Search

Silica and magnetic microspheres in the monodisperse porous form used as a supporting material are synthesized using the multi-step hydrolysis-condensation method. The surface of magnetic silica microspheres was coated with silica shell. The gold nanoparticles synthesized by the Turkevich method were immobilized onto the silica-coated magnetic silica and bare silica microspheres. Surface morphology and size distribution of the microspheres were analyzed by scanning electron microscopy (SEM). The surface atomic composition and the chemical structure were investigated by energy dispersive X-ray spectroscopy (EDX) and X-ray diffraction method (XRD), respectively. The surface area and the pore size distribution were determined by using the nitrogen adsorption and desorption method (BET / Brunauer-Emmett-Teller). The magnetization properties of magnetic microsphere were investigated using vibrating sample magnetometry (VSM). The peroxidase-like activity of the synthesized microspheres was investigated by varying pH, substrate concentration, and the nanozyme concentration. OPD was used as substrate in the peroxidase-like activity measurements. Measurements were made with UV-visible spectrophotometry. Lineweaver-Burk graphs were plotted using OPD utilization rate and substrate concentration values and Michaelis Menten constant (Km) demostrating the affinity between enzyme and substrate was calculated for nanozym structure. Km values of gold nanoparticle immobilized silica coated magnetic silica microspheres and gold nanoparticle immobilized silica microsphere were calculated as 522,47 μM and 816,48 μM. A biosensor was developed for glutathione determination based on the variation of peroxidase-like activity of microsphere depends on glutathione concentation by adsorption glutathione to the surface of the microsphere. Adsorption of glutathione onto the microsphere surface was analyzed using High Performance Liquid Chromatography (HPLC). Glutathione in buffer solution and in human serum were determined using the synthesized nanozymes under appropriate conditions. The linear change of adsorbance values corresponding to glutathione concentration was shown, and the determination of glutathione between 325 - 3253 μM concentration in buffer medium was performed with gold nanoparticle immobilized silica and silica coated magnetic silica microspheres. It has been shown that glutathione can be determined in human serum at concentrations between 2.5-50 μM. ÖZET i ABSTRACT iii TEŞEKKÜR v İÇİNDEKİLER vi ŞEKİLLER DİZİNİ ix ÇİZELGELER DİZİNİ xiii SİMGELER VE KISALTMALAR xiv 1. GİRİŞ 1 2. GENEL BİLGİLER 3 2.1. Nanozimler 3 2.2. Manyetik Nanozimler 4 2.3. Peroksidaz Benzeri Aktivite 5 2.4. Peroksidaz Sensörleri 6 2.5. Glutatyon Tayini 7 2.6. Silika Mikroküreler 10 2.7. Manyetik Silika Mikroküreler 11 2.8. Altın Nanopartiküller 12 2.9 Michaelis-Menten Modeli 13 3. DENEYSEL ÇALIŞMALAR 17 3.1. İmmobilize Formda AuNP İçeren ve