Search

Aquaporins (AQPs), a family of ubiquitous water channels divided into orthodox AQPs, aquaglyceroporins (GLPs), and superAQPs, are present in stallion spermatozoa. The aim of this study was to elucidate the functional relevance of each group of AQPs during stallion sperm cryopreservation through the use of three different inhibitors: acetazolamide (AC), phloretin (PHL) and propanediol (PDO). Sperm quality and function parameters were evaluated in the presence or absence of each inhibitor in fresh and frozen-thawed samples. In the presence of AC, different parameters were altered (p < 0.05), but not in a concentration- or time-depending manner. PHL was found to decrease sperm motility, viability, acrosome integrity, and the percentages of spermatozoa with low membrane lipid disorder, high mitochondrial membrane potential (MMP) and high intracellular levels of calcium and superoxides (p < 0.05). Finally, the sperm motility, viability, acrosome integrity, the percentages of spermatozoa with low membrane lipid disorder, high MMP and high intracellular calcium levels were higher (p < 0.05) in PDO treatments than in the control. The sperm response to AC, PHL and PDO indicates that GLPs, rather than orthodox AQPs, play a crucial role during stallion sperm cryopreservation. Furthermore, post-thaw sperm quality was higher in PDO treatments than in the control, suggesting that this molecule is a potential permeable cryoprotectant This research was funded by the Ministry of Science, Innovation and Universities, Spain (Grants: RYC-2014-15581, AGL2017-88329-R and PRE2018-083488), and the Regional Government of Catalonia, Spain (2017-SGR-1229)

El plasma seminal representa un important i actiu contribuent a la fertilitat dels mamífers. Entre els components del plasma seminal s’hi troben els antioxidants enzimàtics i no enzimàtics que modulen la producció d’espècies reactives d’oxigen. L’estrès oxidatiu, induït per un equilibri incorrecte entre els antioxidants i la producció de ROS, perjudica la funcionalitat espermàtica. D’aquesta manera, el plasma seminal representa el sistema de defensa més important quant a la prevenció dels danys que aquestes espècies d’oxigen provoquen en els espermatozoides. Tot i això, es sol recomanar l’eliminació del plasma seminal com a pas previ a la conservació dels espermatozoides, atès que la presència d’aquest fluid pot ser perjudicial per la longevitat dels gàmetes. En aquest context, l’objectiu principal d’aquesta Tesi Doctoral va ser determinar la importància dels enzims antioxidants del plasma seminal per l’estratègia reproductiva dels èquids. D’una banda, es va observar que les activitats de la superòxid dismutasa (SOD), la catalasa (CAT), la glutatió peroxidasa (GPX) i la glutatió reductasa (GSR) en el plasma seminal dels rucs eren molt més altes que en el dels cavalls. Curiosament, les activitats de SOD i GPX del plasma seminal van mostrar variacions estacionals en els rucs, però no en els cavalls. D’altra banda, i atès que s’està produint un augment de la demanda de semen congelat dels èquids i que cap estudi previ ha abordat la relació entre les activitats d’aquests quatre enzims i la capacitat dels espermatozoides de resistir a la criopreservació, els estudis segon i tercer van avaluar la relació entre les activitats dels enzims SOD, CAT, GPX i GSR, presents en el plasma seminal, i la criotolerància dels espermatozoides de ruc i cavall. Es va observar que l’activitat específica de la SOD en el plasma seminal està relacionada amb la criotolerància dels espermatozoides de rucs i cavall. Atès que estudis previs han demostrat que el plasma seminal modula la producció espermàtica de ROS en diferents espècies de mamífers, va estudiar si la presència del plasma seminal és capaç de controlar la generació espermàtica de ROS en condicions d’estrès oxidatiu induït pel peròxid d’hidrogen. Sorprenentment, es va observar que el contacte perllongat del plasma seminal amb els espermatozoides de ruc té un efecte limitat a l’hora de contrarestar l’estrès oxidatiu induït exògenament en aquests gàmetes. Finalment, la selecció d’espermatozoides, que comporta l’eliminació dels components del plasma seminal, s’està convertint en una tecnologia important dins l’àmbit de la reproducció assistida equina. Per tant, l’últim objectiu d’aquesta Tesi Doctoral va ser investigar els efectes de la centrifugació amb una sola fase/capa (SLC) mitjançant