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Orientador: Marcelo Bispo de Jesus Dissertação (mestrado) - Universidade Estadual de Campinas, Instituto de Biologia Resumo: A nanotecnologia é um dos ramos mais promissores da tecnologia, sendo definida como o design, desenvolvimento e uso de nanopartículas. Dentre as nanopartículas destacam-se as nanopartículas lipídicas sólidas (SLN) que são produzidas a partir de substâncias biocompatíveis e biodegradaveis. Muitos estudos têm sido conduzidos sobre os efeitos positivos de nanopartículas na entrega de fármacos e genes à alvos celulares específicos, mas pouco se discute sobre seus efeitos citotóxicos em diferentes linhagens ou sua interferência em vias de sinalização intracelular. Este estudo aborda os mecanismos moleculares ativados pela SLN em células não-tumorais (PNT1A) e tumorais de próstata (PC-3), tendo como foco a via do TGF-? e vias relacionadas, como as vias PI3K/Akt/mTOR e p38, observando os gatilhos e impactos originados pela SLN nas células. Esse estudo observou que as SLN são menos tóxicas do que o SLNplexo em ambas linhagens, porém apresenta maior toxicidade em células PNT1A; além disso, observou-se que a macropinocitose é parte importante do processo de internalização do SLNplexo em ambas as linhagens; que a via do TGF-? está envol- vida com os mecanismos de transfecção celular em ambas as linhagens celulares, entretanto de maneiras distintas; e que algumas das diferenças observadas podem ser causadas por um maior ou menor escape endossomal do SLNplexo. A compreensão dos mecanismos moleculares disparados por nanomateriais, tal qual seus impactos para o funcionamento celular, são essenciais para a segurança no uso das mesmas e ainda possibilitam o desenvolvimento de melhorias nas técnicas atuais e de novos nanomateriais Abstract: Nanotechnology is one of the most promising branches of technology, being defined as the design, development and use of nanoparticles. Among the nanoparticles, solid lipid nanoparticles (SLN) stand out, which are produced from biocompatible and bio- degradable substances. Many studies have been conducted on the positive effects of nanoparticles in the delivery of drugs and genes to specific cellular targets, but little is discussed about their cytotoxic effects in different lineages or their interference in intracellular signaling pathways. This study observed that the SLNs are less toxic than the SLNplex in both cell lineages, but show greater toxicity in PNT1A cells; in addition, it was observed that macropinocytosis is an important part of the SLNplex internalization process in both cell lines; that the TGF-? pathway is involved with cell transfection mechanisms in PNT1A and PC3 cells, however in different ways; and that some of the differences observed may be caused by a greater or lesser SLNplex endosomal escape. Understanding the molecular mechanisms triggered by nanomaterials, as well as their impacts on cellular functioning, are essential for their safe use and also allow the development of improvements in current techniques and new nanomaterials Mestrado Bioquímica Mestra em Biologia Funcional e Molecular CAPES 88887.657609.2021-00

Orientadores: Eneida de Paula e Iola Messias Fernandes Duarte, Lígia Nunes de Morais Ribeiro Tese (doutorado) - Universidade Estadual de Campinas, Instituto de Biologia e Universidade de Aveiro Resumo: A articaína (ATC) é um anestésico local (AL) relativamente novo no mercado e, apesar disso, é o segundo mais utilizado na clínica odontológica. Uma vantagem de seu uso provém de peculiaridades químicas pois, mesmo pertencendo à família das amino-amidas, possui um anel tiofeno e um grupamento éster que permite sua utilização em maior concentração clínica. Apesar de todos os AL apresentarem neurotoxicidade, há relatos de maior taxa de parestesia associado ao uso de ATC, sem evidências do mecanismo. que comprove maior neurotoxicidade da ATC em relação aos outros AL. Além disso, outro problema relacionado a anestesia odontológica é a falha anestésica ou um menor grau de analgesia que pode ocorrer em locais com processos inflamatórios instalados. Neste caso, o tratamento clínico se torna extremamente doloroso, estressante e sem alternativas para o controle eficaz da dor. Diante destas duas perspectivas sobre o AL, o foco desta tese foi a utilização de toxicometabolômica para aprofundar os conhecimentos sobre a neurotoxicidade da ATC, comparativamente à lidocaína (Parte 1) e o desenvolvimento de formulações de carreadores lipídicos nanoestruturados (NLC) para a liberação sustentada de ATC, visando aumentar sua potência anestésica em tecidos inflamados (Parte 2). Parte 1: Nesta primeira etapa utilizamos metabolômica por Ressonância Magnética Nuclear de hidrogênio (RMN-1H) para estudar a toxicidade da ATC em relação à lidocaína (LDC, "padrão ouro" em odontologia) através das alterações metabólicas ocasionadas em células neuronais. Apesar da literatura indicar que não há diferenças entre ATC e outros AL em relação à toxicidade in vitro, a análise metabolômica em células de Schwann (CS) mostrou que a ATC produz alterações metabólicas diferentes em relação a LDC. Especificamente em CS, descobriu-se que a ATC estimula a glicólise e induz aumento nos níveis intracelulares de vários aminoácidos (leucina, isoleucina, valina, fenilalanina, metionina, histidina, tirosina e glicina), cuja concentração diminuiu nas células tratadas com LDC. Além disso, a expressão de proteínas de estresse de retículo e de apoptose foram encontradas nas células tratadas com ATC. Assim, o estudo in vitro da metabolômica identificou respostas metabólicas diferenciais que nos permitem questionar se sua toxicidade da ATC é a mesma que a de aos outros AL. Parte 2: Nesta parte, utilizou-se de forma associada o planejamento experimental (DoE) e modelo de peixe-zebra para selecionar o melhor excipiente funcional, óleo de copaíba (OC) e uma formulação otimizada de NLC-ATC. A formulação otimizada foi caracterizada por DSC, DRX e MET e in vivo, no modelo de dor inflamatória induzida por carragenina, promoveu aumento (50%) da atividade anestésica e prolongamento da ação, em comparação com ATC livre, com a ação sinérgica (entre OC e ATC) no controle da dor inflamatória. Além disso, os resultados de farmacocinética, utilizando microdiálise in situ, identificaram que o maior efeito anestésico decorre da liberação prolongada do AL pela NLC-ATC no tecido inflamado, evitando sua remoção sistêmica acelerada, em resposta ao processo inflamatório. Assim, a formulação NLC-ATC (funcionalizada e otimizada) apresentou resultados promissores contra a falha anestésica em tecido inflamado, constituindo possível opção inovadora para o mercado odontológico Abstract: Articaine (ATC) is one of the new local anesthetics (LA) released in the market, although it is already the second most used LA in the dental clinic. While it is considered an anesthetic of the amino-amide type, it has some chemical peculiarities such as a thiophene ring and an ester group, which bring some advantages, namely its use in a higher clinical concentration. Although all LAs present neurotoxicity, there are reports of a higher rate of paresthesia associated with the use of ATC. However, the reason for this is not clear and there is no concise literature about the greater neurotoxicity of ATC compared to other LAs. In addition, another problem related to dental anesthesia is the anesthetic failure, or a lower degree of analgesia, that can occur in places with an inflammatory process. In this case, the clinical treatment becomes extremely painful, stressful and without alternatives for effective pain control. Given these two perspectives about LAs, the focus of this work was the use of toxicometabolomics to deepen the knowledge about the neurotoxicity of ATC in relation to lidocaine (LDC) (Part 1) and the development of formulations of nanostructured lipid carriers (NLC) for sustained release of ATC to increase its anesthetic potency in inflamed tissue (Part 2). Part 1: In this part, we used Proton Nuclear Magnetic Resonance (1H-NMR) metabolomics to study the biological effects of ATC in relation to LDC (LDC, "gold standard") through the detection of metabolic changes caused in neuronal cells. Despite the literature indicating that there are no differences between ATC and other LAs in relation to in vitro toxicity, metabolomics analysis in Schwann cells (SC) showed that ATC produces different metabolic changes in relation to LDC. Specifically, ATC was found to stimulate glycolysis and to induce increases in intracellular levels of several amino acids (leucine, isoleucine, valine, phenylalanine, methionine, histidine, tyrosine, and glycine), while the concentration of these amino acids decreased in lidocaine-treated SC. In addition, ATC produces greater changes in the rate of cellular oxygen consumption compared to LDC. Besides, the expression of proteins indicates the presence of reticulum stress and apoptosis in ATC-treated cells. Thus, the in vitro metabolomics study of ATC identified differential metabolic responses which allow us to question whether its toxicity is the same in relation to other LAs. Part 2: In this part, Design of Experiments (DoE) and zebrafish model were used to select the best functional excipient, copaiba oil (CO), and to obtain an optimized formulation of NLC-ATC. Afterwards, optimized NLC-ATC were characterized by DSC, XRD and MET. In vivo, in the carrageenan-induced inflammatory pain model, NLC-ATC showed an increase (50%) in the anesthetic activity and a prolonged action time compared to free (non-encapsulated) ATC, with synergistic activity between ATC and CO being observed on inflammatory pain control. In addition, using local tissue microdialysis, the pharmacokinetic results revealed the greatest anesthetic effect to be associated with the ability of prolonged delivery of ATC by NLC-ATC in the inflamed tissue, preventing its accelerated systemic removal due to the inflammatory process. Thus, the functionalized NLC-ATC formulation developed showed promising results in relation to anesthetic failure in inflamed tissue, with an innovative perspective for the dental market Doutorado Bioquímica Doutor em Biologia Funcional e Molecular FAPESP 2017/15174-5 CNPQ 142331/2017-1

Orientador: Carlos Amilcar Parada Tese (doutorado) - Universidade Estadual de Campinas, Instituto de Biologia Resumo: A inflamação é um processo vital para a restauração do tecido lesado apresentado com uma importante característica a dor inflamatória. Nesse contexto, a via da ciclooxigenase (COX) está fortemente relacionada ao processo inflamatório e doloroso. Normalmente, a isoforma da COX-1 é descrita como homeostática, enquanto a COX-2 é caracterizada como induzível na condição inflamatória. Embora seja bem estabelecido que as células neutrofílicas estejam fortemente envolvidas no processo inflamatório, sendo as primeiras a chegar ao local inflamado, ainda não há evidências sobre o papel específico da COX-2 derivada de neutrófilos neste processo. Assim, no presente estudo, demonstramos pela primeira vez que a COX-2 derivada de neutrófilos desempenha um papel fundamental na hiperalgesia inflamatória periférica. Em nosso estudo, camundongos knockout condicional para Cox-2 em neutrófilos (Cox-2-/-) exibiram maior sensibilidade à dor após injeção de carragenina (CG) e hiperalgesia induzida por IL-1beta de longa duração em comparação com o grupo controle (Cox-2+/+). Além disso, a inflamação induzida por CG em camundongos Cox-2-/- levou a superexpressão de COX-1, além do aumento da migração de neutrófilos e citocinas pró-inflamatórias (por exemplo, IL-1beta e CXCL-1). Em contraste, após estimulação in vitro com LPS, os neutrófilos Cox-2-/- apresentaram níveis mais baixos de IL-1beta e CXCL-1 em comparação ao grupo controle. Nossos achados revelam que a COX-2 derivada de neutrófilos têm um papel importante na regulação do processo inflamatório e da hiperalgesia inflamatória Abstract: Inflammation is a vital process for the injured tissue restoration and one of its hallmarks is inflammatory hyperalgesia. The cyclooxygenase (COX) pathway is strongly related to the inflammatory and pain process. Usually, COX-1 isoform is described as homeostatic, while COX-2 is characterized as inducible in inflammatory condition. Although it is well known that neutrophil cells are one of the main cells involved in inflammatory process, and the first to arrive at the inflamed site, there are still no evidence regarding the specific role of neutrophilderived Cox-2 in this process. Thus, in the present study we demonstrate for the first time that neutrophil-derived COX-2 plays a key role in peripheral inflammatory hyperalgesia. Conditional knockout mice for Cox-2 in neutrophil (Cox-2-/-) exhibited higher pain sensitivity after carrageenan (CG) injection and long-lasting IL-1beta-induced hyperalgesia compared with control group (COX-2+/+). Also, CG-induced inflammation in Cox-2-/- mice showed Cox-1 overexpression, and increased neutrophil migration and pro inflammatory cytokines (e.g., IL-1beta and CXCL1). In contrast, after in vitro LPS stimulation, Cox-2-/- neutrophil showed lower levels of IL-1beta and CXCL-1 compared to the control group. These findings revealed that neutrophils COX-2 has an important role in regulation the inflammatory process and the inflammatory hyperalgesia Doutorado Fisiologia Doutora em Biologia Funcional e Molecular FAPESP 2017/07162-7 CAPES 001

