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ilustraciones, diagramas Actualmente las razas de asnos se encuentran en grave peligro de extinción, donde se ha producido una disminución sustancial en el tamaño de la población. En Colombia se reportó que la población de asnos criollos en el país para el 2010 era de 134251 animales y para el año 2015 hubo una dramática reducción a 75072 ejemplares. Una de las consecuencias de la reducción de la población en los asnos, se ha dado por la exportación indiscriminada de pieles de asno hacia la China, para la producción de un medicamento tradicional, lo que ha conllevado a nivel mundial a una reducción considerable en la población. Dado esto, la criopreservación es una técnica que permite mantener las células a baja temperatura sin perder su viabilidad y utilidad, tiene como objetivo inhibir la actividad metabólica del semen, garantizando su vitalidad y función a través del tiempo, conservándolo indefinidamente. Sin embargo, las tasas de fertilidad con semen criopreservado en programas de inseminación artificial siguen siendo menores con respecto al semen fresco o refrigerado, esto es dado a que los procesos de congelación en el semen incluyen factores que son extremadamente nocivos para las células, que afectan seriamente la vitalidad y funcionalidad de los espermatozoides reduciendo su longevidad. Específicamente el uso de la inseminación artificial en las burras ha tenido algunas dificultades en comparación a las yeguas, debido a las diferencias anatómicas y fisiológicas en el tracto reproductivo. Después de la inseminación artificial con semen descongelado se provoca una reacción inflamatoria en el útero probablemente generado por la ausencia del plasma seminal y los crioprotectores permeables en el semen. El objetivo de esta investigación fue evaluar factores asociados con la criotoleracia, el estado redox y la capacidad fecundante del semen asnal, orientados a la conservación de los asnos (Equus asinus) criollos colombianos. Para lo anterior se propuso la evaluación de 8 alternativas en la congelación del semen con diferentes combinaciones entre crioprotectores permeables y no permeables como la dimetilformamida (DMF), sacarosa (SAC), albumina sérica bovina (BSA) y plasma seminal (PS). Para esto fueron colectados 30 eyaculados, de cada eyaculado se extrajo una proporción de plasma seminal sobre el cual fueron analizadas proteínas y enzimas. Al semen, sometido a las diferentes alternativas de criopreservación, se les realizó evaluación de la calidad seminal, capacidad antioxidante total (TAC), especies reactivas de oxigeno (ERO) y capacidad fecundante. Para el análisis estadístico se ajustaron modelos lineales generalizados (GLM) y se realizaron correlaciones y regresiones. Se encontraron asociaciones entre el contenido del plasma, la TAC y EROS sobre la calidad del semen fresco y descongelado de asnos. Así mismo, se encontró que la combinación entre DMF, BSA y PS brinda una mayor adherencia de espermatozoides a la zona pelúcida. La selección de los componentes de los diluyentes en la congelación de semen de asnos criollos colombianos, es determinante en la conservación, en el aporte antioxidante, en la mitigación de especies reactivas de oxígeno y en la capacidad fecundante. (Texto tomado de la fuente) Donkey breeds are currently in serious danger of extinction, where there has been a substantial decline in population size. In Colombia, it was reported that the population of Creole donkeys for 2010 was 134,251 animals and for the year 2015 there was a dramatic reduction to 75,072 specimens. One of the consequences of the reduction in the population of donkeys has been the indiscriminate export of donkey skins to China for the production of a traditional medicine, which has led to a considerable reduction in the population. For this reason, cryopreservation is a technique that allows cells to be kept at a low temperature without lose their viability and usefulness. Its objective is to inhibit the metabolic activity of sperm, guaranteeing its vitality and function over time, preserving it indefinitely. However, fertility rates with cryopreserved semen in artificial insemination programs continue to be lower compared to fresh or chilled semen, this is because the freezing processes in semen include factors that are extremely harmful to cells that seriously affect fertility, vitality and functionality of spermatozoa, reducing their longevity. Specifically, the use of artificial insemination in donkeys has had some difficulties compared to mares due to anatomical and physiological differences in the reproductive tract. After artificial insemination with thawed semen, it causes an inflammatory reaction in the uterus, probably caused by the absence of seminal plasma and permeable cryoprotectants in the semen. The aim of this research was to evaluate factors associated with the cryotolerance, redox status and fertilizing capacity of donkey semen, aimed at the conservation of Colombian Creole donkeys (Equus asinus). For this, the evaluation of 8 alternatives in semen freezing was carried out with different combinations between permeable and non-permeable cryoprotectants such as dimethylformamide (DMF), sucrose (SAC), bovine serum albumin (BSA) and seminal plasma (PS). Thirty (30) ejaculates were collected, from each ejaculate Contenido XIX a proportion of seminal plasma was extracted, from which proteins and enzymes were analyzed. The semen with different cryopreservation alternatives, was evaluated for seminal quality, total antioxidant capacity (TAC), reactive oxygen species (ROS) and fertilizing capacity. For statistical analysis, generalized linear models (GLM) were fitted and correlations and regressions were performed. Associations were found between plasma content, TAC and EROS on the quality of fresh and thawed donkey semen. In addition, it was found that the combination of DMF, BSA and PS provides greater adherence of sperm to the zona pellucida. The selection of the components of the extenders in the freezing of semen of Colombian Creole donkeys, is decisive in its conservation, in the antioxidant contribution, in the mitigation of reactive oxygen species and in its fertilizing capacity. Doctorado Doctor en Biotecnología Biotecnología de la Reproducción Animal Área curricular Biotecnología