Equicoll sobre els paràmetres de qualitat del espermatozoides de ruc i les seves interaccions amb el tracte reproductor femení. Tot i que la selecció amb Equicoll va millorar els percentatges de viabilitat espermàtica després de la selecció, l’impacte sobre els paràmetres de motilitat va ser molt limitat. A més, l’extracció dels components del plasma seminal mitjançant Equicoll va augmentar la fagocitosi dels espermatozoides per part dels neutròfils, la qual cosa confirma que el plasma seminal modula la interacció entre els gàmetes masculins i aquestes cèl·lules immunitàries. En conclusió, aquesta Tesi Doctoral indica que, encara que les activitats dels antioxidants del plasma seminal difereixen entre cavalls i rucs, la SOD és, en ambdues espècies, un bon predictor de la capacitat dels espermatozoides de resistir a la criopreservació. A més, aquesta Tesi Doctoral també ha demostrat que el paper modulador del plasma seminal és més evident quant a la interacció entre els espermatozoides de burro i els neutròfils, que respecte a l’estrès oxidatiu induït en els gàmetes masculins d’aquesta espècie pel peròxid d’hidrogen. El plasma seminal representa un importante y activo contribuyente para la fertilidad de los mamíferos. Entre los componentes del plasma seminal se encuentran los antioxidantes enzimáticos y no enzimáticos que modulan la producción de especies reactivas de oxígeno. El estrés oxidativo, inducido por un equilibrio incorrecto entre los antioxidantes y la producción de ROS, perjudica las funciones del espermatozoide. De esta manera, el plasma seminal representa el sistema de defensa más importante capaz de prevenir los daños que dichas especies reactivas de oxígeno pueden provocar en los espermatozoides. A pesar de ello, se suele recomendar la eliminación del plasma seminal como paso previo a la conservación de los espermatozoides, ya que la presencia de este fluido puede ser perjudicial para la longevidad de los gametos. El objetivo principal de esta Tesis Doctoral fue determinar la importancia de los enzimas antioxidantes del plasma seminal en la estrategia reproductiva de los equinos. Se observó que las actividades de la superóxido dismutasa (SOD), la catalasa (CAT), la glutatión peroxidasa (GPX) y la glutatión reductasa (GSR) en el plasma seminal de burros eran mucho más altas que en el de caballos. Curiosamente, las actividades de SOD y GPX en el plasma seminal mostraron variaciones estacionales en los burros, pero no en los caballos. Por otro lado, debido a que la demanda de semen congelado en la industria equina está aumentando, y que ningún estudio previo abordó la relación entre las actividades de estos cuatro enzimas y la capacidad de los espermatozoides de resistir a la congelación, los estudios segundo y tercero evaluaron la relación entre las actividades de SOD, CAT, GPX y GSR en el plasma seminal fresco y la criotolerancia de los espermatozoides de burro y caballo. Se encontró que la actividad específica del SOD en el plasma seminal está relacionada con una mejor tolerancia de los espermatozoides a la congelación tanto en caballos como en burros. Basándose en estos resultados. Dado que otros estudios previos han observado que el plasma seminal modula la producción de ROS por parte de los espermatozoides en distintas especies de mamíferos, se estudió si la presencia de plasma seminal es capaz de controlar la generación espermática de ROS en condiciones de estrés oxidativo inducido por la adición de peróxido de hidrógeno. Sorprendentemente, se observó que el contacto prolongado de los espermatozoides de burro con el plasma seminal tiene un efecto compensatorio limitado en cuanto a los respuesta de aquéllos al estrés oxidativo inducido exógenamente. Por último, la selección de los espermatozoides, que comporta la eliminación de los componentes del plasma seminal, se está convirtiendo en una tecnología prominente en el ámbito de la reproducción asistida equina. Por consiguiente, se investigó los efectos de la centrifugación con una sola fase/capa (SLC) mediante Equicoll sobre los parámetros de calidad de los espermatozoides de burro y sus interacciones con el tracto reproductivo femenino. Aunque la selección con Equicoll mejoró los porcentajes de viabilidad espermática después de la selección, el impacto sobre los parámetros de motilidad fue mínimo. Además, la extracción de los componentes del plasma seminal mediante Equicoll aumentó la