratégias terapêuticas.

Coordenação de Aperfeiçoamento de Pessoal de Nível Superior Durante a interação com as plantas hospedeiras, os fungos causadores de ferrugens secretam e translocam diversas proteínas efetoras para o citoplasma das células vegetais, onde atuam suprimindo as respostas de defesa e promovendo o parasitismo. Em estudos prévios foram identificados genes candidatos a efetores em Hemileia vastatrix (HvECs) que codificam proteínas secretadas com funções desconhecidas. Visando entender o papel dessas proteínas secretadas na patogênese da ferrugem do cafeeiro, o presente trabalho teve como objetivo o estudo funcional de 54 candidatos a efetores do isolado monopostular de H. vastatrix HV-01 (raça II), avaliando-se a sua capacidade de suprimir a imunidade ativada por padrões moleculares conservados (PAMPs) da bactéria não patogênica Pseudomonas fluorescens em Nicotiana benthamiana. Essa resposta de imunidade, denominada PTI (PAMP-Triggered Imunnity), é a primeira linha de defesa induzida que as plantas utilizam para resistir ao ataque de patógenos. As sequências dos 54 genes que codificam as potenciais proteínas efetoras foram clonadas individualmente no vetor de expressão pEDV6 (Effector Delivery Vector) e os plasmídeos recombinantes foram transferidos para P. fluorescens EtHAn (Effector to Host Analyser) (Pf EtHan), que possui um sistema de secreção tipo III (SST3) capaz de translocar as proteínas codificadas pelos genes candidatos para o citoplasma de N. benthamiana. Desesseis proteínas efetoras apresentaram capacidade de suprimir PTI com alta reprodutibilidade em diferentes experimentos de co-infiltração de Pf EtHAn com a bactéria patogênica P. syringae pv. tomato DC3000 em N. benthamiana. A supressão de PTI por um gene candidato (HvEC_064) foi confirmada analisando-se o crescimento populacional de Pst DC3000 e morte celular nos tecidos infiltrados onde ocorreu, ou não, a supressão de PTI e ativação de imunidade desencadeada pelo reconhecimento de efetores dessa bactéria. Pode-se postular, com base nesses estudos, que os efetores de H. vastatrix com atividade supressora de PTI em N. benthamiana são prováveis efetores citoplasmáticos. Esses efetores serão priorizados em estudos futuros visando a identificação de genes de avirulência desse fungo e dos seus alvos nas células do cafeeiro. During the interaction with host plants, rust fungi secrete and translocate several effector proteins into the cytoplasm of plant cells to suppress defence responses and promote parasitism. Previous studies have identified genes in Hemileia vastatrix that encode effectors with unknown functions. In order to understand the role of these effectors in the pathogenesis of coffee rust, this study aimed the functional analysis of 54 candidate effectors from the monopustular isolate of Hemileia vastatrix HV 01 (race II), by evaluating their ability to suppress Pathogen Associated Molecular Patterns (PAMPs) responses triggered by the nonpathogenic bacteria Pseudomonas fluorescens in Nicotiana benthamiana. This immune response, known as PTI (PAMP-Triggered Immunity), is the first line of induced defenses used by plants to resist pathogen attack. Gene sequences encoding the 54 putative effectors were individually cloned into pEDV6 (Effector Delivery Vector) vector. The recombinant plasmids were transferred to P. fluorescens EtHAn (Effector to Host Analyser) (Pf EtHan), which has a type III secretion system (T3SS) able to translocate the proteins encoded by the candidate genes into the cytoplasm of N. benthamiana. Sixteen candidate effector genes suppressed PTI with high reproducibility in different co-infiltration experiments of Pf EtHAn with the pathogenic bacterium P. syringae pv. tomato DC3000 in N. benthamiana. The suppression of PTI by a candidate gene (HvEC_064) was confirmed by analysing Pst DC3000 population growth and cell death in the infiltrated tissues where PTI was suppressed. The effectors of H. vastatrix with suppressive activity of PTI identified are likely cytoplasmic effectors. These effectors will be further investigated in future studies aimed to identify avirulence genes of this fungus and its targets in coffee plant cells.