The aim of this study was to evaluate the effect of the sexual behaviour process of copulation with castrated males (G1) on ovulation induction, contrasting with the same effect of vasectomized males (G2) and the effect of the application of seminal plasma (G3) in utero in 45 alpacas with preovulatory follicle ≥7 mm in diameter, randomly distributed (n=15) in each experimental group. The occurrence of ovulation was estimated on day 4 post-copula by sexual receptivity (acceptance or rejection) to the male and verified on days 7 and 11 with the detection of a corpus luteum (CL) by transrectal ultrasound. In G1, seminal plasma secretion was determined on days -1, 1, 17 and 21 after castration. The phases of sexual behaviour in the controlled mating were similar between G1 and G2. On day 4 post mating a female from G1 had ovulated. On day 7, the ovulation rate determined by the presence of the CL and sexual receptivity was higher (p, El presente estudio tuvo como objetivo evaluar el efecto del proceso del comportamiento sexual de la cópula con machos castrados (G1) en la inducción de la ovulación, comparando con el mismo efecto de machos vasectomizados (G2) y el efecto de la aplicación de plasma seminal (G3) en el útero en 45 alpacas con folículo preovulatorio ≥7 mm de diámetro, distribuidas (n=15) al azar en cada grupo experimental. La ocurrencia de ovulación se estimó el día 4 poscópula mediante receptividad sexual (aceptación o rechazo) al macho y verificada el día 7 y 11 con la detección del cuerpo lúteo (CL) vía ecografía transrectal. En G1, se determinó la secreción de plasma seminal los días -1, 15, 17 y 21 de la castración. Las fases del comportamiento sexual en el empadre controlado fueron similares entre G1 y G2. El día 4 poscópula una hembra de G1 había ovulado. En el día 7, la tasa de ovulación determinada por la presencia de cuerpo lúteo y receptividad sexual fue mayor (p

RESUMEN El presente estudio tuvo como objetivo evaluar el efecto del proceso del comporta- miento sexual de la cópula con machos castrados (G1) en la inducción de la ovulación, comparando con el mismo efecto de machos vasectomizados (G2) y el efecto de la aplicación de plasma seminal (G3) en el útero en 45 alpacas con folículo preovulatorio >7 mm de diámetro, distribuidas (n=15) al azar en cada grupo experimental. La ocurrencia de ovulación se estimó el día 4 pos-cópula mediante receptividad sexual (aceptación o rechazo) al macho y verificada el día 7 y 11 con la detección del cuerpo lúteo (CL) vía ecografía transrectal. En G1, se determinó la secreción de plasma seminal los días -1, 15, 17 y 21 de la castración. Las fases del comportamiento sexual en el empadre controlado fueron similares entre G1 y G2. El día 4 poscópula una hembra de G1 había ovulado. En el día 7, la tasa de ovulación determinada por la presencia de cuerpo lúteo y receptividad sexual fue mayor (p7 mm in diameter, randomly distributed (n=15) in each experimental group. The occurrence of ovulation was estimated on day 4 post-copula by sexual receptivity (acceptance or rejection) to the male and verified on days 7 and 11 with the detection of a corpus luteum (CL) by transrectal ultrasound. In G1, seminal plasma secretion was determined on days -1, 1, 17 and 21 after castration. The phases of sexual behaviour in the controlled mating were similar between G1 and G2. On day 4 post mating a female from G1 had ovulated. On day 7, the ovulation rate determined by the presence of the CL and sexual receptivity was higher (p

En el gato doméstico, no se han realizado estudios que relacionen las características bioquímicas del plasma seminal con las características morfológicas del semen felino ni con su capacidad para soportar el proceso congelación-descongelación. El objetivo del trabajo de tesis fue estudiar características morfológicas y bioquímicas del semen felino y su influencia sobre la criopreservación seminal. En el primer experimento se evaluó la relación del contenido de colesterol, triacilglicéridos y proteínas del plasma seminal con la calidad de semen y la ultraestructura espermática. Las concentraciones de colesterol y triglicéridos del plasma seminal fueron más altas en las muestras provenientes de eyaculados de buena calidad seminal (BCS) comparado con los de mala calidad seminal (MCS), mientras que la concentración de proteínas totales no mostro diferencias entre los grupos. El estudio ultramicroscópico evidenció que los eyaculados de BCS presentaron un mayor porcentaje de espermatozoides normales comparados con los de MCS; observándose en este último grupo, una mayor cantidad de anormalidades de cabeza y pieza intermedia. En el segundo experimento se estudió la relación entre el peso molecular de las proteínas del plasma seminal y la calidad de semen, identificándose mediante electroforesis cinco bandas proteicas en todas las muestras, sin embargo, el plasma seminal de BCS presentó una banda extra de 14.4 kDa. En el tercer experimento se evaluaron las características bioquímicas del plasma seminal sobre la supervivencia espermática del semen congelado, observándose que los eyaculados de BCS con mayor concentración de colesterol y triacilgliceroles, tuvieron mejor índice de congelabilidad que los de MCS. Podemos concluir que en los felinos domésticos las características bioquímicas del plasma seminal tienen influencia sobre la calidad del semen, la cantidad de espermatozoides sin alteraciones ultramicroscópicas y, la supervivencia espermática al congelado. Además, el peso molecular de las proteínas del plasma seminal está relacionado con la calidad seminal., Facultad de Ciencias Veterinarias

In Spain, as well as in the rest of Europe, livestock farming represents a substantial part of economy; thus, it is necessary to ensure an optimal breeding of the main farm animals, including swine and cattle. In order to improve the reproductive performance of the aforementioned species, it is crucial to understand which physiological processes take place after ejaculation. Upon ejaculation, semen results from mixing sperm and a fluid known as seminal plasma. During their passage throughout the female reproductive tract, sperm interact with female tissues/fluids and undergo a maturational process known as sperm capacitation, which is essential for the subsequent fertilisation of the oocyte. Taken this into account, the aim of this Dissertation was to study the role of sperm and seminal plasma proteins in the regulation of sperm capacitation, as well as how they modulate the female genital tract. To this end, three studies focused on pig sperm capacitation were conducted. The first study was centred on the involvement of plasma membrane channels, which allow the movement of molecules that modulate the transduction pathways related to sperm capacitation. The second study suggested that levels of PARK7 protein could be related to a better sperm resilience to the oxidative stress generated during capacitation. Finally, the third study found that the presence of seminal plasma during liquid storage affected the subsequent ability of sperm to elicit capacitation, delaying this process. On the other hand, a fourth study was conducted to investigate the modulation of the female tract environment by seminal plasma and/or sperm in species with intravaginal ejaculation, using the bovine as a model. In summary, both seminal plasma and intrinsic sperm proteins were observed to play a key function in the regulation of sperm capacitation. Moreover, the modulation of the female environment was reported to rely upon the ejaculate deposition site. In the case of species with intravaginal ejaculation, like cattle, the role of sperm appeared to be more relevant than that of seminal plasma. Further studies, however, are needed to determine whether intrinsic sperm proteins or those acquired from seminal plasma exert such a modulatory function. Taken collectively, one can conclude that the regulation