Peroksidaz Aktivitesine Sahip Monodispers-Gözenekli Mikrokürelerin Sentezi 19 3.1.1. Kullanılan Kimyasal Malzemeler 19 3.1.2. Monodispers Gözenek Yapılı SiO2 ve SiO2@MagSiO2 Mikrokürelerin Sentezi 19 3.1.2.1. GMA Polimerinin Sentezi 19 3.1.2.2. Çok Basamaklı Mikrosüspansiyon Polimerizasyon Metodu ile Gözenekli Monodispers Partiküllerin Sentezi 20 3.1.2.3. SiO2 Mikrokürelerin Sentezi 21 3.1.2.4. MagSiO2 Mikrokürelerin Sentezi 22 3.1.2.5. Manyetik Silika Mikrokürelerin Silika ile Kaplanması / SiO2@MagSiO2 Mikrokürelerin Sentezi 23 3.1.2.6. SiO2 ve SiO2@MagSiO2 Mikrokürelerin HCl ile Türevlendirilmesi 23 3.1.3. Monodispers ve Gözenek Yapılı SiO2 ve SiO2@MagSiO2 Mikrokürelerin AuNP ile Modifiye Edilmesi 24 3.1.3.1. Aminopropiltrietoksisilan ile Monodispers-Gözenekli SiO2 ve SiO2@MagSiO2 Mikrokürelerin Türevlendirilmesi 24 3.1.3.2. AuNP Sentezi 25 3.1.3.3. Monodispers-Gözenekli SiO2 ve SiO2@MagSiO2 Mikrokürelerin Altın Nanopartiküller ile Dekorasyonu / Au@SiO2 ve Au@SiO2@MagSiO2 Mikrokürelerin Oluşturulması 25 3.2. Monodispers-Gözenekli SiO2 ve SiO2@MagSiO2 Mikrokürelerin ve Au@SiO2 ve Au@SiO2@MagSiO2 Mikrokürelerin Karakterizasyonu 26 3.2.1. Yüzey Alanı ve Gözenek Boyutu Ölçümü 26 3.2.2. Taramalı Elektron Mikroskobu (SEM) 26 3.2.3. Titreşimli Örnek Manyetometri Analizi 27 3.2.4. X Işını Kırınım Yöntemi 27 3.3. Au@SiO2 ve Au@SiO2@MagSiO2 Mikroküreler ile Peroksidaz Aktivite Ölçümleri ve GSH Tayini 28 3.3.1. Kullanılan Kimyasal Malzemeler 28 3.3.2. Au@SiO2 ve Au@SiO2@MagSiO2 Mikrokürelerin Değişen Ortam pH Değerleri için Peroksidaz Aktivitesi Ölçümleri 28 3.3.3. Değişen Substrat Derişimi için Au@SiO2 ve Au@SiO2@MagSiO2 Mikrokürelerin Peroksidaz Aktivite Ölçümleri 29 3.3.4. Farklı Au@SiO2, Au@SiO2@MagSiO2 Miktarları için Peroksidaz Aktivite Ölçümleri 30 3.3.5. Glutatyonun Au@SiO2, Au@SiO2@MagSiO2 Mikroküre Yüzeylerine Adsorpsiyonunun Ölçülmesi 31 3.3.6. Au@SiO2 ve Au@SiO2@MagSiO2 Mikrokürelerin GSH Tayininde Kullanılması 32 3.3.7. Au@SiO2 ve Au@SiO2@MagSiO2 Mikroküreler ile İnsan Serumunda GSH Tayini 33 4. SONUÇLAR VE TARTIŞMA 34 4.1. Monodispers-Gözenekli SiO2, SiO2@MagSiO2, Au@SiO2 ve Au@SiO2@MagSiO2 Mikrokürelerin Karakterizasyonu 34 4.1.1. Monodispers-Gözenekli Mikrokürelerin Taramalı Elektron Mikroskobu (SEM) Görüntüleri 34 4.1.2. Monodispers-Gözenekli Mikrokürelerin Yüzey Alanı ve Gözenek Boyutu Ölçümleri 37 4.1.3. Titreşimli Örnek Manyetometri Analizi 39 4.1.4. X-Işını Kırınım Analizi 40 4.2. İmmobilize Formda AuNP İçeren ve Peroksidaz Aktivitesine Sahip Monodispers-Gözenekli Mikrokürelerin Peroksidaz Aktivitesi Ölçümleri 41 4.2.1. Au@SiO2 ve Au@SiO2@MagSiO2 Mikrokürelerin Değişen Ortam pH Değerleri için Peroksidaz Aktivitesi Ölçüm Sonuçları 41 4.2.2. Değişen Substrat Derişimi (OPD derişimi) için Au@SiO2 ve Au@SiO2@MagSiO2 Mikrokürelerin Peroksidaz Aktivitesi Ölçüm Sonuçları 45 4.2.3. Farklı Au@SiO2 ve Au@SiO2@MagSiO2 Mikroküre Miktarları için Peroksidaz Aktivite Ölçümleri 56 4.3. Au@SiO2 ve Au@SiO2@MagSiO2 