Ionotropic glutamate receptors (iGluRs) are ligand-gated ion channels that are fundamental for healthy brain function. For these, the α-amino-3-hydroxyl-5-methyl-4-isoxazol-propionic acid (AMPA)-subtype glutamate receptor is a key mediator of fast excitatory synaptic transmission in the central nervous system. Their dysfunction is implied in numerous neurological disorders. Consequently, considerable efforts have been dedicated to study the structure and function of iGluRs. However, despite recent progress in resolving their structural architecture and dynamics, to date, few methods could resolve dynamics in the membrane domain. Here, I present an optogenetic approach with the goal of elucidating receptor dynamics of the AMPA receptor transmembrane domain (TMD). This method involved site-specific incorporation of unnatural amino acid (UAA) photocrosslinkers by unnatural mutagenesis. Thus, we created photo-controllable AMPA receptors that can be regulated with high spatiotemporal precision, using light as the orthogonal input signal. We introduced the UAAs p-benzoyl-L-phenylalanine (BzF) and p-azido-L-phenylalanine (AzF) at 30 individual sites throughout the TMD of the AMPA receptor subunit GluA2. Electrophysiological recordings of outside-out patches from mammalian cells (HEK 293 cells) in combination with synchronised exposure to UV light via epi-illumination led to a series of optical effects on channel activity. For 11 different mutants with either AzF or BzF incorporated into the GluA2 TMD, we identified light-induced changes of receptor activity, ranging from fast inhibition to potentiation. One of the most striking UV effects arose from the F579 site harbouring AzF in the middle of the M2 re-entrant helix of the TMD, which showed complex changes in receptor kinetics after crosslinking AzF upon UV illumination. Entry to desensitzation was slowed, but once entered the desensitized state became more stable and seemed to be conductive. These results suggest a distinct role of the M2 segment in channel gating, beyond its canonical role in ion selectivity. Moreover, our electrophysiological results complemented with biochemical experiments provided evidence for an interaction between the pre-M1 and the M4 helices during desensitization, indicating a novel role of these helices. To summarize, in the presented work, we refined several existing methods and, for the first time, could systemically explore structural rearrangements of the transmembrane domain of AMPA receptors during gating and relate them to functional properties of the channel., Ionotrope Glutamatrezeptoren (iGluR) sind ligandengesteuerte Ionenkanäle, die eine wichtige Rolle für eine gesunde Hirnfunktion spielen. Dabei gehört der α-amino-3-hydroxyl-5-methyl-4-isoxazol-propionic acid (AMPA)-Subtyp der Glutamatrezeptoren zu den Hauptvermittlern der schnellen exzitatorischen synaptischen Transmission im Zentralnervensystem. Deren Funktionsstörung ist mit zahlreichen neurologischen Erkrankungen assoziiert. Folglich widmen sich viele Forscher der Untersuchung von Struktur und Funktion von iGluRs. Trotz des neuesten Fortschritts bei der Auflösung ihrer strukturellen Architektur und Dynamik, konnten bisher nur wenige Methoden die Dynamiken in der Membrandomäne aufklären. Hier präsentiere ich ein optogenetisches Verfahren, welches die Aufklärung der Dynamiken der AMPA Rezeptor Transmembrandomäne (TMD) zum Ziel hat. Für diese Methode wurde der positions-spezifische Einbau von photo-aktiven unnatürlichen Aminosäuren (UAAs) eingesetzt. Auf diese Weise erzeugten wir photo-kontrollierbare AMPA Rezeptoren, die mit hoher räumlicher und zeitlicher Präzision gesteuert werden können, indem Licht als orthogonales Inputsignal genutzt wurde. Wir bauten die UAAs p-benzoyl-L-phenylalanine (BzF) and p-azido-L-phenylalanine (AzF) an 30 individuellen Positionen quer durch die TMD von der AMPA Rezeptoruntereinheit GluA2 ein. Elektrophysiologische Messungen an outside-out patches von Säugetierzellen (HEK 293 Zellen) in Kombination mit synchronisiertem UV-Licht mittels Epi-Beleuchtung führte zu einer Reihe von optischen Effekten auf die Kanalaktivität. Bei 11 verschiedenen Mutanten mit entweder eingebautem AzF oder BzF in die GluA2 TMD, identifizierten wir lichtinduzierte Ver¨anderungen der Rezeptoraktivität, von einer schnellen Inhibition bis hin zu einer Aktivierung. Einer der eindrucksvollsten UV-Effekte kam bei der F579-Position mit eingebautem AzF inmitten der M2 Helix der TMD hervor, die komplexe Veränderungen in der Rezeptorkinetik zeigte nachdem AzF durch UV-Licht aktiviert wurde und sich vernetzte. Der Eintritt in die Desensibilisierung wurde verlangsamt, jedoch, einmal eingetreten, wurde der desensibilisierte Zustand auch stabiler und schien leitfähig zu sein. Die Ergebnisse deuten auf eine zentrale Rolle des M2-Segments beim Gating hin, die über seine gegenwärtig akzeptierte Funktion in der Ionenselektivität hinausgeht. Darüber hinaus lieferten unsere elektrophysiologischen Ergebnisse, ergänzt durch biochemische Experimente, Hinweise für eine Interaktion zwischen der Pre-M1 und M4 Helixe während der Desensibilisierung, die auf eine neuartige Rolle dieser Segmente hinweist. Zusammenfassend lässt sich sagen, dass wir in der präsentierten Arbeit verschiedene bestehende Methoden verfeinerten und so zum ersten Mal systematisch Strukturänderungen innerhalb der Transmembrandomäne von AMPA Rezeptoren während des Gatings erforschen und diese mit den funktionellen Eigenschaften des Ionenkanals in Verbindung bringen konnten.