of physiological processes taking place after ejaculation in the female reproductive tract is species-specific, and depends on each reproductive strategy. Yet, further research on the regulatory role of sperm and seminal plasma proteins is needed before improvements in the field of assisted reproduction in farm animals and humans may be implemented Tant a Espanya com a la resta d’Europa, la ramaderia representa una part substancial de l’economia i, per tant, cal assegurar la cria òptima de les principals espècies d’interès productiu (porcina i bovina). Per tal de millorar el rendiment reproductiu d’aquestes espècies, és crucial entendre els processos fisiològics que tenen lloc després de l’ejaculació. En el moment de l’ejaculació, el semen es forma com a resultat de la barreja dels espermatozoides amb un fluid anomenat plasma seminal. Durant el seu pas pel tracte reproductor femení, els espermatozoides interactuen amb aquest i pateixen un procés de maduració anomenat capacitació espermàtica, el qual és imprescindible per a poder fecundar l’oòcit. Així doncs, la finalitat d’aquesta Tesi Doctoral va ser estudiar el paper de les proteïnes de l’espermatozoide i del plasma seminal sobre la regulació de la capacitació espermàtica així com en la interacció amb el tracte femení. Amb aquest objectiu, es van realitzar tres estudis focalitzats en el procés de capacitació en l’espècie porcina. El primer dels estudis va destacar la implicació dels canals que es troben a la membrana de l’espermatozoide, els quals permeten l’entrada i sortida de molècules que poden tenir un efecte sobre les vies que regulen els canvis moleculars que es produeixen durant la capacitació. El segon estudi va suggerir que els nivells de la proteïna PARK7 poden estar relacionats amb una major tolerància a la situació d’estrès oxidatiu que pateix l’espermatozoide durant el procés de capacitació. Finalment, el tercer estudi va concloure que la presència de plasma seminal durant la conservació del semen (refrigeració) afecta a la posterior capacitació espermàtica, retardant aquest procés. Per altra banda, es va realitzar un quart estudi que va investigar la modulació de l’ambient del tracte femení per part del plasma seminal i/o l’espermatozoide en espècies amb ejaculació vaginal, utilitzant el boví com espècie model. En resum, pel que fa a la regulació de la capacitació, tant les proteïnes intrínseques de l’espermatozoide com el plasma seminal tenen un paper crucial en aquest procés. En canvi, la modulació de l’ambient del tracte femení sembla dependre del lloc de deposició de l’ejaculació. En el cas de les espècies amb ejaculació vaginal, el paper de l’espermatozoide resulta ser més rellevant que el del plasma seminal. Tot i això, són necessaris més estudis per tal de determinar si son les proteïnes intrínseques de l’espermatozoide o les adquirides del plasma seminal les que realitzen aquesta funció de modulació. En conjunt, es pot concloure que la modulació dels processos fisiològics que tenen lloc després de l’ejaculació, al tracte femení, depenen de l’estratègia reproductiva de cada espècie, i que la recerca futura centrada en la seva regulació per part de les proteïnes espermàtiques i del plasma seminal és crucial a l’hora d’aplicar millores en el camp de la reproducció assistida animal y humana Programa de Doctorat en Tecnologia

The aim of the present study was to evaluate the effects of different cryoprotectants and semen centrifugation on the kinetic parameters and membrane integrity of cryopreserved goat semen. Four buck goats were used, and their semen was collected using an artificial vagina. After semen collection and approval, six pools were formed, and each pool was divided into eight aliquots. The plasma was removed from four aliquots by centrifugation (1200 g/10 min) and subsequently diluted; the remaining four aliquots were diluted in standard Tris-egg yolk (SYE), standard milk (SME), test Tris-egg yolk (TYE) and test milk (TME) extenders without removing the seminal plasma. After dilution, samples were loaded into straws (0.25 mL), frozen and stored at -196 °C. The samples were thawed (37 °C/30 s) and evaluated immediately and two hours after thawing to determine the kinetics and integrity of plasma and mitochondrial membranes. A difference (p< 0.05) in the maintenance of sperm kinetics, plasma membrane integrity and mitochondrial potential was observed between the centrifuged and non-centrifuged groups and between the extenders at different time points. We concluded that the use of centrifugation to remove seminal plasma positively affects the semen evaluation parameters and that the yolk extender is more efficient when applied with different cryopreservation techniques, preserving the desirable traits after the cryopreservation of goat semen. El objetivo de este estudio fue evaluar los efectos de diferentes crioprotectores y la centrifugación del semen sobre los parámetros cinéticos y la integridad de la membrana del semen del macho cabrio criopreservado. Se utilizaron cuatro machos y el semen se recogió a través de una vagina artificial. Después de la recolección y aprobación del semen, se formaron seis grupos y cada grupo se dividió en alícuotas. O se extrajo plasma de cuatro alícuotas por centrifugación (1200 g/10 min) y se diluyó adicionalmente; Las cuatro alícuotas restantes se diluyen en Tris-yema de huevo estándar, Leche, Tris-yema de huevo de prueba y diluyente a base de leche, sin eliminar el plasma seminal. Después de la dilución, las muestras se colocaron en paletas (0.25 mL), se congelaron y se pelaron a -196 °C. Las muestras se descongelaron (37 °C/30 s) y se evaluaron inmediatamente durante dos horas después de la descongelación para determinar la cinética y la integridad del plasma y las mitocondrias. membranas. Se observaron diferencias (p

International audience; The seminal plasma is a very complex fluid, which surrounds sperm in semen. It contains numerous proteins including proteases and protease inhibitors that regulate proteolytic processes associated with protein activation and degradation. We previously identified a seminal protein, chicken liver trypsin inhibitor 1 (ClTI‐1) over expressed in semen of roosters with high fertility, suggesting a role in male fertility. In the present study, we showed that ClTI‐1 gene is actually SPINK2. Using normal healthy adult roosters, we showed that SPINK2 amount in seminal plasma was positively correlated with male fertility in chicken lines with highly contrasted genetic backgrounds (broiler and layer lines). Using affinity chromatography combined to mass spectrometry analysis and kinetic assays, we demonstrated for the first time that two chicken acrosin isoforms (acrosin and acrosin‐like proteins) are the physiological serine protease targets of SPINK2 inhibitor. SPINK2 transcript was overexpressed all along the male tract, and the protein was present in the lumen as expected for secreted proteins. Altogether, these data emphasize the role of seminal SPINK2 Kazal‐type inhibitor as an important actor of fertility in birds through its inhibitory action on acrosin isoforms proteins.