Monodispers-Gözenekli Mikroküreler ile GSH Adsorpsiyon Ölçüm Sonuçları 59 4.4. Au@SiO2 ve Au@SiO2@MagSiO2 Mikroküreler ile GSH Biyomolekülünün Kolorimetrik Tayini 60 4.4.1. Au@SiO2 ve Au@SiO2@MagSiO2 Mikroküreler ile Çözelti Ortamında GSH Biyomolekülünün Kolorimetrik Tayini 60 4.4.2. Au@SiO2@MagSiO2 Mikroküreler ile İnsan Serumunda GSH Biyomolekülünün Kolorimetrik Tayini 63 5. YORUM 67 6. KAYNAKLAR 69 EKLER 74 EK 1 - Tez Çalışması Orjinallik Raporu 74 ÖZGEÇMİŞ 75 Destek materyali olarak kullanılan monodispers gözenekli formda silika ve manyetik silika mikroküreler çok basamaklı hidroliz-kondenzasyon yöntemi ile sentezlenmiştir. Manyetik mikrokürelerin yüzeyi tekrar silika kabuk yapısıyla kaplanmıştır. Silika ve yüzeyi silika kaplanmış manyetik silika mikrokürelere Türkevich metodu ile sentezlenen altın nanopartiküller immobilize edilmiştir. Mikrokürelerin yüzey morfolojileri ve boy dağılımı taramalı elektron mikroskobu (SEM) ile incelenmiştir. Mikrokürelerin yüzeylerindeki atomik bileşim enerji saçılımlı X-ışını spektroskopisi (EDX) ile ve kimyasal yapıları X ışını kırınım yöntemi (XRD) ile incelenmiştir. Mikrokürelerin yüzey alanları ve gözenek boyutu (BET/Brunauer-Emmett-Teller) azot adsorpsiyon ve desorpsiyon yöntemi kullanılarak, manyetik özelliğe sahip mikrokürelerin manyetizasyon özellikleri ise titreşimli örnek manyetometresi (VSM) kullanılarak belirlenmiştir. Sentezlenen mikrokürelerin peroksidaz benzeri aktivitesi değişen pH, substrat konsantrasyonu ve nanozim miktarı için incelenmiştir. Peroksidaz aktivitesi ölçümlerinde substrat olarak o-fenilendiamin (OPD) kullanılmıştır. Ölçümler UV-görünür bölge spektrofotometresi ile gerçekleştirilmiştir. Nanozim yapıları için OPD tüketim hızı ve substrat derişimi kullanılarak Lineweaver-Burk grafikleri çizilmiş, enzimlerde enzim ve substrat arasındaki afiniteyi gösteren Michaelis Menten sabiti (Km) değeri hesaplanmıştır. Yüzeyine altın nanopartikül immobilize edilmiş ve silika ile kaplanmış manyetik silika mikroküreler için Km değeri 522,47 μM, yüzeyine altın nanopartikül immobilize edilmiş silika mikroküreler için 816,48 μM olarak hesaplanmıştır. Glutatyon tayini için geliştirilen sensörde, glutatyonun mikroküre yüzeyine bağlanmasıyla, mikrokürenin peroksidaz aktivitesinde glutatyon derişimine bağlı olarak ortaya çıkan değişim incelenmiştir. Glutatyonunun mikroküre yüzeyine adsorbsiyonu Yüksek Performanslı Sıvı Kromatografisi (HPLC) kullanılarak analiz edilmiştir. Sentezlenen nanozimler ile peroksidaz aktivitesi için uygun koşullar seçilerek çözelti ortamında ve insan serumunda glutatyon tayini yapılmıştır. Glutatyon derişimine karşılık gelen adsorbans değerlerininin lineer değişimi gösterilmiş, altın nanopartikül immobilize edilmiş silika ve silika ile kaplanmış manyetik silika mikroküreler ile çözelti ortamında 325 - 3253 μM glutatyon tayini yapılmıştır. İnsan serumunda ise 2,5-50 μM arasındaki derişim değerlerinde glutatyon tayininin yapılabildiği gösterilmiştir.