Orientadores: Alessandra Alves de Souza, Marco Aurélio Takita Tese (doutorado) - Universidade Estadual de Campinas, Instituto de Biologia Resumo: Receptores de reconhecimento de padrões (PRRs) apresentam grande importância na defesa das plantas contra microrganismos pela capacidade de reconhecerem padrões moleculares associados a patógenos (PAMPs) em início de infecção e desencadearem respostas de imunidade inata (PTI). A ativação de PTI permite conferir resistência contra uma ampla gama de microrganismos e, assim, a identificação e compreensão do papel das PRRs é de grande relevância em estudos que visam resistência contra patógenos. As espécies de Citrus apresentam elevado interesse comercial, porém seu cultivo tem sido severamente prejudicado devido às inúmeras doenças causadas por fitopatógenos, como por exemplo, a clorose variegada dos citros causada pela bactéria Xylella fastidiosa. Assim, considerando que a maioria das PRRs identificadas em plantas pertence à família de quinases com repetições ricas em leucina (LRR-RLKs), um dos objetivos desse trabalho foi analisar os aspectos evolutivos das LRR-RLKs no genoma de espécies de Citrus de grande importância econômica, Citrus clementina e Citrus sinensis. O alinhamento múltiplo de sequências conservadas de quinase e a reconstrução de árvores filogenéticas estimadas por máxima verossimilhança permitiu identificar 300 e 297 LRR-RLKs nos proteomas preditos de C. clementina e C. sinensis, respectivamente. As LRR-RLKs de ambas as espécies foram classificadas em 16 subgrupos (I a XVI) e a partir de uma análise mais detalhada do subgrupo XII, que inclui os principais PRRs identificados em plantas, foi verificada uma grande expansão e clusterização nos genomas de Citrus, o que demonstra a importância de eventos de duplicação em tandem na evolução das LRR-XII em Citrus. Além das análises in sillico, neste trabalho também foi avaliado o papel do receptor de EF-Tu (EFR) no reconhecimento de X. fastidiosa. Mutantes de Arabidopsis thaliana com EFR silenciado (efr-1) foram inoculados com X. fastidiosa e, a partir de PCR quantitativo em tempo real (qRT-PCR), foi verificado um aumento significativo da população bacteriana em efr-1 durante todo o experimento, quando comparado com as plantas selvagens (WT). Em 15 dias após inoculação (DAI), foi observada uma população bacteriana quase dez vezes maior nos tecidos das plantas efr-1. Análises por microscopia de fluorescência confirmaram a elevada colonização bacteriana nos tecidos das plantas efr-1. A importância do EFR no reconhecimento de X. fastidiosa foi avaliada também pela superexpressão de AtEFR em plantas hospedeiras de tabaco, as quais apresentam susceptibilidade a X. fastidiosa. Vinte plantas transgênicas foram identificadas por PCR convencional e a expressão do transgene EFR foi confirmada em seis eventos por qRT-PCR. Análises por western blot confirmaram a presença da proteína heteróloga e a maior produção de ROS verificada em presença dos epítopos elf18 de X. fastidiosa, E. coli e Xanthomonas citri subsp. citri indicam ativação de PTI nas plantas transgênicas de tabaco. A redução significativa na incidência de sintomas nas plantas transgênicas inoculadas com X. fastidiosa demonstra que EFR conferiu ao tabaco maior resistência à infecção bacteriana. Os resultados obtidos em Arabidopsis e tabaco indicam que EFR pode ser uma boa estratégia para transformar espécies susceptíveis de Citrus visando resistência contra X. fastidiosa e X. citri Abstract: Pattern recognition receptors (PRRs) are very important in plant defense against microorganisms because they are able to recognize pathogen-associated molecular patterns (PAMPs) in early infection process triggering innate immune responses (PTI). Activation of PTI confers resistance against a wide range of microorganisms and studies involving the identification and functional role of PRRs are of great importance. Citrus crops have great commercial importance worldwide; however, the productivity has decreased due to several diseases that affect this culture, such as citrus variegated chlorosis, caused by Xylella fastidiosa. Since most identified PRRs in plants belong to the leucine-rich repeat receptor-like kinases family (LRR-RLKs), one of the goals of this study was to analyze the evolutionary aspects of LRR-RLKs in economically important citrus species, Citrus clementina and Citrus sinensis. The multiple alignment of conserved kinase sequences and the reconstruction of phylogenetic trees estimated by maximum-likelihood identified 300 and 297 LRR-RLKs in the predicted proteomes of C. clementina and C. sinensis species, respectively. The LRR-RLKs from both species were classified into 16 sub-groups (I to XVI) and further analysis in the subgroup XII, which includes the main PRRs identified in plants, showed a large expansion and clustering in the Citrus genome, which demonstrates the importance of tandem duplication in the evolution of LRR-XII in Citrus. In addition to the in silico analysis, in this study we also evaluated the role of EF-Tu receptor (EFR) in the recognition of X. fastidiosa. Arabidopsis thaliana efr-1 mutants were inoculated with X. fastidiosa, and using quantitative real-time PCR (qRT-PCR) we verified a significant increase of bacterial population in efr-1, during the time-course of infection, compared to the wild type (WT). At 15 days after inoculation (DAI) the bacterial population was almost ten times more in the efr-1 tissues in relation to WT. Fluorescence microscopy analysis confirmed the high bacterial colonization in the tissues of efr-1 plants. The importance of EFR in X. fastidiosa recognition was also evaluated by the overexpression of AtEFR in tobacco host plants, which are susceptible to X. fastidiosa. Twenty transgenic events were identified by conventional PCR and the expression of the EFR transgene was confirmed in six lines by qRT-PCR. Western blot analysis confirmed the presence of the heterologous protein and the increased ROS production observed in the presence of elf18 epitopes from X. fastidiosa, E. coli and Xanthomonas citri subsp. citri indicate PTI activation in the tobacco transgenic plants. The significant reduction in the incidence of symptoms in transgenic plants inoculated with X. fastidiosa showed that EFR increased the tolerance against the bacteria infection. The results obtained from A. thaliana and tobacco indicate that EFR could be a good strategy to transform Citrus plants aiming X. fastidiosa and X. citri resistance Doutorado Genética Vegetal e Melhoramento Doutor em Genética e Biologia Molecular FAPESP 2013/01412-0