Developing effective cooled semen protocols is essential to increase pregnancy rates and reproductive efficiency in donkeys. This study aimed to evaluate the effect on sperm kinetic parameters and membrane integrity in cooled donkey semen diluted with defined milk proteins extender with 1% or 2% of egg yolk and the removal of seminal plasma. Twenty-four ejaculates from six jackasses were collected. Each ejaculate was divided into four aliquots that were diluted in extender with 1% (EY1) or 2% (EY2) egg yolk. One sample from each group was centrifuged, seminal plasma was removed (CEY1, CEY2 groups, respectively), and the samples were then refrigerated at 5 °C for 24 h. Fresh and cooled semen samples were assessed for sperm motility, morphology, and plasma membrane integrity. Total motility, progressive motility, sperm kinetic parameters, or live sperm cells were not statistically different when semen was cooled with an extender supplemented with 1% or 2% of egg yolk. Seminal plasma removal does not affect total motility or sperm kinetic parameters. However, progressive motility decreased (P

Seminal plasma, in addition to being an important carrier medium for ejaculated sperm, is connected to several metabolites that play a significant role in many biological events and have been linked to possible biomarkers, helping to predict the reproductive potential of selected animals. The present study aimed to evaluate the seminal plasma metabolites of Bos taurus indicus bulls of the Guzerá breed and their associations with semen freezability. Semen from nine adult bulls was collected by electroejaculation, followed by andrological examination and cryopreservation. Afterwards, the semen was thawed and the seminal parameters were evaluated by CASA. Seminal plasma samples from bulls were prepared and then analyzed using gas chromatography combined with mass spectrometry (GC-MS) and multivariate and univariate analyzes. The seminal plasma metabolites and their respective pathways were identified by bioinformatics from Xcalibur and Cytoscape programs and the MetaboAnalyst platform. Sixty-two metabolites were identified in the seminal plasma of the bulls. 1,3-Dioxan-5-ol, stearic acid, cholesteryl myristate, 2-ethylheptanoic acid and isobutylamine were the most abundant metabolites, while heptadecanoic acid, pyrrolidine, nonadecanoic acid, 1-ethyl-1-nitrosourea and ethyl lactate were the least abundant metabolites in the seminal plasma. The multivariate statistical analysis indicated a distinct separation between high and low freezability bulls. The metabolites with the highest score of variable importance in the projection (VIP> 1.0) included propanoic acid, ribose, glycine, heptadecanoic acid and undecanoic acid. Among the compounds, propanoic acid (VIP = 3.5) and ribose (VIP = 2.3) were more abundant in the high freezability group (HF) than in the low freezability group (LF). The t-test analysis suggested that only the concentration of ribose was significant (P = 0.014). This metabolite can influence the reduction of oxidative stress, the repair of DNA damage and the prevention of cellular apoptosis, in addition to serving as a possible source of energy for the body. Thus, ribose can be considered a biomarker of seminal freezability in bulls. As far as it is known, this is the first study to conduct an evaluation of the metabolites in the seminal plasma of Guzerá bulls related to different freezability phenotypes. The findings of this study will serve to assist the development of new research and a better understanding of the mechanisms of sperm cryopreservation. O plasma seminal, além de ser um importante meio carreador dos espermatozoides ejaculados, relaciona-se com diversos metabólitos que exercem significativo papel em vários eventos biológicos e têm sido vinculados a possíveis biomarcadores, auxiliando a predizer o potencial reprodutivo de animais selecionados. Dessa forma, o presente estudo objetivou avaliar os metabólitos do plasma seminal de touros Bos taurus indicus da raça Guzerá e suas associações com a congelabilidade do sêmen. O sêmen de nove touros adultos foi colhido por eletroejaculação e, em seguida, foi realizado o exame andrológico e a criopreservação. Posteriormente, o sêmen foi descongelado e os parâmetros seminais foram avaliados pelo CASA. As amostras do plasma seminal dos touros foram preparadas e, porteriormente, analisadas com a utilização de cromatografia gasosa aliada à espectrometria de massas (CG-EM) e análises multivariadas e univariadas dos dados obtidos. Os metabólitos do plasma seminal e as suas respectivas vias foram identificados por bioinformática a partir dos programas Xcalibur e Cytoscape com o plug-in Metscape e da plataforma MetaboAnalyst. Sessenta e dois metabólitos foram identificados no plasma seminal dos touros. O 1,3-Dioxan-5-ol, ácido esteárico, miristato de colesterila, ácido 2-etilheptanoico e isobutilamina foram os metabólitos mais abundantes enquanto que o ácido heptadecanoico, pirrolidina, ácido não-adecanoico, 1-etil-1-nitrosoureia e o lactato de etila foram os metabólitos menos abundantes no plasma seminal. A análise estatística multivariada indicou uma separação distinta entre os touros de alta e baixa congelabilidade. Os metabólitos com maior pontuação de importância variável na projeção (VIP > 1,0) incluíram o ácido propanoico, ribose, glicina, ácido heptadecanoico e ácido undecanoico. Entre os compostos, o ácido propanoico (VIP = 3,5) e a ribose (VIP = 2,3) foram mais abundantes no grupo de alta congelabilidade (AC) do que no grupo de baixa congelabilidade (BC). A análise do teste t sugeriu que a concentração de ribose foi a única significativa (P = 0,014). Este metabólito pode influenciar na redução do estresse oxidativo, na reparação de danos ao DNA e na prevenção da apoptose celular, além de servir como possível fonte de energia para o organismo. Desse modo, a ribose pode ser considerada um potencial biomarcador de congelabilidade seminal em touros. Até onde sabemos, nosso estudo é o primeiro a conduzir uma avaliação dos metabólitos no plasma seminal de touros da raça Guzerá relacionados com diferentes fenótipos de congelabilidade. As descobertas deste estudo servirão de auxílio para o desenvolvimento de novas pesquisas e de uma melhor compreensão sobre os mecanismos de criopreservação espermática.