Orientadores: Fabio Marcio Squina, André Ricardo de Lima Damásio Tese (doutorado) - Universidade Estadual de Campinas, Instituto de Biologia Resumo: Atualmente, a busca por fontes renováveis de energia e matéria prima é constante devido tanto aos recorrentes problemas ambientais, quanto aos econômicos e sociais resultantes do uso contínuo de combustíveis fósseis. A utilização da biomassa lignocelulósica, por sua vez, apresenta-se como uma oportunidade sustentável, visando à produção de biocombustíveis pela fermentação da celulose e hemicelulose e a possível valorização da lignina para produção de compostos de alto valor agregado. O uso da lignina, contudo, ainda é bastante limitado, sendo esta geralmente incinerada para a produção de energia. Esta fração da biomassa corresponde a um polímero de estrutura complexa, sendo composto por diversas moléculas aromáticas, como, por exemplo, o ácido ferúlico. Alguns microrganismos produzem as chamadas enzimas ligninolíticas, as quais são responsáveis tanto pela degradação polimérica da lignina, quanto por sua assimilação e conversão. Nesse sentido, a descoberta de novas linhagens de microrganismos ligninolíticos juntamente com a compreensão dos seus respectivos sistemas enzimáticos são essenciais para impulsionar os processos de valorização da lignina. Desta forma, o presente trabalho caracterizou uma levedura isolada a partir de um consórcio microbiano cultivado com fragmentos de lignina. Esta levedura, nomeada Rhodosporidium fluviale LM-2 apresenta um genoma de 50,7 Mb com 17.942 genes. Dentre os genes codificadores de proteínas, destaca-se a presença e superexpressão de enzimas ligninolíticas como peroxidases e beta-eterase, bem como de enzimas relacionadas ao metabolismo de aromáticos, como a descarboxilase de ácidos fenólicos (phenolic acid decarboxilase-PDC). Esta última, converte o ácido ferúlico a 4-vinil guaiacol (4-VG), composto de alto valor agregado usado em indústrias alimentícias. Visando a uma aplicação biotecnológica, foram selecionados dois genes candidatos (Rf_PDC_A e Rf_PDC_B) da levedura R. fluviale LM-2 codificadores da enzima PDC para expressão recombinante em Saccharomyces cerevisiae. A linhagem recombinante expressando Rf_PDC_B produziu mais 4-VG do que a linhagem parental quando cultivada em meio rico contendo ácido ferúlico e em meio mínimo contendo hidrolisado lignocelulósico. Neste trabalho, em suma, empregou-se uma combinação de estratégias ômicas as quais permitiram a descrição de vias enzimáticas importantes para a degradação da lignina, sendo que uma delas foi aplicada para produção de biocomposto a partir de resíduos agroindustriais Abstract: Currently, the search for renewable sources of energy and raw material is constant, due to recurrent environmental, economic, and social problems resulting from the continuous use of fossil fuels. The use of lignocellulosic biomass, in turn, presents itself as a sustainable opportunity, aiming at the production of biofuels through the fermentation of cellulose and hemicellulose and the possible valorization of lignin to produce compounds with high added value. However, the use of lignin is still limited, and it is usually burned for energy. Lignin is a polymer with a complex structure composed of several aromatic compounds, such as ferulic acid. Some microorganisms have ligninolytic enzymes responsible for the depolymerization of lignin, as well as the assimilation and conversion of aromatic compounds. Discovering new ligninolytic strains and understanding their enzyme system is essential to improve lignin valorization. In this sense, this work characterized a yeast isolated from a microbial consortium cultured with lignin fragments. This yeast, called Rhodosporidium fluviale LM-2, has a genome of 50.7 Mb with 17,942 genes. Among the protein-coding genes, there is the presence and overexpression of ligninolytic enzymes, such as peroxidases and beta-etherase, as well as enzymes related to the metabolism of aromatic compounds, such as phenolic acid decarboxylase (PDC). This enzyme converts ferulic acid into 4-vinyl guaiacol (4-VG), a high value-added compound used in the food industry. Thus, aiming at a biotechnological application, two genes (Rf_PDC_A and Rf_PDC_B) from R. fluviale LM-2 that encode the PDC enzyme were selected for expression in the yeast model Saccharomyces cerevisiae. The recombinant strain S. cerevisiae Ethanol Red™ expressing the Rf_PDC_B gene increased 4-VG production compared to the parental strain when cultivated in rich medium containing ferulic acid and in minimal medium containing lignocellulosic biomass hydrolyzate. In summary, a combination of omics strategies described important enzymatic pathways for lignin degradation, one of which was applied to the production of bioproducts from agro-industrial residues Doutorado Bioquímica Doutora em Biologia Funcional e Molecular FAPESP 2017/08166-6 CAPES 001

Orientador: Andre Schwambach Vieira Dissertação (mestrado) - Universidade Estadual de Campinas, Instituto de Biologia Resumo: Poucas regiões cerebrais recebem tanta atenção quanto o hipocampo, uma estrutura neural que está envolvida em funções como aprendizagem, formação e armazenamento de memórias. As principais sub-regiões do hipocampo são o giro denteado (GD) e as camadas de neurônios piramidais: CA1, CA2 e CA3. Além disso, esta estrutura pode ser afetada por uma pluralidade de distúrbios psiquiátricos e neurológicos, como depressão, esquizofrenia, Alzheimer e epilepsia. Atualmente o canabidiol (CBD), um dos principais canabinóides presentes na Cannabis sativa, tem sido uma alternativa terapêutica para uma pluralidade de distúrbios. O CBD interage com os receptores endocanabinóides e também modula vários sistemas de sinalização não endocanabinóides. O receptor endocanabinóide CB1 é o receptor acoplado à proteína G mais abundante no sistema nervoso, e é encontrado amplamente expresso em todas as sub-regiões hipocampais. Assim, o CBD já foi explorado como estratégia terapêutica mostrando efeitos anticonvulsivante, neuroprotetores e antiepilépticos sob diversas condições, tanto em humanos quanto em modelos animais. Investigações anteriores já revelaram diversos efeitos da administração do CBD, no entanto, não há dados sobre alterações no transcriptoma para os efeitos do CBD em sub-regiões hipocampais. No Capítulo I da presente dissertação exploramos a heterogeneidade da expressão gênica do hipocampo de ratos usando microdissecção a laser para isolar suas diferentes sub-regiões (CA1, CA2, CA3, DG) e assim traçar o perfil de transcritos de cada uma delas. No Capítulo II, utilizando RNA-Seq, exploramos as alterações transcriptômicas no CA1 ventral do hipocampo de camundongos adultos após a administração intraperitoneal (i. p.) de CBD. No Capítulo I encontramos uma segregação evidente do perfil transcriptômico de diferentes regiões do hipocampo, observando milhares de genes diferencialmente expressos, além da expressão de genes marcadores conhecidos, bem como novos, específicos para cada região. No Capítulo II encontramos uma evidente segregação do perfil transcriptômico de diferentes frequências de administração do CBD. A análise de enriquecimento dos genes após a administração do CBD durante 7 dias indica uma redução nos transcritos da cadeia de transporte de elétrons e biogênese ribossomal, enquanto transcritos relacionados à modificações de cromatina e organização de sinapse foram encontrados aumentados. Além disso, os transcritos após a administração do CBD administrado em apenas 1 dia estavam associados apenas a processos de ubiquitinação. O presente conjunto de dados contribui para a compreensão mais profunda dos efeitos CBD na expressão gênica e fornece evidências de uma extensa mudança nos genes do metabolismo energético e na redução marcada da maquinaria de tradução de proteínas nos neurônios do CA1 ventral Abstract: Few brain regions are given as much attention as the hippocampus, a neural structure that is involved in functions such as learning, training and storage of memories. The main subfields of the hippocampus are the dentate gyrus (DG) and the pyramidal neurons: CA1, CA2 and CA3. In addition, this structure can be affected by a plurality of psychiatric and neurological disorders such as depression, schizophrenia, Alzheimer and epilepsy. Currently cannabidiol (CBD), one of the main cannabinoids present in Cannabis sativa, has been a therapeutic alternative for a plurality of disorders. CBD interacts with the endocannabinoid receptors and also modulates multiple non-endocannabinoid signaling systems. The endocannabinoid CB1 receptor is the most abundant G protein coupled receptor of the nervous system, and is found extensively expressed in all hippocampal subfields. Thus, CBD has already been explored as a therapeutic strategy showing anticonvulsant, neuroprotective, and antiepileptic effects under various conditions, both in humans and animal models. Previous investigation has already provided insights of the CBD administration, however, there is no transcriptome data for CBD effects on hippocampal subfields. In Chapter I, we explore the heterogeneity of the rat’s hippocampal gene expression using laser microdissection to isolate its different subfields (CA1, CA2, CA3, DG). In Chapter II, we explore the transcriptomic changes in the ventral CA1 of the adult mice hippocampus after intraperitoneal CBD administration. In Chapter I, we find thousands of differentially expressed genes and an evident segregation of the hippocampal subfields transcriptional profiles. In Chapter II we found evident segregation of the transcriptomic profile from CBD administration frequencies. The enrichment analysis of the 7 days of CBD administration indicates a decrease of electron transport chain and ribosome biogenesis transcripts, while chromatin modifications and synapse organization transcripts were found increased. Furthermore, transcripts of CBD administered once were only associated with the ubiquitin processes. The present dataset contributes to a deeper understanding of the CBD effects on gene expression and provides evidence that CBD induces an extensive change in energy metabolism genes and marked reduction of protein translation machinery in ventral CA1 neurons Mestrado Fisiologia Mestre em Biologia Funcional e Molecular CAPES 88887.373126/2019-00