fagocitosis de los espermatozoides por los neutrófilos. En conclusión, aunque las actividades de los antioxidantes seminales difieren entre caballos y burros, la SOD parece ser, en ambas especies, un buen predictor de la capacidad de los espermatozoides en resistir a la congelación. Además, se demostró que el papel modulador del plasma seminal es más evidente respecto a la interacción entre los espermatozoides de burro y los neutrófilos, que en cuanto a la respuesta de aquéllos al estrés oxidativo inducido por el peróxido de hidrógeno. Seminal plasma represents an important and active contributor to mammalian fertility. Specific components of seminal plasma are adsorbed onto the surface of ejaculated spermatozoa while they pass through the male reproductive tract and provide sperm cells with the ability to reach and fertilize the oocyte. Among the components of seminal plasma, there are enzymatic and non-enzymatic antioxidants that modulate the production of reactive oxygen species (ROS), which are by-products generated during mitochondrial electron transport. Oxidative stress, which is induced by an incorrect balance between antioxidants and ROS production, impairs sperm function. In this context, seminal plasma represents the most important defense system able to prevent the damages that these species exert upon sperm cells. In spite of this, removal of seminal plasma is usually recommended prior to sperm storage, cooled or cryopreserved, as the presence of this fluid may be detrimental for sperm longevity. Against this background, the main aim of this Dissertation was to determine the relevance of the antioxidant enzymes present in seminal plasma for equine reproduction strategies. On the one hand, and as a first objective of this work, we observed much higher activities of superoxide dismutase (SOD), catalase (CAT), glutathione peroxidase (GPX) and glutathione reductase (GSR) in jackass seminal plasma than in that of stallions. Since equids are seasonal breeders, this study also investigated season influence on the antioxidant composition of seminal plasma. Interestingly, activities of SOD and GPX in seminal plasma showed seasonal variations in jackasses but not in stallions. On the other hand, because the demand of cryopreserved semen in the equine industry is increasing and no study had previously addressed whether the activities of these four enzymes are related to sperm cryotolerance, the second and third study evaluated the relationship between SOD, CAT, GPX and GSR activities in fresh seminal plasma and the sperm ability to withstand cryopreservation in these two species. It was found that the specific SOD activity in seminal plasma is related to sperm cryotolerance in both stallions and jackasses. Since seminal plasma has been reported to modulate ROS balance in several mammalian species, this Dissertation also investigated how the presence of seminal plasma modulates ROS generation by jackass spermatozoa under oxidative stress induced exogenously by hydrogen peroxide. With regard to these results, however, prolonged contact of seminal plasma was found to have limited effect against oxidative stress induced exogenously to jackass spermatozoa. Finally, sperm selection is getting prominent in equine assisted reproduction technologies and also leads to the removal of seminal plasma components. The last objective of this study aimed to investigate the effects of single layer centrifugation (SLC) with Equicoll on jackass sperm parameters and its interactions with the female reproductive tract. While SLC-Equicoll was found to increase the percentages of viable spermatozoa after selection, the impact on sperm motility parameters was marginal. In addition, removal of seminal plasma components through SLC-Equicoll increased sperm phagocytosis by polymorphonuclear neutrophils (PMNs), thereby confirming that seminal plasma modulates the interaction between sperm and PMNs. In conclusion, this Dissertation indicates that although the activities of seminal plasma antioxidants differ between stallions and jackasses, SOD appears to be a good predictor of sperm cryotolerance in these two species. In addition, this Dissertation has also demonstrated, for the first time, that the modulating role of seminal plasma with regard to the interaction between jackass spermatozoa and PMNs is more apparent than that observed when oxidative stress is induced by hydrogen peroxide.