The aim of this study was to determine by SDS PAGE the protein profile of the seminal plasma of Romosinuano (ROMO) and Costeño con Cuernos (CCC) bulls and their relationship with sperm quality parameters in fresh and thawed semen. Three ejaculates per bull were collected by electro-ejaculate from 10 ROMO and 10 CCC sires. Viability (VF), mass motility (MMF), individual rapid progressive motility (MIRPF) and sperm concentration (CE) were determined in fresh semen. Seminal plasma (PS) was obtained by double centrifugation. Individual motility of rapid progressives (MIRPPC), progressivity (PRPC), rapid progressives (RPPC) and medium progressive (MPPC) were determined in thawed semen, in both cases using the CASA computerized analysis system. Additionally, viability (VPC) and membrane integrity were determined by the hypoosmotic test. Proteins were separated by polyacrylamide gel electrophoresis (SDS PAGE). The data was analyzed by Student’s T test and the presence of proteins by Chi square. The relationship between proteins and seminal quality parameters using Pearson’s correlation test and principal components of forward regression. In fresh semen, differences (p, El objetivo del estudio fue determinar mediante SDS PAGE el perfil de proteínas del plasma seminal de toros criollos Romosinuano (ROMO) y Costeño con Cuernos (CCC) y su relación con los parámetros de calidad espermática en semen fresco y descongelado. Se colectaron tres eyaculados por toro mediante electro-eyaculación de 10 reproductores ROMO y 10 CCC. En semen fresco se determinó viabilidad (VF), motilidad masal (MMF), motilidad individual rápida progresiva (MIRPF) y concentración espermática (CE). El plasma seminal (PS) se obtuvo mediante doble centrifugación. En el semen descongelado se determinó motilidad individual de rápidos progresivos (MIRPPC), progresividad (PRPC), rápidos progresivos (RPPC) y medios progresivos (MPPC), en ambos casos usando el sistema de análisis computarizado CASA. Adicionalmente se determinó la viabilidad (VPC), e integridad de la membrana mediante el test hipoosmótico. Las proteínas se separaron por electroforesis en geles de poliacrilamida (SDS PAGE). Los datos se analizaron mediante prueba de T de student y la presencia de proteínas por Chi cuadrado. La relación entre las proteínas y los parámetros de calidad seminal mediante la prueba de correlación de Pearson y componentes principales de regresión hacia adelante. En semen fresco se evidenciaron diferencias (p

The study aimed to evaluate the effect of applying seminal plasma, a GnRH analogue and follicular ablation on the follicular dynamic in llamas. The study was carried out in Puno, Peru, using 24 llamas selected under the criterion of presenting a preovulatory follicle >7 mm, determined by transrectal ultrasound. The animals were randomly distributed into four groups: T1, 1 ml PBS IM; T2, 2 ml seminal plasma IM; T3, 1 ml GnRH IM; T4, follicular ablation. The animals were evaluated, by transrectal ultrasound, every 2 h between 20 and 36 h post-treatment to determine ovulation; subsequently daily until day 9 and then every 2 days until day 15 post-stimulation to determine the interval to the emergence of a new follicular wave, the appearance of the new dominant follicle and the diameter of the corpus luteum on day 8 of treatment. No significant difference (p, El presente estudio tuvo como objetivo evaluar el efecto de la aplicación de plasma seminal, un análogo de GnRH y la ablación folicular sobre la dinámica folicular en llamas. El estudio se realizó en Puno, Perú, utilizando 24 llamas seleccionadas bajo el criterio de presentar un folículo preovulatorio >7 mm, determinado mediante ecografía transrectal. Las llamas fueron distribuidas aleatoriamente en cuatro grupos: T1, 1 ml PBS IM; T2, 2 ml plasma seminal IM; T3, 1 ml GnRH IM; T4, ablación folicular. Los animales fueron evaluados, mediante ecografía transrectal, cada 2 h entre las 20 hasta las 36 h post-tratamiento para determinar la ovulación; posteriormente en forma diaria hasta el día 9 y luego cada 2 días hasta el día 15 pos-estímulo para determinar el intervalo a la emergencia de una nueva onda folicular, la aparición del nuevo folículo dominante y el diámetro del cuerpo lúteo al día 8 del tratamiento. No se encontró diferencia significativa (p

Submitted by Otávio Luis de Oliveira Henriques Paulo (otavio.l.paulo@gmail.com) on 2021-02-01T20:43:00Z No. of bitstreams: 1 Tese de Doutorado Otávio.pdf: 2477166 bytes, checksum: 08dde11a0f7313d01cea52cf10c55809 (MD5) Rejected by ROSANGELA APARECIDA LOBO null (rosangelalobo@btu.unesp.br), reason: Solicitamos que realize uma nova submissão seguindo as orientações abaixo: problema 1: ficha catalográfica No arquivo submetido não consta a ficha catalográfica, item obrigatório para submissão. A ficha deve ser inserida no arquivo PDF logo após a folha de rosto do seu trabalho. A ficha pode ser solicitada pelo sistema da biblioteca (https://www.btu.unesp.br/#!