Orientadores: Fernanda Ramos Gadelha, Danilo Ciccone Miguel Dissertação (mestrado) - Universidade Estadual de Campinas, Instituto de Biologia Resumo: O Trypanosoma cruzi é um protozoário geneticamente diverso causador da doença de Chagas (DC) que é considerada uma doença negligenciada de preocupação mundial. Em sua fase crônica é capaz de gerar uma grande incapacitação em seus portadores que podem ser assintomáticos, ou, evoluir para um comprometimento cardíaco, digestivo ou ambos. Até o momento, não existe um consenso a respeito da causa da diversidade das manifestações clínicas desta doença, havendo a necessidade da descoberta de marcadores moleculares de identificação da evolução da DC e de fármacos mais eficientes. Na tentativa de investigar a contribuição do parasita na patogênese da DC, realizamos a análise proteômica, utilizando espectrometria de massas nanoflow LC-MS / MS, de oito isolados de T. cruzi obtidos de pacientes com as diferentes formas clínicas da doença. Os isolados provenientes de portadores da mesma forma clínica foram agrupados. As proteínas foram identificadas através do software MaxQuant fazendo uso do banco de dados UniProt. Os resultados foram estatisticamente processados fazendo uso dos testes t-student e ANOVA. Em seguida, as proteínas identificadas foram submetidas ao banco de dados de tripanossomatídeos TriTrypDB para a realização de análises de ontologia genética e verificação do envolvimento das proteínas identificadas nos componentes celulares, processos biológicos e funções moleculares. Além disso, foram realizadas análises de enriquecimento de vias metabólicas para detectar as vias mais expressas. Embora sejam parasitas envolvidos em diferentes manifestações da doença foi identificada uma grande quantidade de proteínas caracterizadas e putativas compartilhadas entre os grupos analisados (1614 proteínas), o que configura um metabolismo central comum entre os parasitas. Por outro lado, identificamos diferenças pontuais, onde o grupo dos isolados indeterminados, cardíacos, digestivo e cardiodigestivo apresentaram respectivamente 46, 88, 37 e 46 proteínas exclusivas, além de níveis distintos de expressão de proteínas compartilhadas entre os grupos analisados. Nas análises de enriquecimento o grupo indeterminado apresentou-se sempre menos enriquecido que os demais grupos. Com os resultados obtidos neste trabalho ressalta-se a existência de um metabolismo central compartilhado por diferentes isolados de T. cruzi e diferenças pontuais nos diferentes grupos. Uma discussão das proteínas mais abundantes encontradas e a contribuição para o metabolismo do parasita é discutida Abstract: Trypanosoma cruzi is a genetically diverse protozoan that causes Chagas disease (CD) and is considered a neglected disease of worldwide interest. In its chronic phase, it is capable of causing great incapacitation in its patients, who can be asymptomatic, progress to cardiac, digestive or both. So far, there is no consensus on the cause of the diversity of clinical manifestations of this disease, with the need to discover molecular markers to identify the evolution of CD and more effective drugs. In an attempt to investigate the contribution of the parasite in the pathogenesis of CD, we performed proteomic analysis, by means of LC-MS / MS nanoflow mass spectrometry, of eight T. cruzi isolates obtained from patients with different clinical forms of the disease. Isolates from carriers of the same clinical form were pooled. Proteins were identified using MaxQuant software using the UniProt database. The results were processed statistically using t-student and ANOVA tests. Then, the identified proteins were submitted to the TriTrypDB trypanosomatids database for analysis of genetic ontology and verification of the involvement of the identified proteins in cellular components, biological processes and molecular functions. Furthermore, enrichment analyzes of metabolic pathways were performed to detect the most expressive pathways. Although the parasites are involved in different manifestations of the disease, a large amount of characterized and putative proteins shared between the analyzed groups (1614 proteins) was identified, which configures a common central metabolism among the parasites. On the other hand, we identified specific differences, where the group of indeterminate isolates, cardiac, digestive and cardiodigestive presented respectively 46, 88, 37 and 46 exclusive proteins, in addition to distinct levels of expression of proteins shared between the analyzed groups. Furthermore, in enrichment analyses, the indeterminate group was always less enriched than the other groups. The results obtained in this work emphasize the existence of a central metabolism shared by different T. cruzi isolates and specific differences in different groups. A discussion of the most abundant proteins found and their contribution to parasite metabolism is discussed Mestrado Bioquímica Mestra em Biologia Funcional e Molecular CNPQ 134289/2019 FAPESP 2015/24595-9

Orientadores: Gonçalo Amarante Guimarães Pereira, Francisco Javier Medrano Martin Tese (doutorado) - Universidade Estadual de Campinas, Instituto de Biologia Resumo: Os genes que codificam para a 6-oxopurina fosforribosiltransferase (HPRT, EC2.4.2.8) dos organismos Pyrococcus horikoshii e Schistosoma mansoni foram clonados em vetores de expressão. As proteínas foram expressas e purificadas em larga escala no sistema de expressão de Escherichia coli. Estudos cinéticos mostraram que a enzima de P. horikoshii é capaz de usar hipoxantina, guanina e xantina. Os dois primeiros substratos apresentam uma eficiência catalítica semelhante. A xantina apresenta um valor menor (ao redor de 20 vezes mais baixo), mas a constante catalítica é comparável com a da hipoxantina. A proteína não foi capaz de se ligar a GMP-agarose, mas sim pode ligar o outro substrato da reação reversa, pirofosfato inorgânico, com baixa afinidade (Kd = 4,7 ± 0,1 mM). Os dados de espalhamento dinâmico de luz, gel filtração e espalhamento de raios X a baixo ângulo mostram que esta proteína é um homohexâmero em solução. Este hexâmero é compacto e resistente à ação limitada de enzimas proteolíticas. Estudos de estabilidade frente a agentes químicos mostraram que a proteína é bastante estável resistindo os efeitos da uréia sem desenovelar completamente com a maior concentração do agente (8,0 M). Os dados obtidos com cloreto de guanidina mostraram que a proteína possui, no mínimo, um estado intermediário de desnaturação, como mostram os diferentes perfis obtidos com as diferentes técnicas usadas nos estudos de desnaturação. Os dados preliminares obtidos com a HPRT de S. mansoni mostraram que, na presença da cauda de histidinas, a proteína está presente como um octâmero alongado. Mas, muito provavelmente ela deve ser um tetrâmero. A presença de caudas fusionadas nas proteínas recombinantes pode afetar a estrutura e função das proteínas Abstract: The genes that code for the 6-oxopurine phosphoribosyltransferase (HPRT, EC2.4.2.8) from the organisms Pyrococcus horikoshii and Schistosoma mansoni were cloned in expression vectors. The proteins were expressed and purified in large scale in the de Escherichia coli expression system. Kinetic studies showed that the enzyme from P. horikoshii is able to use hypoxanthine, guanine and xanthine. The first two substrates show a similar catalytic efficiency. Xanthine show a lower value (around 20 times), but the catalytic constant is comparable to that of hypoxanthine. The protein was unable to bind to GMP-agarose, but was able to bind the other substrate of the reverse reaction, inorganic pyrophosphate, with low affinity (Kd = 4.7 ± 0.1 mM). Dynamic light scattering, gel filtration and small angle X-ray scattering data show that the protein is a homohexamer in solution. This hexamer is compact and resistant to the limited action of proteolytic enzymes. Stability studies with chemical agents showed that the protein is very stable being able to stand the effects of urea without unfolding completely at the highest agent concentration (8.0 M). Data obtained with guanidine hydrochloride showed that the protein presents, at least, one unfolding intermediate state, as can be seen with the different profiles obtained with different techniques used in the unfolding studies. Preliminary data obtained from HPRT from S. mansoni showed that in the presence of the histidine tag, is present as a long octamer. But, most likely it should be a tetramer. The presence of histidine tag fused to the recombinant proteins could affect the structure and function of proteins Doutorado Bioquímica Doutor em Biologia Funcional e Molecular

Orientador: Alba Regina Monteiro Souza Brito Tese (doutorado) - Universidade Estadual de Campinas, Instituto de Biologia Resumo: Onodorpicrina, uma sesquiterpeno lactona, presente nas folhas de Arctium Lapa L. demonstrou através dos estudos de Barbosa et at (1993) erficaz atividade farmacológica. Com base nesses resultados e, devido ao fato, de nosso laboratório possuir estudos em relação à atividade antiulcerogênica de outras sesquiterpeno lactonas (desidrocrotonina e crotonina) obtidas das cascas de Croton cajucara Benth, decidimos estudar a atividade antiulcerogênica e antiinflamtória intestinal da fração semi-purificada (ONP), cujo composto majoritário é a onopordopicrina. Primeiramente estudamos o efeito da citotoxicidade da ONP avaliado através da viabilidade celular em fibroblastos (V79) de pulmão de Hamster chinês. A ONP apresentou IC50 aproximadamente de 15µM nos ensaios de MTT, vermelho neutro e conteúdo de ácido nucléico. Por ser uma substância com uma toxicidade relativa resolvemos estudar o efeito antitumoral dessa substância em linhagem celular de leucemia promielocítica (HL60) usada como modelo para estudos antitumorais. Da mesma forma que nos ensaios de citotoxidade, a ONP apresentou IC50 aproximadamente de 15 µM em ensaios de MTT e PTP. Para avaliar a atividade antiulcerogênica da ONP, foram utilizadas diferentes doses em modelos clássicos de indução de úlcera: etanol/HCl, estresse por imobilização e frio, indometacina e ligadura de piloro. Em todos os modelos a ONP apresentou atividade antiulcerogênica significativa. Nos procedimentos seguintes, avaliamos a atividade antisecretora da ONP através de ensaios de somatostatina e gastrina, nos quais a substância apresentou aumento da liberação e/ou produção de somatostatina e diminuição da produção e/ou liberação de gastrina. Em relação ao estudo da ONP em experimentos de muco e óxido nítrico, essa não apresentou diferença significativa. No entanto, promoveu diferença significativa no modelo de avaliação do envolvimento de radicais sulfidrila, indicando uma possível atividade antioxidante. Quando avaliada em modelo de colite ulcerativa induzida por TNBS, a ONP apresentou significativa proteção provavelmente pelo envolvimento da mieloperoxidase (MPO) e fator de necrose tumoral (TNF-alfa). Visto a atividade obtida com a ONP, resolvemos analisar a atividade do chá de Arctium lappa, o qual apresentou significativa envolvimento com óxido nítrico e grupamento sulfidrila para a obtenção da atividade antiulcerogência promovida pelo chá. Os resultados obtidos com a Arctium lappa são promissores, por causa de sua significativa proteção contra úlceras induzidas por diferentes agentes, sugerindo um efeito antisecretor mediado por sua ação na secreção de Somatostatina e Gastrina e um efeito protetor proporcionado pela propriedade antioxidante presente na ONP. Os dados também revelaram que o pré-tratamento com ONP é capaz de reduzir a inflamação intestinal produzida através do modelo de indução de colite ulcerativa por TNBS em ratos. O efeito agudo antiinflamatório provavelmente está relacionado com a diminuição de neutrófilos e diminuição da produção de TNF-a na mucosa intestinal. Nossos resultados sugerem um significativo potencial terapêutico da ONP na area gastrointestinal Abstract: Onodorpicrin, a sesquiterpene lactone, present in the leaves of Arctium lappa L., showed through the studies of Barbosa et al (1993) effective pharmacological activity. Based on those results and due to the fact that our laboratory has studies in relation to the antiulcerogenic activity of other sesquiterpene lactone (dehydrocrotonin and crotonin) obtained by barks of Croton cajucara Benth, we decided to study the antiulcerogenic activity and bowel antiinflamatory of the semi-purified fraction (ONP), which majority compound is the onopordopicrin. Firstly we studied the effect of the citotoxicity of appraised ONP through the cellular viability in fibroblast (V79) of lung of Chinese Hamster. ONP presented IC50 approximately of 15µM in the MTT, red neutral and content of nucleic acid experiments. For being a substance with a relative toxicity we decided to study the effect antitumoral of that substance in cellular lineage of promyelocytic leukemia (HL60) used as model for antitumoral studies. In the same way that in the citotoxicity experiments, ONP presented IC50 approximately of 15 µM in experiments of MTT and PTP. To evaluate the antiulcerogenic activity of ONP, different doses were used in classic models of ulcer induction: ethanol/HCl, stress for immobilization and cold, indometacin and pylorus ligature. In all of the models ONP presented significant antiulcerogenic activity. In the following procedures, we evaluated the activity antisecretory of ONP through somatostatin and gastrin experiments, in which the substance presented increase of the liberation and/or somatostatin production and decrease of the liberation and/or gastrin production. In relation to the study of ONP in mucus experiments and nitric oxide, that one didn't present significant difference. However, it showed significant difference in the model of evaluation of the involvement of radicals sulphydryl, indicating a possible antioxidant activity. When evaluated in model of colitis ulcerative induced by TNBS, ONP presented significant protection probably for the involvement of the mieloperoxidase (MPO) and factor of necrosis tumoral (TNF-alpha). Checked the activity obtained with ONP, we decided to analyze the activity of the tea of Arctium lappa, which presented significant involvement with nitric oxide and sulphydryl group for the obtaining of the antiulcerogenic activity promoted by the tea. The results obtained with Arctium lappa are promising, because the significant protection against ulcers induced by different agents suggesting a effect antisecretory mediated through somatostatin and gastrin secretion and protective effect by the antioxidant properties present in ONP. The data also reveals that pre-treatment with ONP is able to reduce intestinal inflammation in theTNBS model of colitis in rats.The acute antiinflamatory effects seem to be related to impairment of neutrophil function and absence of up-regulation of TNF-a production in intestinal mucosa. Our findings suggest that ONP shows an excellent potential for therapy in the gastrointestinal area Doutorado Fisiologia Doutor em Biologia Funcional e Molecular