/sobre/biblioteca/usuario/ficha-catalografica/) e elaborada por uma bibliotecária. Ou, se preferir, pode usar o sistema disponibilizado pela Coordenadoria Geral de Bibliotecas para essa finalidade: https://www.biblioteca.unesp.br/ficha/ Problema 2: financiamento Capes No formulário de submissão consta a Capes como agência financiadora do seu projeto. No arquivo submetido não localizei uma agradecimento a esta. Isso é uma exigência das agências de fomento. E a Capes sugere que o agradecimento seja feito da seguinte maneira: "O presente trabalho foi realizado com apoio da Coordenação de Aperfeiçoamento de Pessoal de Nível Superior - Brasil (CAPES) - Código de Financiamento 001 Assim que tiver efetuado as correções submeta o arquivo, em formato PDF, novamente. Agradecemos a compreensão. on 2021-02-02T17:34:36Z (GMT) Submitted by Otávio Luis de Oliveira Henriques Paulo (otavio.l.paulo@gmail.com) on 2021-02-03T14:27:41Z No. of bitstreams: 1 Tese de Doutorado Otávio Para Repositório.pdf: 2363210 bytes, checksum: 0d81cb097f1ca17abfb46762ba714feb (MD5) Approved for entry into archive by ROSANGELA APARECIDA LOBO null (rosangelalobo@btu.unesp.br) on 2021-02-03T19:09:47Z (GMT) No. of bitstreams: 1 paulo_oloh_dr_bot_par.pdf: 1377485 bytes, checksum: 921c6fd07db5bfe7b20ad568323f15b2 (MD5) Made available in DSpace on 2021-02-03T19:09:48Z (GMT). No. of bitstreams: 1 paulo_oloh_dr_bot_par.pdf: 1377485 bytes, checksum: 921c6fd07db5bfe7b20ad568323f15b2 (MD5) Previous issue date: 2020-05-19 Coordenação de Aperfeiçoamento de Pessoal de Nível Superior (CAPES) Vacinas contraceptivas têm sido propostas como uma forma mais rápida e menos invasiva para esterilização de cães. Este estudo objetivou descrever a relação entre as proteínas das células espermáticas ejaculadas e do epidídimo, do plasma seminal e do fluído epididimário, produzindo base experimental para o design destas vacinas. Para isso, utilizou-se 5 cães (n = 5), dos quais foram obtidos o ejaculado e, após a orquiectomia, o produto da recuperação da cauda do epidídimo. As amostras foram submetidas a avaliação da concentração, morfologia, cinética espermática, citometria de fluxo e teste de ligação em membrana perivitelínica de ovo, sendo separadas em 4 grupos: plasma seminal (PS), fluido epididimário (FE), espermatozoides do ejaculado (EJAC) e do epidídimo (EPID). Para análise proteômica a digestão das proteínas dos 4 grupos foi feita in gel e avaliadas em espectrômetro de massas Q-Tof. Os parâmetros de motilidade progressiva, retilinearidade, linearidade, coeficiente de oscilação, produção de H2O2 e percentagem de membrana plasmática íntegra e acrossomal lesada foram mais expressivos (P< 0,01) no grupo EJAC do que no EPID. Foram encontradas 177 proteínas entre EJAC e PS (16 up-regulated no EJAC e 14 no PS); 241 proteínas entre EPID e FE (27 up-regulated no EPID e 14 no FE); e 210 proteínas entre EJAC e EPID (3 up-regulated no EJAC e 17 no EPID). Contraceptive vaccines has been proposed as a faster and less invasive way to sterilize dogs. This study aimed to describe the relation between proteins of ejaculated sperm cells and epididymis, seminal plasma and epididymal fluid, producing an experimental basis for designing these vaccines. For this, 5 dogs (n = 5) were used, from which the semen and, after orchiectomy, the epididymis tail recovery product was obtained. Samples were submitted to concentration, morphology, sperm kinetics, flow cytometry and egg perivitellin membrane binding test analisys, and separated into 4 groups: seminal plasma (PS), epididymal fluid (EF), ejaculate spermatozoa (EJAC) and epididymis spermatozoa (EPID). For proteomic analysis the protein digestion of the 4 groups was performed in gel and evaluated by Q-Tof mass spectrometer. The parameters of progressive motility, rectilinearity, linearity, wobble, H2O2 production and percentage of plasma membrane integrity and damaged acrosomal membrane were more expressive (p

Els rucs (Equus asinus), són una espècie d’origen salvatge, segurament la primera a ser domesticada per l’home. Durant segles va ser indispensable en les tasques de camp, però la mecanització el va portar gairebé a la desaparició. Avui en dia, la importància d’aquesta espècie ha tornat a créixer gràcies a l’interès del seu ús cap a nous camps. Com a conseqüència l’interès per la reproducció de l’ase ha augmentat en els últims anys. La inducció d’ovulacions fèrtils és fonamental per a l’aplicació d’aquestes tecnologies reproductives i la seva millora. Al primer treball de la present Tesi es planteja utilitzar l’ecografia Doppler Color com a instrument per controlar la vascularització de el cos luti de la burra i així poder determinar el millor moment per administrar PGF2a i induir la lúteolisis que es produeix entre les 3 i 5 hores després de l’aplicació d’una prostaglandina i és el resultat d’una isquèmia del cos luti amb la consegüent pèrdua de funcionalitat d’aquest i baixada dels nivells plasmàtics de progesterona. La inseminació artificial (AI) de someres amb semen congelat-descongelat de ruc s’associa amb baixes taxes de fertilitat. L’addició de plasma seminal (SP), eliminant durant el procés de congelació, o l’augment de la concentració espermàtica, han mostrat un cert increment d’aquestes taxes d’embaràs. D’altra banda, a la burra es va observar una exagerada resposta inflamatòria poques hores després de la inseminació amb possible relació amb la baixa fertilitat. En estudis previs es va analitzar aquesta resposta mitjançant la recuperació de neutròfils polimorfonuclears (PMN) de rentats uterins post-AI. No obstant això, la repetició d’aquests rentats pot afectar negativament a l’endometri i provocar problemes de fertilitat. Per aquesta raó, al segon article s’ha realitzat un conjunt d’experiments per poder establir un model in vitro mitjançant la recol·lecció de PMN de la sang perifèrica de les someres, provant com afecta la concentració d’espermatozoides a la seva interacció amb els PMN. S’ha obtingut un model vàlid per poder recrear in vitro les condicions fisiològiques que es donen in vivo. S’ha conclòs que el SP té capacitat per activar els PMN. D’altra banda, s’ha observat una escassa fagocitosi d’espermatozoides mentre la major part d’aquests apareixen units a la superfície dels PMN o en un halo circumdant. Així mateix, bona part d’aquests es mantenen vius, amb un intens moviment de cua i, en les concentracions superiors a 500x106 alguns poden alliberar-se amb una excel·lent mobilitat després de 3h d’incubació a 37ºC. El paper de SP sembla ser molt important en la modulació d’aquesta inflamació fisiològica de les someres. Per facilitar el seu estudi, l’objectiu d’el tercer experimental va ser fraccionar el plasma seminal de ruc basant-se en el pes molecular de les proteïnes i analitzar l’efecte sobre la motilitat spz i la interacció PMN: spz. De l’SP de cinc rucs es van obtenir 6 fraccions ( 10 kDa) que es van posar en contacte amb una solució de PMN: spz i es van incubar a 37ºC . A 1h, 2h, 3h, 4h es va avaluar la motilitat espermàtica amb sistema CASA (ISAS®, la viabilitat dels espermatozoides mitjançant una tinció eosinanigrosina i la interacció PMN: spz mitjançant una triple tinció Diff-QuikR. Les fraccions de SP que inclouen proteïnes entre 30-50 kDa i 50-100kDa van mostrar el millor manteniment de les subpoblacions mòbils de spz de ruc així com estan involucrades en el control de la resposta inflamatòria post-AI de la burra. Diverses proteïnes involucrades en la fecundació tenen un pes molecular entre 30 i 100 kDa. Los burros (Equus asinus), son una especie de origen salvaje, seguramente la primera en ser domesticada por el hombre. Durante siglos fue indispensable en las tareas del campo, pero la mecanización lo llevó casi a la desaparición. Hoy en día, la importancia de esta especie ha vuelto a crecer gracias al interés de su uso hacia nuevos campos. Como consecuencia el interés por la reproducción del burro ha aumentado en los últimos años. La inducción de ovulaciones fértiles es fundamental para la aplicación de dichas tecnologías reproductivas y su mejora. En el primer trabajo de la presente Tesis se plantea utilizar la ecografía Doppler Color como instrumento para controlar la vascularización del cuerpo lúteo de la burra y así poder determinar el mejor momento para administrar PGF2a e inducir la luteólisis que se produce entre las 3 y 5 horas tras la aplicación de una prostaglandina y es el resultado de una isquemia del cuerpo lúteo con la consiguiente pérdida de funcionalidad de este y bajada de los niveles plasmáticos de progesterona. La inseminación artificial (AI) de burras con semen congelado-descongelado de burro se asocia con bajas tasas de fertilidad. La adición de plasma seminal (SP), eliminando durante el proceso de congelación, o el aumento de la concentración espermática, han mostrado un cierto incremento de dichas tasas de preñez. Por otro lado, en la burra se observó una exagerada respuesta inflamatoria pocas horas después de la inseminación con posible relación con la baja fertilidad. En estudios previos se analizó esta respuesta mediante la recuperación de neutrófilos polimorfonucleares (PMN) de lavados uterinos post-AI. No obstante, la repetición de estos lavados puede afectar negativamente al endometrio y provocar problemas de fertilidad. Por esta razón, en el segundo artículo se ha realizado un conjunto de experimentos para poder establecer un modelo in vitro mediante la recolección de PMN de la sangre periférica de las burras, probando cómo afecta la concentración de espermatozoides a su interacción con los PMN. Se ha obtenido un modelo válido para poder recrear in vitro las condiciones fisiológicas que se dan in vivo. Se ha concluido que el SP tiene capacidad para activar los PMN. Por otro lado, se ha observado una escasa fagocitosis de espermatozoides mientras la mayor parte de estos aparecen unidos a la superficie de los PMN o en un halo circundante. Así mismo, buena parte de estos se mantienen vivos, con un intenso movimiento de cola y, en las concentraciones superiores a 500x106 algunos pueden liberarse con una excelente movilidad tras 3h de incubación a 37ºC. El papel de SP parece ser muy importante en la modulación de esta inflamación fisiológica de las burras. Para facilitar su estudio, el objetivo del tercer experimental fue fraccionar el plasma seminal de burro basándose en el peso molecular de las proteínas y analizar el efecto sobre la motilidad spz y la interacción PMN:spz. Del SP de cinco burros se obtuvieron 6 fracciones ( 10 kDa) que se pusieron en contacto con una solución de PMN:spz y se incubaron a 37ºC. A 1h, 2h, 3h, 4h se evaluó la motilidad espermática con sistema CASA (ISAS®, la viabilidad de los espermatozoides mediante una tinción eosinanigrosina y la interacción PMN:spz mediante una triple tinción Diff-QuikR. Las fracciones de SP que incluyen proteínas entre 30-50 kDa y 50-100kDa mostraron el mejor mantenimiento de las subpoblaciones móviles de spz de burro así como están involucradas en el control de la respuesta inflamatoria post-AI de la burra. Varias proteínas involucradas en la fecundación tienen un peso molecular entre 30 y 100 kDa. Donkeys (Equus asinus), are a species of wild origin, surely the first to be domesticated by man. For centuries it was indispensable in the tasks of the field, but mechanization almost led to its disappearance. Today, the importance of this species has grown again thanks to the interest of its use in new fields. As a consequence, interest in donkey breeding has increased in recent years. The induction of fertile ovulations is essential for the application of these reproductive technologies and their improvement. In the first work of this thesis, it is proposed to use Color Doppler ultrasound as an instrument