Orientador: Hiroshi Aoyama Dissertação (mestrado) - Universidade Estadual de Campinas, Instituto de Biologia Resumo: Atualmente, muito tem sido descoberto acerca dos mecanismos de controle do crescimento e coordenação celular, principalmente em células eucarióticas. Dentre tais mecanismos, o balanço entre a fosforilação e a desfosforilação de proteínas é a base para o controle de diversos eventos biológicos. As fosfatases são hidrolases que utilizam como substrato fosfatomonoésteres, e são amplamente distribuídas na natureza. As fosfatases ácidas (FAcs) são enzimas que apresentam melhor atividade em meio ácido. O objetivo do presente trabalho é estudar o efeito de peróxido de hidrogênio em duas fosfatases ácidas cujos sítios ativos contêm cisteína. Para tanto, FAc de sementes de mamona e FAc de rim bovino, ambas obtidas previamente em nosso laboratório, foram utilizadas no estudo. A primeira é uma glicoproteína, ao passo que a segunda não contém carboidrato em sua estrutura. Ensaios enzimáticos utilizando o substrato sintético p-nitrofenilfosfato (pNPP) foram realizados, em diferentes condições de incubação e exposição das enzimas. A FAc de mamona apresentou grande resistência ao peróxido de hidrogênio (H2O2), fato que se mostrou independente da presença de carboidrato em sua estrutura. Ensaios na presença de ditiotreitol (DTT) ou glutationa reduzida (GSH) provocaram inibição da enzima, porém a combinação de DTT ou GSH a H2O2 foi capaz de recuperar completamente a atividade enzimática. A exposição da FAc de mamona a DTT ou GSH não protegeu totalmente o sítio catalítico contra a oxidação por H2O2, apesar de acarretar em menores taxas de inibição por esse composto. A exposição da enzima a H2O2 elevou a sua inibição. A FAc de rim bovino apresentou grande susceptibilidade ao H2O2. Os compostos DTT e GSH provocaram inibição de sua atividade, assim como observado para a FAc de mamona. A combinação de DTT ou GSH a H2O2 não restabeleceu a atividade enzimática, sugerindo que há diferenças no processo de oxidação por esse composto entre as duas FAcs utilizadas nesse trabalho. A exposição da FAc de rim bovino a DTT ou GSH não foi eficaz na proteção do sítio catalítico, e a exposição dessa enzima a H2O2 elevou a inibição da atividade enzimática. Nossos resultados sugerem que as FAcs, independentemente da presença de carboidrato na estrutura, sofreram oxidação de maneiras diferentes, apresentando comportamentos bastante divergentes entre si. Hipotetizamos que a Fac de mamona atingiu um estado reversível de oxidação, sendo que a cisteína tornou-se ácido sulfênico. Já a FAc de rim bovino deve ter alcançado um estado irreversível de oxidação, com a cisteína na forma de ácido sulfínico ou sulfônico Abstract: Currently, much has been discovered about the mechanisms of control of cell growth and coordination, especially in eukaryotic cells. Among such mechanisms, the balance between the phosphorylation and dephosphorylation of proteins is the basis for the control of various biological events. The phosphatases are hydrolases using as substrate phosphate monoesters, and are widely distributed in nature. The acid phosphatases are enzymes that have better activity under acidic conditions. The goal of this work is to study the effect of hydrogen peroxide (H2O2) in two acid phosphatases which contains cysteine in their active site. Therefore, castor bean and bovine kidney acid phosphatases, both previously obtained in our laboratory, were used in this study. The first is a glycoprotein, whereas the second contains no carbohydrate in its structure. Enzyme assays using the synthetic substrate p-nitrophenylphosphate (pNPP) were performed at different incubation conditions and exposure of the enzymes. The castor bean acid phosphatase showed great resistance to H2O2, a fact that was independent of the presence of carbohydrate in their structure. Assays in the presence of dithiothreitol (DTT) or reduced glutathione (GSH) caused enzyme inhibition, but the combination of the GSH or DTT and H2O2 was able to completely recover enzyme activity. Exposure of castor bean acid phosphatase to DTT or GSH did not fully protect the catalytic site against oxidation by H2O2, although result in lower rates of inhibition by this compound. Exposure of the enzyme to H2O2 increased its inhibition. Acid phosphatase from bovine kidney showed high susceptibility to H2O2. The compounds DTT and GSH caused inhibition of its activity, as was observed for castor bean acid phosphatase. For this enzyme, the combination of DTT or GSH to H2O2 not reestablished enzyme activity, suggesting that there are differences in the oxidation process for this compound between the two phosphatases used in this work. Exposure of bovine kidney acid phosphatase to DTT or GSH was not effective in protecting the catalytic site, and the exposure of the enzyme to H2O2 increased the inhibition of enzyme activity. Our results suggest that the acid phosphatases, regardless of the presence of carbohydrate in the structure, underwent oxidation by different ways, presenting quite divergent behaviors. We hypothesize that the castor bean acid phosphatase reached a state of reversible oxidation, and cysteine became sulfenic acid. As for acid phosphatase bovine kidney must have reached a state of irreversible oxidation with cysteine as sulfonic or sulfinic acid Mestrado Bioquímica Mestra em Biologia Funcional e Molecular

Orientador: Gil Lucio Almeida Tese (doutorado) - Universidade Estadual de Campinas, Instituto de Biologia Resumo: A síndrome da dor fêmoro-patelar (SDFP) acomete uma em cada quatro pessoas da população em geral, e é composta por várias lesões que acometem a articulação fêmoro-patelar. O tratamento fisioterapêutico é fundamental na reabilitação dos portadores dessa síndrome, e que tem como uma de suas principais ferramentas o treinamento em cadeia cinética fechada. Dentre as várias formas de realizar esse treinamento, o agachamento é uma das mais utilizadas. Contudo, quando realizado o agachamento, a pessoa nem sempre tem o controle adequado da posição do tronco e dos membros, o que pode favorecer diferentes padrões cinemáticos, cinéticos e eletromiográficos. Portanto o presente estudo teve por objetivo identificar e descrever a estratégia cinética e eletromiográfica usada para realizar o agachamento nas fases ascendente e descendente em sujeitos saudáveis e portadores da SDFP, quando os movimentos são restritos no plano sagital, com padrão cinemático similar na maioria das articulações envolvidas. Oito sujeitos saudáveis e oito portadores da SDFP participaram deste estudo e realizaram o agachamento mantendo os braços flexionados à frente do corpo em duas distâncias, semi-agachamento (de 30º a 50º) e meio-agachamento (de 60º a 80º) na fase descendente. Para a fase ascendente eles realizaram a subida a partir do meio-agachamento. A atividade eletromiográfica dos músculos vasto medial oblíquo, vasto medial longo, reto femoral, vasto lateral, bíceps femoral, semitendinoso, gastrocnêmio lateral e tibial anterior foi registrada. A cinemática das articulações do membro inferior foi reconstruída utilizando-se um sistema óptico de análise de movimento. O centro de pressão (COP) foi obtido utilizando-se dados de uma plataforma de força, e os torques no tornozelo e joelho foram calculados por meio da dinâmica inversa. As tarefas foram eficazes em restringir o movimento no sentido céfalo-caudal em ambos os grupos. Também foi possível identificar e descrever uma estratégia clara para ambas as fases ascendente e descendente do agachamento. O músculo tibial anterior foi o responsável por iniciar o agachamento na fase descendente e se manteve coativado com o gastrocnêmio durante todo o movimento. O quadríceps foi o principal responsável em desacelerar o movimento e não houve grande atividade dos isquiotibiais. Comparado com o grupo controle, o grupo SDFP apresentou menor torque no joelho e menor atividade eletromiográfica do quadríceps, mas o torque no tornozelo e o deslocamento anterior do COP foram maiores durante as duas distâncias, na fase descendente do agachamento. Para a fase ascendente do agachamento, o grupo SDFP apresentou diferença na posição inicial, revelando uma estratégia protetora da articulação fêmoro-patelar. Antes de iniciar o movimento, houve forte ativação do quadríceps, isquiotibiais e gastrocnêmio para vencer a ação gravitacional em ambos os grupos. Comparado com o grupo controle, o grupo SDFP apresentou menor torque no joelho e menor atividade eletromiográfica do quadríceps, mas o torque no tornozelo e o deslocamento anterior do COP foram maiores. As fases de cada tarefa foram descritas e as implicações clínicas discutidas. Palavras chave: torque, centro de pressão, eletromiografia, patela, agachamento Abstract: The patellofemoral pain syndrome (PFPS) affects one in four people in the general population, and is composed of several lesions of the patellofemoral joint. The physical therapy is essential for the rehabilitation of the population with this syndrome, and one of its main tools is the training in closed kinetic chain. Among the several ways of performing that training, the squat is one of the most used. However, when performing it, a person does not always have a proper control of the position of the trunk and of the limbs, what can produce different kinematic, kinetic and electromyographic patterns. Therefore, the present study had as an objective identifying and describing the kinetic and electromyographic strategy used to perform the squat in the ascending and descending phases by people with and without PFPS, when the movements are restricted in the sagittal plane, with a similar kinematic pattern in most of the involved joints. Eight healthy subjects and eight with PFPS participated in this study and they performed the squat keeping the upper arm elevated at 90º at the shoulder joint, just in front of the body in two distances, semisquatting (30º to 50º) and half squatting (60º to 80º) in the descending phase. For the ascending phase they performed the ascent from the half squatting. The electromyographic activity of the vastus medialis oblique, vastus medialis longus, rectus femoris, vastus lateralis, biceps femoris, semitendineous, gastrocnemius lateralis and tibialis anterior muscles was registered. The joint kinematics of the inferior limbs was reconstructed using an optical system for movement analysis. The center of the pressure (COP) was obtained using data from a force plate and the joint torques in the ankle and knee were calculated using inverse dynamics. The tasks were effective in restricting the movement in the cefalo-caudal direction for both groups. Moreover, it was possible to identify and to describe a clear strategy for both the ascending and the descending phases of the squat. The anterior tibialis muscle was the responsible for beginning the squatting in the descending phase, and kept co-activated with the gastrocnemius during the whole movement. The quadriceps was mainly responsible for decelerating the movement and there was not great activity of the hamstrings. Compared to the control group, the PFPS group presented smaller knee torque and smaller quadriceps electromyographic activity, but the ankle torque and the COP displacement to the anterior direction were larger in the two distances, in the descending phase of the squatting. For the ascending phase of the squatting the PFPS group presented difference in the initial position, revealing a protecting strategy for the patellofemoral joint. Before beginning the movement, there was a strong activation of the quadriceps, hamstrings and gastrocnemius. This was necessary for the motor control system to generate the forces that overcome the inertia of the limb and resist the flexion force acting on the knee due to gravity in both groups. Compared to the control group, the PFPS group presented smaller torque in the knee and smaller electromyographic activity of the quadriceps, but the ankle torque and the COP displacement to the anterior direction were larger. The phases of each task were described and clinical implications were discussed. Key words: torque, center of the pressure, electromyographic activity, patella, squat Doutorado Fisiologia Doutor em Biologia Funcional e Molecular

Orientador: Gil Lucio Almeida Dissertação (mestrado) - Universidade Estadual de Campinas, Instituto de Biologia Resumo: O objetivo deste estudo foi investigar as estratégias de ajustes posturais utilizadas durante o balanço em gangorra, assim como o efeito do. treino. Sujeitos. Seis indivíduos neUI'OIogicamente normais (NN) e seis portadores da síndrome de Down (SD) participaram deste estudo. Métodos. Os indivíduos foram treinados a ba_iÇar em uma gangorra e foram testados antes e após o treino em gangorras com nove índices de dificuldade diferentes. Os _ou1os das articulações do quadril, joelho e tornozelo, a atividade eletromiográfica de alguns músculos da perna e do tronco, e o deslocamento do centro de pressão foram registrados. Resultados. Os indivíduos NN mantiveram o equilíbrio na gangorra devido principalmente a movimentos da articulação do tornozelo, sendo estes movimentos correlacionados com o deslocamento do centro de pressão. Eles utilizaram um padrão alternado de atividade dos músculos gastrocnêmico medial e tibial anterior e foram capazes de modular a quantidade de oscilação postural baseado na demanda mecânica da tarefa. A ordem desta alternância muscular foi em direção oposta ao estiramento. Por exemplo, quando o tornozelo moveu em flexão dorsal, o músculo gastrocnêmico foi estirado, mas o tibial anterior foi o músculo ativado. O treino não afetou o balanço na gangorra. Os Indivíduos portadores da síndrome de Down demostraram uma dificuldade em correlacionar os movimentos das três articulações estudadas. com o deslocamento do centro de pressão. Ao contrário dos NN, os indivíduos SD não alternaram a atividade dos músculos agonistas e antagonistas responsáveis pelo movimento do tornozelo. Eles apresentaram um padrão de co-ativação generalizada mesmo para as condições mais estáveis, e foram incapazes de modular as respostas de acordo com a demanda mecânica da tarefa. O 1reino aumentou as possibilidades destes indivíduos balançarem na gangorra, mas não alterou a estratégia de manutenção do equníbrio. Conclusão e Discussão. Este estudo confirma a idéia de que o balanço na gangorra é possível principalmente devido a movimentos do tornozelo (Ivanenko et aL, 1997) e mostra o uso de uma estratégia semelhante a do pêndulo invertido. Primeiro, observamos que os indivíduos NN inibiram o músculo estirado devido talvez a uma projeção supra-segmentar. Segundo, o treino não afetou a estratégia de manutenção do equilíbrio. Terceiro, os indivíduos portadores da síndrome de Do-wn utilizaram um estratégia diferente da utilizada pelos NN, mas esta estratégia foi suficiente para garantir o balanço. Ao contrário do que tem sido mostrado na literatura (Almeida, et aI., 1994), eles não alcançaram um nível de performance motora semelhante ao nível dos indivíduos NN após o treino. Esta estratégia adotada pelos indivíduos portadores da síndrome de Down parece ser uma resposta adaptativa a possíveis déficits no sistema de controle postural. Sendo esta resposta uma adaptação deveria o fisioterapeuta intervir na tentativa de mudar esta estratégia? Nossos dados suportam a idéia de que a reabilitação deve enfatizar a função e não o modelo de movimento. No entanto, antes de embarcarmos em um novo tratamento, novos estudos são necessários para mostrar se estas respostas adaptativas podem ou não ser mudadas sem detrimento da função Abstract: The purpose of this study was to investigate the postural adjustments and the effects of practice during balance on seesaw. Subjects. Six individuals with Down syndrome and six neurological normal individuals (NN) took part of this study. Methods. The individuals were trained to balance on one seesaw and were tested before and after practice on nine different seesaws. We recorded the LED marks that were placed on the center or hip, knee and ankle joints and the EMG activities of the some leg and trunk muscles. Results. Neurological Normal individuals maintained balance mainly using ankle movements, and these movements were correlated with the displacement of the center of pressure. They demonstrated an alternated pattern of ankle agonist and antagonist muscles activities and were able to moduIate the amount of balance based on the mechanical dernand of each io, tenns or degree of stability. The order of this alternation was io the opposite direction of the stretched muscle. For cxample, when the. ankle was moved into dorsal fIexion the gastrocnemium was stretched but the anterior tibialis was activated. Training did not affect t.he balance on seesaw. Individuals with Down syndrome demonstrated a difficulty to corre1ate the joints movements with center of pressure displacement. Contrary to NN, the Down syndrome individuals did not alternated the EMG activities. They co-activated the agonist and antagonist ankle muscles even for easy conditions and were unable to modulated the answer with mechanical demand of the task. Training increased the ,possibilities of these individuals balance on seesaw, but clid not change their postural strategy. Conclusion and Discussion. This study confirm the idea that the balance on seesaw i8 achieved mainly by changing the ankle joint (Ivanenko et aL, 1997) and show that the NN individuals use a strategy similar to the inverted pendulum. First,. we observed that these individuals inhibited the stretching muscle using perhaps a suprao ó segmental projection. Second, the training did not affect the balance strategy for both groups. Third, too Down syndrome used a different strategy compared with normal individuals and their strategy was enough to assure balance. Contrary to the others studies (A1meida, et al., 1994) they- did not change their muscle and cinematic strategy of balance after training. it¿s seems that the strategy that they use is an adaptive response to deficits on postural control If this is an adaptive response the Physical Therapist should try changing these strategy? Our study supports the idea that the rehabilitation should emphasize the motor function and not the movement patter However, before embarking in a new therapeutic tractate; new studies are need to show if the adaptive response used by the individuals with Down syndrome balance on seesaw can be changed 'without any detriment of their ability to balance on seesaw Mestrado Fisiologia Mestre em Biologia Funcional e Molecular

Orientador: Marta Helena Krieger Dissertação (mestrado) - Universidade Estadual de Campinas, Instituto de Biologia Resumo: O óxido nítrico (NO) é um multifuncional agente biológico que nas últimas décadas tem sido alvo de uma infinidade de estudos e constitui hoje um dos mais importantes mediadores de processos intra e extracelulares. Diversos estudos demonstram sua capacidade de prevenção da ativação e adesão plaquetária ou leucocitária e inibição da proliferação e migração de células musculares lisas vasculares (VSMCs), entretanto, em condições de baixa disponibilidade do NO esses processos são prejudicados. Atualmente há o grande interesse no desenvolvimento de compostos capazes de liberar NO de forma modulada e estável, e, nesse sentido, os complexos nitrosilos de rutênio têm se destacado por suas características excepcionais. É amplamente reconhecido que a modulação fenotípica de VSMCs tem papel crítico na progressão de diversas doenças vasculares proeminentes. Sabe-se que o fator de crescimento derivado de plaquetas (PDGF-BB) é um dos principais estimulantes desse processo. Este estudo se propôs a caracterizar os efeitos inibitórios do complexo de rutênio trans-[Ru(NO)Cl(cyclam)](PF6)2, nomeado Ru(cyclam)NO, na modulação fenotípica, resposta proliferativa e migratória de VSMCs induzidas por PDGF-BB. VSMCs foram obtidas por técnica de cultura primária. A citotoxicidade do complexo, na faixa de concentração de 100 ?M a 1500 ?M, foi determinada em ensaios de redução do MTT e incorporação neutral red (NR), e comparadas a do nitroprussiato de sódio (SNP). A concentração 100 ?M foi definida para os demais protocolos experimentais. Western blotting, ensaios transwell e wound healing, e incorporação de timidina triciada foram utilizados para determinação da modulação fenotípica, migração e proliferação celular, respectivamente, e níveis de nitrato no meio foram determinados por quimiluminescência para avaliação do perfil de liberação de NO. O complexo demonstrou baixa citotoxicidade, mesmo na maior concentração e após 48 horas de exposição, reduzindo ao máximo em 30% a porcentagem de células viáveis em ambos os ensaios, demonstrando ser menos tóxico que o SNP. Níveis de nitrato no meio atigiram a concentração máxima após 30 minutos (11 ?M ± 4,8), de maneira mais lenta em relação ao SNP, cuja concentração máxima foi após 5 minutos (13 ?M ± 3,7). A proliferação das VSMCs induzida por PDGF-BB foi inibida, reduzindo à metade a radioatividade incorporada, bem como a expressão do marcador de proliferação PCNA. Observou-se redução de 45% na migração induzida por PDGF-BB nos ensaios transwell, e no wound-healing, embora qualitativo, a redução é notável. A modulação fenotípica da VSMC foi observada pela redução em 60% da expressão da proteína alfa-actina, característica do fenótipo maduro, e foi quase totalmente prevenida pelo tratamento com o complexo. Tal prevenção pode ser mediada pelo fator de transcrição ELK-1, que favorece a expressão de genes de diferenciação, e cuja fosforilação foi estimulada pelo PDGF-BB, porém inibida em quase 50% pelo pré-tratamento com Ru(cyclam)NO. As respostas observadas nos tratamentos com Ru(cyclam)NO foram promissoras, e, embora seu mecanismo de ação x ainda não esteja completamente esclarecido, este complexo demonstrou atividade biológica singular, e sua aplicação em condições clínicas onde há descontrole de processos de proliferação e migração de VSMCs, como a reestenose, apresenta-se como uma proposta interessante Abstract: Nitric oxide (NO) is a multifuctional biological agent that in the recent decades has been the subject of a plethora of studies and today is one of the most important intracellular and extracellular processes mediators. Several studies have demonstrated its ability to prevent leukocyte or platelet adhesion and activation, and inhibition of vascular smooth muscle cells (VSMCs) proliferation and migration. However, low availability of NO conditions determines impairement of these processes. There is a keen interest in the development of compounds capable of releasing NO modulated so stable, and the nitrosyl ruthenium complexes have gained prominence for its exceptional features. It is widely recognized that the phenotypic modulation of VSMCs, and its uncontrolled proliferation and migration, plays a critical role in the progression of several prominent vascular diseases. It is known that the platelet-derived growth factor (PDGF) is a primary stimulant of the process. This study aimed to determine the inhibitory effects of the ruthenium complex NO donor trans-[Ru(NO)Cl(cyclam)](PF6)2, named Ru(cyclam)NO, in the phenotypic switching, on migratory and proliferative responses of VSMCs induced by PDGF-BB, and its biological response. VSMCs were obtained from primary culture methodology. The complex cytotoxicity were determined by MTT reduction and incorporation of neutral red (NR) assays, in the range of concentration from 100 ?M to 1500 ?M, and compared to sodium nitroprusside (SNP). For the following experimental protocols the concentration of the 100 ?M was set. Western blotting, transwell and wound healing assays, and incorporation of tritiated thymidine were used for determination of phenotypic switching, cell migration and proliferation, respectively. Evaluation of the NO profile release was determined as nitrate levels in the culture medium by chemiluminescence. The complex Ru(cyclam)NO showed low cytotoxicity even at the highest concentration evaluated and after 48 hours of exposition, reducing only 30% the percentage of viable cells in both trials, showing be less toxic than the SNP. Medium nitrate levels exibhited the highest concentration after 30 min (11 ?M ± 4.8), slower when compared to SNP, which reached the maximum concentration after 5 minutes (13 ?M ± 3.7). The proliferation of VSMCs induced by PDGF-BB was inhibited by half of the radioactivity incorporated counting, as well as the reduction on the expression of the proliferation marker PCNA. Observed a reduction by 45% in the migration induced by PDGF-BB determined in transwell assays, and on the wound-healing, although a qualitative result, the reduction of migration induced by PDGF-BB. The 60% reduction by PDGF-BB treatment of the contractile protein expression ?-SMA, characteristic of mature phenotype, revealed the modulation of VSMCs phenotype, and it was almost completely prevented by treatment with the complex. Such prevention was associated with inhibition by almost 50% of phosphorylation of the transcription factor ELK-1 stimulated by PDGF-BB. The responses determined with complex treatments revealed promising for future development of cardiovascular devices. Although its xii mechanism of action is not completely understood, this complex showed singular biological activity, and its application in some clinical conditions where there is uncontrolled proliferation and migration of VSMCs presents as a substancial proposal Mestrado Fisiologia Mestra em Biologia Funcional e Molecular