to control the vascularization of the jennies’ corpus luteum and thus be able to determine the best time to administer PGF2a and induce luteolysis that occurs between 3 and 5 hours. after the application of a prostaglandin and is the result of an ischemia of the corpus luteum with the consequent loss of functionality of the corpus luteum and a decrease in plasma progesterone levels. Artificial insemination (AI) of jennies with frozen-thawed donkey semen is associated with low fertility rates. The addition of seminal plasma (SP), eliminating during the freezing process, or the increase in sperm concentration, have shown a certain increase in these pregnancy rates. On the other hand, in the jenny an exaggerated inflammatory response was observed a few hours after insemination, possibly related to low fertility. Previous studies have analyzed this response by recovering polymorphonuclear neutrophils (PMN) from post-AI uterine lavages. However, repetition of these washes can adversely affect the endometrium and lead to fertility problems. For this reason, in the second article, a set of experiments has been carried out to establish an in vitro model by collecting PMN from the peripheral blood of jennies, testing how the concentration of sperm affects their interaction with PMN. A valid model has been obtained to be able to recreate in vitro the physiological conditions that occur in vivo. It has been concluded that the SP has the capacity to activate the PMN. On the other hand, little sperm phagocytosis has been observed while most of these appear attached to the surface of the PMN or in a surrounding halo. Likewise, a good part of these are kept alive, with an intense tail movement and, in concentrations above 500x106, some can be released with excellent mobility after 3h incubation at 37ºC. The role of SP appears to be very important in modulating this physiological inflammation of jennies. To facilitate their study, the objective of the third experiment was to fractionate donkey seminal plasma based on the molecular weight of proteins and to analyze the effect on spz motility and PMN: spz interaction. From the SP of five donkeys, 6 fractions ( 10 kDa) were obtained, which were contacted with a PMN: spz solution and incubated at 37ºC. . At 1h, 2h, 3h, 4h, sperm motility was evaluated with the CASA system (ISAS®), the viability of the sperm using an eosinigrosin stain and the PMN: spz interaction using a triple Diff-QuikR stain. SP fractions including proteins between 30-50 kDa and 50-100kDa showed the best maintenance of the mobile sub-populations of donkey spz as well as are involved in the control of the jennies’ post-AI inflammatory response. Several proteins involved in fertilization have a molecular weight between 30 and 100 kDa. Universitat Autònoma de Barcelona. Programa de Doctorat en Medicina i Sanitat Animals

The Brazilian bocachico, Prochilodus brevis, is a rheophilic fish. Although there is evidence that this species shows reproductive seasonality in the wild, in captivity hormonal induction techniques allow semen sampling in different seasons. This study aimed to compare the kinetics, morphology and biochemical composition of the semen of Brazilian bocachico in captivity when hormonally induced to breed in the reproductive and non-reproductive seasons. During sampling spermiation was hormonally induced in breeders. The concentrations of total protein, glucose, fructose, triglyceride, calcium and chloride were evaluated with biochemical kits. The pH data (6.5 to 8.5) suggest semen requires alkaline conditions, as expected for freshwater fish. Seminal plasma contained more protein (1.51 ± 0.06 dL g-1), glucose (79.44 ± 1.88 mg dL-1) and triglycerides (61.59 ± 8.10 mg dL-1) in the non-reproductive than the reproductive season, but calcium ions (15.98 ± 1.02 mg dL-1) showed the opposite pattern. There was a significant seasonal difference in sperm morphology, with a higher percentage of normal sperm in the reproductive season. From these data it can be concluded that the physical, kinetic, morphological and biochemical characteristics of semen of captive Prochilodus brevis are influenced by reproductive season. RESUMO O curimatã comum Prochilodus brevis caracteriza-se como um peixe reofílico. Na natureza, esses animais apresentam sazonalidade reprodutiva, porém em cativeiro, técnicas de indução hormonal, permitem a coleta de sêmen em diferentes períodos do ano. Objetivou-se comparar a cinética, a morfologia e a composição física e bioquímica do sêmen de curimatã comum induzidos à reprodução em cativeiro com uso de hormônio, na estação reprodutiva e não reprodutiva. As concentrações de proteínas totais, glicose, frutose, triglicerídeo, cálcio e cloreto foram avaliadas através de kits bioquímicos e analisadas em espectrofotômetro. Os dados de pH do sêmen, sugerem condição alcalina do sêmen dentro do esperado para peixes de água doce (6,5 a 8,5). A quantidade de proteínas totais (1,51 ± 0,06 g dL-1), glicose (79,44 ± 1,88 mg dL-1) e triglicerídeos (61,59 ± 8,10 mg dL-1) no plasma seminal apresentaram uma maior concentração na estação não reprodutiva. Enquanto que o oposto foi verificado para os íons cálcio (15,98 ± 1,02 mg dL-1). Houve diferença significativa, na morfologia do espermatozoide na estação reprodutiva, com uma porcentagem de espermatozoides normais superior em relação à estação não reprodutiva. Assim, pode-se concluir que características físicas, bioquímicas, cinéticas e morfológicas do sêmen de curimatã comum, mantidos em cativeiro, sofrem influência da estação reprodutiva.