Orientador: Sergio Marangoni Tese (mestrado) - Universidade Estadual de Campinas, Instituto de Biologia Resumo: Enquanto estudos estruturais de toxinas de veneno de serpentes são feitos usando amostras de veneno, a construção de cDNAs precursores destas toxinas requer o sacrifício do espécime para a extração da glândula de veneno. No presente trabalho nós descrevemos uma técnica simples para isolar mRNAs presentes em amostras de veneno total. Para ilustrar esta técnica nós amplificamos através de RT-PCR um cDNA que codifica uma PLA2 049 (F6) do complexo crotoxina neurotóxica "in vitro" a partir do veneno total da sub espécie Crotalus durissus collilineatus. Estes achados implicam que a aparente ausência do mRNA em matrizes biológicas complexas não são sempre reais e facilitam a maneira de aquisição acelerada de dados micro evolutivos assim como de estrutura-função desta família de proteínas para serem utilizadas como ferramentas moleculares, sem o sacrifício do animal. O cONA que codifica PLA2 F6 do complexo crotoxina presente no veneno total da sub espécie Crotalus durissus collilineatus foi seqüenciada. A seqüência deduzida de aminoácidos deste cDNA codifica a PLA2 (F6) com alto grau de homologia seqüencial desta família de proteínas PLA2 do grupo 11, incluindo os 14 resíduos de cisteina capazes de dar forma a sete ligações dissulfeto que caracterizam este grupo de PLA2. A PLA2, foi isolada a partir do veneno total da sub espécie Crotalus durissus collilineatus através de coluna de cromatografia convencional de baixa pressão (8ephades G75) e por HPLC fase reversa. A massa molecular foi estimada por espectrometria de massa por MALDI - TOF. Para a identificação desta PLA2 (F6) como uma neurotoxina "in vitro", nós usamos a preparação biventer cervicis de pintainho. A análise filogenética da PLA2 (F6) da sub espécie Crotalus durissus collilineatus mostrou que os subtipos estruturais de N6-PLA2s com a substituição F24 ou 824 evoluíram paralelamente, possivelmente descendendo respectivamente das Protobothrops e a Gloydius dos dias de hoje Abstract: While structural studies of snake venom toxins can be achieved using venom samples, until now the construction of precursor cDNAs required sacrifice of the specimen for dissection of the venom glands. Here we describe a simple and rapid technique that isolation mRNAs present in whole venom samples. To iIIustrate the technique we have RT-PCR amplified the cDNA that it codifies a "in vitro" neurotoxic protein PLA2 049 (F6) from crotoxin complex, from the venom of snake sub specie, Crotalus durissus collilineatus. These findings imply that the apparent absence of mRNA in complex biological matrices is not always real and paves the way for accelerated acquisition of micro evolution as well as of structure-function of this protein family being used as molecular tools, without sacrifice of animal. The cDNA encoding PLA2 F6 from crotoxin complex in the whole venom of sub specie Crotalus durissus collilineatus venom was sequenced. The deduced amino acid sequence of this cDNA encoded PLA2 (F6) with high overall sequence identity of this protein family to the group 11 PLA2, including the 14 cysteine residues capable of forming seven disulphide bonds that characterize this group of PLA2 enzymes. The PLA2, were isolated from the whole venom of sub specie Crotalus durissus collilineatus by the conventional and low pressure chromatography (8ephades G75) column and the reverse phase HPLC. The molecular mass estimated by MALDI-TOF mass spectrometry. For the identified this PLA2 F6 like as a "in vitro" neurotoxin, we use the neuromuscular blocking activities were assayed with the chick biventer cervicis neuromuscular tissue. The sub specie' s Crotalus durissus collilineatus PLA2 (F6) phylogeny analysis showed that two structural subtypes of N6-PLA2s with either F24 or 824 substitution have been evolved in parallel, possibly descended respectively from species related to present-day Protobothrops and Gloydius Mestrado Bioquímica Mestre em Biologia Funcional e Molecular

Orientador: Maria Ligia Rodrigues Macedo Dissertação (mestrado) - Universidade Estadual de Campinas, Instituto de Biologia Resumo: Algumas espécies vegetais podem apresentar em suas sementes, agentes bioquímicos que atuam no mecanismo de defesa da planta. Uma grande variedade destes são, na maioria, constituídos de proteínas e carboidratos. Dentre os agentes de origem protéica estão os inibidores de proteinases, que além da sua atuação em plantas, podem ter aplicações no tratamento de patologias, como inflamações, hemorragia e até mesmo o câncer. Neste trabalho, um inibidor de tripsina presente nas sementes de Dimorphandra mollis (Leguminosae-Mimosoideae), conhecida comumente por Faveiro-Doce, foi isolado e purificado a partir de precipitação com sulfato de amônio (30-60%), cromatografias em coluna de exclusão molecular (Sephadex G-75), troca iônica (DEAE-Sepharose) e de afinidade (Sepharose- Tripsina). A pureza do inibidor de D. mollis (DMTI-II) foi verificada por eletroforese em gel de poliacrilamida, que revelou uma única banda de proteína, mesmo em condições redutoras (O,IM DTT), indicando que DMTI-II é constituído por uma única cadeia polipeptídica. A massa molecular relativa de 25 kDa foi estimada por gel filtração em coluna de Superdex-75, em sistema FPLC. Uma constate de inibição de Ki de 1,7 x IO-IOM foi obtida para DMTI-II com a enzima tripsina bovina, mostrando portanto uma alta afinidade entre enzima e inibidor. Estudos estequiométricos revelaram que DMTI-II inibiu a tripsina na razão molar de 1:1, sendo a massa molecular do complexo formado de 46 kDa, determinada por cromatografia de filtração em gel, em coluna Superdex-75 (sistema FPLC). A atividade inibitória de DMTI-II mostrou ser altamente estável para diferentes condições de pH e concentrações do agente redutor DTT. A determinação da sequência N-terminal do inibidor que apresentou alto grau de homologia com outros inibi dores da família Kunitz, permitiu confnmar as características e propriedades mostradas durante o decorrer do trabalho. DMTI-II foi também submetido a ensaios de digestibilidade in vitro por pepsina e papaína e por enzimas presentes no intestino médio de larvas de Callosobruchus macu/atus com o intuito de verificar sua provável ação contra esta espécie de inseto. Os resultados mostraram que DMTI-II foi refratário à ação dessas enzimas, sugerindo uma possível aplicação na biotecnologia vegetal Abstract: Some plants species can have in their seeds biochemical agents that act on their defense mechanism. A great number of them are of proteins or carbohydrates nature. Among the ones with protein origin are the proteinase inhibitors, that can also have a role on the treatment of pathologies, such as inflammation, hemorrhage and even on cancer. In this work, a trypsin inhibitor from Dimorphandra mol/is (Leguminosae Mimosoideae) seeds, commonly known as "Faveiro-Doce", was isolated and purified by ammnium sulfate precipitation (30-60%), gel filtration chromatography (Sephadex G-75), ionexchange chromatography (DEAE-Sepharose) and affinity chromatography (SepharoseTrypsin). D. mollis inhibitor's (DMTI-II) was assayed by polyacrylamide gel electrophoresis, yielding a single protein band, indicating that DMTI-II is constituted by one polypeptide chain. A molecular weight of25 kDa was estimated by gel filtration on Superdex G-75 column (FPLC system). An inhibition constant value of 1.7 x IO-IOM was obtained for DMTI-II with bovine trypsin, showing a high affmity between enzyme and inhibitor. Stoichiometric studies showed that DMTI-II inhibited trypsin in a I: I molar ratio. The molecular weight of the complex was determined as 46 kDa, by gel filtration chromatography in the Superdex G75 column. DMTI-II inhibitory activity was stable in the different pH conditions and reducing agent (DTT) concentration. Determination ofthe inhibitor N-terminal sequence showed a high degree of homology in relation to other inhibitors from the Kunitz fami1y, reinforcing the characteristics and properties found during this work. DMTI-II inhibitor was submitted to digestion assays in vitro by pepsin and papain and by enzymes present in the larvae midgut from Callosobruchus maculatus, to verify its probable _on against this insect specie. The results showed that DMTI-II was refractory to the action of those enzymes, suggesting a possible application on plant biotechnology Mestrado Bioquímica Mestre em Biologia Funcional e Molecular

Orientador: Alba Regina Monteiro Souza Brito Tese (doutorado) - Universidade Estadual de Campinas, Instituto de Biologia Resumo: O gênero Vernonia (Asteraceae) compreende cerca de 1000 espécies, figurando como o gênero mais representativo da sua família. Do ponto de vista sistemático, Vernonia é um dos gêneros mais complexos da família Asteraceae, principalmente pela extrema diversidade de formas biológicas que exibe, desde pequenas ervas até grandes árvores. O gênero possui um grande potencial farmacológico e é sempre mencionado em trabalhos etnofarmacológicos. Só no banco de dados Pubmed o termo ¿Vernonia¿ foi citado 126 vezes até Dezembro de 2006. No presente trabalho, a atividade antiulcerogênica de duas espécies do gênero Vernonia (Vernonia polyanthes Less. e Vernonia ferruginea Less.) foi investigada. Ambas as espécies estão presentes no cerrado, embora possuam ampla distribuição pelo território brasileiro, e são empregadas popularmente para o tratamento de bronquite, tosse, asma, cálculo renal, etc. Inicialmente foram realizados ensaios fitoquímicos e farmacológicos nos extratos brutos, clorofórmico e metanólico, de cada espécie. Foi identificada a presença de flavonóides e terpenóides em ambas as espécies, além da presença de atividade antiulcerogênica em todos os extratos brutos avaliados. Investigamos a seguir alguns dos possíveis mecanismos de ação dos extratos mais eficazes de cada espécie, do extrato metanólico da V. ferruginea (EMVF), rico em flavonóides e do extrato clorofórmico da V. polyanthes (ECVP), rico em terpenóides. Concluímos que eles estão relacionados a um aumento na produção de muco aderido à mucosa gástrica e dependem em parte da presença de óxido nítrico (NO) e radicais sulfidríla (SHs). O extrato ECVP foi então fracionado em fração clorofórmica (FCVP) e metanólica (FMVP) e o extrato EMVF foi particionado em fração acetato (FAVF) para avaliação farmacológica em modelos de úlcera crônica e aguda induzida. A fração FMVP, a mais eficaz dentre as duas espécies estudadas, foi então submetida a ensaios fitoquímicos objetivando a identificação da sua substância majoritária. O lupeol, triterpeno pentacíclico da família dos lupanos, foi identificado como o princípio ativo da espécie V. polyanthes e novos ensaios farmacológicos foram então realizados para elucidação dos seus mecanismos de ação. Foi identificado um aumento na produção de muco em animais pré-tratados com o lupeol, relacionado à presença de NO. Observou-se também uma boa atividade antiinflamatória na mucosa gástrica, através da diminuição da infiltração de neutrófilos, relacionada a uma diminuição na produção de PGE2. O lupeol, na dose investigada, não promoveu aumento significativo no pH do suco gástrico, o que descarta uma possível atividade anti-secretória. Por fim, nos estudos crônicos de indução de úlcera, o lupeol não apresentou toxicidade in vivo e demonstrou possuir uma grande atividade cicatrizante das lesões gástricas, provavelmente não relacionada à presença da Heat Shock Protein 70 (HSP70) e proliferação celular (PCNA) na borda da lesão. No presente trabalho, através do fracionamento biomonitorado das espécies V. polyanthes e V. ferruginea, identificamos a substância antiulcerogênica lupeol. A sua alta atividade gastroprotetora aliada à sua baixa toxicidade in vivo fazem do lupeol um fármaco potencial para o tratamento de úlceras gástricas Abstract: The genus Vernonia (Asteraceae), which includes about 1.000 species, figures as the most representative from its family. From a systematic point of view, Vernonia is one of the most complex genus of its family, mainly because of its diverse biological forms, from small herbs through big trees. This genus possesses a great pharmacological potential and is always mentioned by ethnopharmacological works. Evidence for the interest in this genus is the number of citations in the database Pubmed. This exceeds 126 for the keyword ¿Vernonia¿, as of December, 2006. In the present work, the antiulcerogenic effect of two species from genus Vernonia (Vernonia polyanthes Less. and Vernonia ferruginea Less.) was evaluated. Both species are found predominately in Brazilian savannah, although they are widespread over Brazilian territory. They are used in traditional medicine for the treatment of bronchitis, cough, asthma and renal calculus. Initially, phytochemical and pharmacological assays were done with the crude methanolic and chloroformic extracts from each species. Flavonoids and terpenoids were identified in both species, and all crude extracts presented an antiulcerogenic effect. Soon afterward we evaluated some of the action mechanisms from the most effective crude extracts, the methanolic extract from V. ferruginea (EMVF), a flavonoid rich extract, and the chloroformic extract from V. polyanthes (ECVP), a terpenoid rich extract. They both presented an increase in gastric mucus content, and depended in part of the nitric oxide (NO) and sulfhydryls (SHs) presence. ECVP was then fractionated in a chloroformic (FCVP) and methanolic fraction (FMVP), while EMVF was partitioned in an acetate fraction (FAVF) for pharmacological approaches in chronic and acute models. FMVP, the most effective fraction, had its majority compound identified. Lupeol, a lupane pentacyclic triterpene, was identified as the active compound from V. polyanthes, and new assays were done to evaluate its action mechanisms. Lupeol increased gastric mucus content in rats, probably mediated by NO presence. It also presented anti-inflammatory properties in gastric mucosa, reducing PGE2 production and neutrophil infiltration. On its effective dose, it didn¿t decreased the gastric acid output. On the other hand, Lupeol showed on a chronic model of ulcer induction a great healing effect with no toxicity in vivo, probably not related to the presence of Heat Shock Protein 70 (HSP70) and cellular proliferation (PCNA) on the ulcer border. In the present work, in a biomonitored fractionation process of the species V. polyanthes and V. ferruginea, we identified the antiulcerogenic compound lupeol. Its high gastroprotective effect allied to its low toxicity in vivo, turns it a potential drug for treating gastric ulcers Doutorado Fisiologia Doutor em Biologia Funcional e Molecular

Orientador: Elenice Aparecida de Moraes Ferrari Dissertação (mestrado) - Universidade Estadual de Campinas, Instituto de Biologia Resumo: Este estudo investigou a distribuição do cronotipo (matutino, intermediário e vespertino), a sonolência diurna, o desempenho em testes de memória e de compreensão de leitura em estudantes do turno da manhã e da tarde (12 a 17 anos). Na Fase 1, foram utilizados o Questionário de Cronotipo (HO) e o formulário para identificação de queixas de sono (n = 435). Na Fase 2 (n = 81) utilizou-se a Escala de Sonolência de Karolinska (KSS) aplicada imediatamente antes da sessão de testes, que ocorreram em dois horários (7h00 e 16h45), as Escalas de Leitura (EL) e de Desempenho Escolar em Língua Portuguesa (ED), o Teste de Extensão de Dígitos direto e inverso (SPANdir; SPANinv), o Teste dos Blocos de Corsi direto e inverso (CORSIdir; CORSIinv), o Teste de Memória Episódica imediato e tardio (MEI; MET) e o Teste de compreensão da leitura (CLOZE). Os resultados mostraram uma distribuição normal para os diferentes cronotipos, com aumento na vespertinidade em adolescentes mais velhos. As queixas mais freqüentes (Teste qui-quadrado) foram insônia e muita necessidade de sono predominantes em vespertinos, independentemente do turno de estudo. Os adolescentes de cronotipo matutinos estavam menos sonolentos em relação aos vespertinos, em ambos os horários testados, sendo que os testados no horário da tarde estavam menos sonolentos que os da manhã (ANOVA; p < 0,05). A pontuação média na EL e ED classificou os adolescentes em alto nível acadêmico (ANA), média = ou > que 5 (n = 50) e baixo nível acadêmico (BNA), média < que 5 (n = 31). A análise do conjunto de dados de todos os 81 sujeitos (ANA e BNA) mostrou melhor desempenho no teste CORSIinv realizado no horário da tarde (R = -0,5) em adolescentes vespertinos e no teste MET no horário da manhã (R = -0,4) em adolescentes menos sonolentos (Teste de Spearman; p < 0,05). Quando se analisou apenas os sujeitos ANA observou-se melhor desempenho dos adolescentes matutinos nos testes SPANinv realizados no horário da manhã (R = 0,3) e no teste MEI no horário da tarde (R = 0,4). Também foi verificado melhor desempenho em adolescentes menos sonolentos nos testes CORSIinv (R = -0,6) e CLOZE (R = -0,5) realizados no horário da manhã (Teste de Spearman; p < 0,05). Em conjunto, essas análises demonstraram que o cronotipo, a sonolência diurna, o nível de leitura e o desempenho escolar exercem influência no desempenho em testes de memória. Mais ainda, mostram a importância de se avaliar o nível acadêmico do indivíduo para precisar a relação que cronotipo e a sonolência exercem sobre a memória Abstract: This study investigated the distribution of different chronotypes (morning, indifferent and evening), the diurnal sleepiness, the performance in tests of memory and reading comprehension in students (12-17 years old) of both morning and afternoon school periods. In the Phase 1, we used the Chronotype Questionnaire (HO) and Sleep Complaints form (n = 435). In Phase 2 (n = 81) there has been used the Karolinska Sleepiness Scale (KSS) immediately before the morning (7am) and afternoon (4:45pm) testing sessions, the Reading (SR) and School Performance in Portuguese Language (SP) Scales, the Digit Span (direct, SPANdir and inverse, SPANinv), Corsi Block (direct, CORSIdir and inverse, CORSIinv), Episodic Memory (immediate, IEM and late, LEM) and the reading comprehension test (Cloze). The results showed a normal distribution of the different chronotypes, with increased eveningness in older adolescents. The most frequent sleep complaints ( x -square test) were the need for longer sleep duration and the insomnia. Those complaints were more frequent in the evening type adolescents, regardless of the school period. The morning type adolescents were less sleepier than the evening type adolescents in both testing times, but during afternoon sessions they were less sleepier than during the morning sessions (ANOVA; p < 0,05). The adolescents were classified in high (HAL, score > 5, n = 50), or low academic level (LAL, score < 5, n = 31), accordingly to their SR and SP average score. The analysis considering all the 81 adolescents (ANA e BNA) indicated that evening type had better performance than the morning type adolescents in the CORSIinv test conducted at the afternoon time (R = -0.5), whereas less sleepy adolescents showed better performance than more sleepy adolescents (R = -0.4) in the MET test during the morning session (Spearman test; p < 0.05). Data analysis of the HAL students only showed that morning type adolescents performed better than evening type adolescents in the SPANinv test conducted in the morning (R = 0.3) and MEI test conducted in the afternoon (R= 0.4). Also the performance in CORSIinv (R = -0.6) and CLOZE tests (R = -0.5) was better in less sleepy than in more sleepy adolescents during the morning sessions (Spearman test; p < 0.05). Together, these results demonstrate that the performance of adolescents in memory tests can be influencied by their chronotype, sleepiness and level of academic performance. Furthermore, this study demonstrates that assessment of the academic level helps to clarify the role that chronotype and sleepiness have on memory Mestrado Fisiologia Mestra em Biologia Funcional e Molecular

Orientador: Fabio Marcio Squina, Roberto Ruller Dissertação (mestrado) - Universidade Estadual de Campinas, Instituto de Biologia Resumo: O etanol de segunda geração, produzido a partir dos polissacarídeos da biomassa lignocelulósica, apresenta-se como uma alternativa promissora para tornar a matriz energética brasileira sólida e, em grande parte, renovável. A biomassa é composta basicamente por celulose, hemicelulose e lignina. Celulose e hemicelulose devem ser hidrolisadas a açúcares monoméricos fermentescíveis para produzir etanol. Entretanto, a tarefa de propor um processo enzimático de hidrólise eficiente e de baixo custo com a finalidade de sacarificar a biomassa é desafiadora, pois os polissacarídeos que a compõem são complexos e recalcitrantes. Embora as hemiceluloses representem cerca de 30% dos açúcares do bagaço da cana-de-açúcar, uma das biomassas mais promissoras para a produção de etanol de segunda geração no Brasil, ainda poucos estudos são direcionados ao estudo da sacarificação dessa fração de polissacarídeos. Hemicelulases são glicosídeo hidrolases que catalisam a hidrólise dos polissacarídeos hemicelulósicos, e que em atuação sinérgica com celulases promove a hidrólise do bagaço de cana-de-açúcar de maneira mais eficiente que as classes de enzimas isoladamente. A primeira parte dessa dissertação apresenta a caracterização bioquímica e biofísica de uma arabinofuranosidase GH51 do micro-organismo Bacillus subtilis 168. ?-L-arabinofuranosidases são hemicelulases que hidrolisam terminais não redutores de polissacarídeos contendo arabinose. A AbfA mostrou-se robusta, atuando numa ampla faixa de temperatura, e capaz de liberar monômeros de arabinose hidrolisando 1,5-?-L-arabinoheptaose a partir da extremidade não-redutora. A análise dos dados de SAXS combinada com simulações de dinâmica molecular mostrou que a AbfA em solução é hexamérica, com cada subunidade contendo uma molécula com domínio catalítico em enovelado na forma de barril (?/?)8 seguido por um domínio acessório ?-sandwich. Esses dados evidenciam que a estrutura quaternária pode ser importante para o desempenho de atividade das arabinofuranosidases da família 51. A segunda parte da dissertação aborda uma avaliação da influência dos domínios de ligação a carboidratos na atividade de xilanases mesofílicas e termofílicas. Xilanases são hemicelulases que catalisam a hidrólise de ligações endo-1,4-?-D-xilosídicas na molécula de xilano. Fusões gênicas uniram end-to-end um CBM6 de Clostridium thermocellum aos domínios catatalíticos xilanásicos das enzimas GH10 termofílica (de Thermotoga petrophila) e GH11 mesofílica (de Bacillus subtilis 168). O CBM6 alterou o padrão de hidrólise das quimeras termofílicas e aumentou a constante de eficiência da quimera mesofílica, quando comparadas as enzimas nativas respectivas. Além disso, na hidrólise da biomassa da cana-de-açúcar a xilanase quimérica mesofílica suplementou o coquetel comercial Accellerase 1500, liberando mais açúcares redutores. Dessa forma a fusão ao CBM6 mostrou-se uma alternativa para construir enzimas com melhor desempenho cinético Abstract: The second generation ethanol, produced from lignocellulosic biomass polysaccharides, presents itself as a promising alternative to make the Brazilian energy matrix solid and largely renewable. Biomass is composed mainly of cellulose, hemicellulose and lignin. Cellulose and hemicellulose must be hydrolyzed in fermentable monomeric sugars to produce ethanol. However, the task of proposing a process for enzymatic hydrolysis efficient and low cost in order to saccharify the biomass is challenging because its polysaccharides are complex and recalcitrant, so it requires the presence of several different catalytic activities for hydrolysis. Although hemicelluloses represent about 30% of sugars from sugarcane bagasse, one of the most promising biomass for the production of second generation ethanol in Brazil, few studies are directed to the saccharification study of this polysaccharidic fraction. Hemicellulases are glycoside hydrolases that catalyze the hydrolysis of hemicellulosic polysaccharides and works synergistically with cellulases promoting the hydrolysis of sugarcane bagasse more efficiently than each one class of enzymes alone. The first part of this dissertation presents the biochemistry and biophysics characterization of a GH51 arabinofuranosidase from microorganism Bacillus subtilis 168. ?-Larabinofuranosidases are hemicellulases that hydrolyze linkages in terminal nonreducing ends of polysaccharides containing arabinose. The AbfA showed itself robust, working in a wide temperature range, and able to release arabinose monomers hydrolyzing 1,5-?-L-arabinoheptaose from the non-reducing end. The analysis of SAXS data in combination with molecular dynamics simulations showed that AbfA solution is hexameric, with each subunit containing a molecule with catalytic domain coiled in the form of barrel (?/?)8 followed by a ?-sandwich domain accessory. These results evidence and corroborate data that the quaternary structure may be important for the activity of GH51 arabinofuranosidases family. The second part of the thesis adresses an evaluation of the influence of carbohydratebinding modules, non-catalytic domains of polysaccharides recognition, in the activity of mesophilic and thermophilic xylanases. Xylanases are hemicellulases that catalyze the hydrolysis of endo-1 ,4-?-D-xylosidic linkages in xylan molecule. Gene fusions joined end-to-end a CBM6 from Clostridium thermocellum to catalytic xylanasic domains of enzymes thermophilic GH10 (from Thermotoga petrophila) and mesophilic GH11 (from Bacillus subtilis 168). The CBM6 changed the hydrolysis pattern of thermophilic chimeras increased the efficiency constant of mesophilic chimera, when compared to the respective native enzymes. Furthermore, in the sugarcane biomass hydrolysis mesophilic chimeric xylanase supplemented the commercial cocktail Accellerase 1500, releasing more reducing sugars. In conclusion, the CBM6 fusion proved itself an alternative to construct enzymes with better kinetic performance Mestrado Bioquímica Mestra em Biologia Funcional e Molecular

Orientadores: Bayardo Baptista Torres, Eduardo Galembeck Dissertação (mestrado) - Universidade Estadual de Campinas, Instituto de Biologia Resumo: Através de um programa de formação pedagógica para pós-graduandos, o grupo de Ensino de Bioquímica da Universidade Estadual de Campinas - Unicamp e da Universidade de São Paulo - USP vem promovendo o desenvolvimento de novas disciplinas especiais de bioquímica. Uma delas foi a Bioquímica da Nutrição inteiramente planejada e aplicada por pós-graduandos para alunos de graduação. A impossibilidade de atender o grande número de inscritos para a Bioquímica da Nutrição e seus excelentes resultados de avaliação foram fatores que estimularam a iniciativa de adaptar a referida disciplina para o ensino a distância. Os objetivos da disciplina, o seu conteúdo e as formas de avaliação foram completamente reestruturados de modo que pudessem ser veiculados pela Internet. A versão virtual da disciplina foi oferecida para 25 alunos da graduação durante quatro meses. Para ser totalmente veiculada pela Internet, foi criada uma "homepage" contendo as diferentes seções necessárias para a comunicação/interação dos participantes. As ferramentas computacionais usadas foram: e-mail, para comunicação entre alunos e professores; salas de discussão para abordagem de temas prédeterminados; possibilidades de "download" de textos e softwares educacionais usados como principal referência para as atividades; dicas e apoio técnico sempre disponfveis aos alunos. A versão virtual da disciplina também contou com a participação de alunos de pós-graduação do Departamento de Bioquímica da Unicamp como monitores. A avaliação da disciplina, feita por alunos e monitores, mostra que experiência da disciplina virtual foi proveitosa para ambos. Através desta experiência, foi possível conhecer as ferramentas necessárias para a construção de uma disciplina a distância, as estratégias possíveis de interação a distância para tornar o ensino interessante e gerar bons resultados e o potencial de expansão de disciplinas especiais de bioquímica para um público mais amplo e mais diversificado, possibilitando abordagem, atualização e disseminação dos novos conhecimentos de Bioquímica Abstract: As a part of a pedagogic program for graduate students, the Biochemistry Teaching Group - gathering teachers and students from the Biochemistry Departments of the State University of Campinas (Unicamp) and University of São Paulo (USP) leads the creation of new special biochemistry disciplines, designed for undergraduate students and entirely planed and taught by graduate students. One of them was Nutrítional Biochemistry. The impossibility of accepting the great number of students registered for Nutritional Biochemistry and its excellent evaluation arouse the aim for its adaptation to Distance Education (DE). The discipline's objectives, contents and evaluation forms were completely restructured to fit the Internet resources. The Internet version of this discipline was structured for 25 student and the classes were scheduled to be completed in four months. A homepage containing ali different sections necessary. to mediate communication/interaction among the participants was created. The computational tools used were: e-mail communication between students and teachers, computer conferencing in small groups willing the discussion of pre-defined subjects, texts and software download to be used as main references. The participation of graduate students from Unicamp's Biochemistry Department as teachers was maintained in the Internet version since the integration between graduate and undergraduate students was considered a productive experience for both parts. The planning and application of Nutritional Biochemistry provided the knowledge of different tools to be used in a DE discipline. The interaction strategies motivated and stimulated the student's interest. The excellent results obtained with this experience established the basis for a potential expansion of Biochemistry disciplines designed for a wider and more diversified publico This should impreve the update and dissemination of information on Biochemistry Mestrado Bioquímica Mestre em Biologia Funcional e Molecular

Orientador: Lucia Pereira da Silva Tese (doutorado) - Universidade Estadual de Campinas, Instituto de Biologia Resumo: Nosso trabalho consistiu em avaliar as alterações no funcionamento e estrutura de mitocôndrias de músculo de ratos (consumo de oxigênio, produção de H2O2 e composição lipídica) em diferentes situações de exercício físico (treinamento intermitente excêntrico ou concêntrico e/ou exercício agudo excêntrico) e após uma suplementação em ácidos graxos Ômega-3. Foram também analisadas as atividades de diferentes enzimas antioxidantes (catalase - CAT, glutationa peroxidase - GPx e superóxido dismutase dependente de manganês ¿ Mn-SOD) e o conteúdo em HSP72 muscular nestas mesmas situações. O treinamento físico excêntrico e concêntrico induziu aumento da atividade de enzimas oxidativas (citrato sintase - CS ou citocromo c oxidase - CCOX) o que também foi observado no consumo de oxigênio por mitocôndrias. Já a produção de H2O2 diminuiu ou tendeu a diminuir dependendo do tipo do treinamento e do substrato utilizado. A atividade das enzimas antioxidantes não foi alterada após os dois tipos de treinamento. Após o exercício agudo excêntrico observou-se também a diminuição na produção de H2O2 de mitocôndrias, porém sem alteração do consumo de oxigênio e com diminuição paralela da atividade da Mn-SOD. Após suplementação em Ômega-3 o funcionamento das mitocôndrias não foi alterado, apenas sua composição lipídica apresentou modificações. Quando a suplementação em Ômega-3 foi associada ao treinamento físico, apenas durante 15 dias, a concentração em proteínas das mitocôndrias apresentou-se 50% menor que nos demais grupos e os parâmetros respiratórios e de produção de H2O2 estavam diminuídos. Concluindo o mecanismo pelo qual a produção de H2O2 foi diminuída parecendo ser diferente após treinamento ou exercício agudo excêntricos. O primeiro parece estar relacionado com o desacoplamento das mitocôndrias e o segundo com a diminuição da atividade da Mn-SOD. A suplementação sozinha não produziu efeitos prejudiciais para o músculo, porém sua associação com uma situação onde a produção de EROS poderia estar elevada, o exercício físico, causou prejuízos Abstract: Dans ce travail nous avons étudié les altérations du fonctionnement des mitochondries de muscles de rats (consommation d¿oxygène, production d¿H2O2 et composition lipidique) dans différentes situations d¿exercice (entraînement et/ou exercice aigu), ainsi qu¿après une supplémentation en acides gras Omega-3. L¿activité des enzymes antioxydants (catalase - CAT, glutathion peroxydase - GPx et superoxyde dismutase mitochondriale ¿ Mn-SOD) et le contenu en HSP72 musculaires étaient aussi évalués. L¿entraînement physique excentrique ou concentrique a induit une augmentation de la capacité oxydative à travers l¿elevation de l¿activité des enzymes oxydantes (citrate synthase - CS et cytochrome c oxydase - CCOX) parallèle à une augmentation de la consommation d¿oxygène. La production d¿H2O2 est diminuée ou tend à diminuer selon l¿entraînement réalisé et le substrat utilisé. L¿activité des enzymes antioxydants n¿était pas changée après les deux entraînements. Après l¿exercice aigu excentrique nous avons aussi observé une diminution de la production d¿H2O2 parallèle à la diminution de l¿activité de la Mn-SOD, cependant sans modification de la consommation d¿oxygène. Dans une autre étude la supplémentation en acides gras Omega- 3 n¿a pas modifié le fonctionnement des mitochondries, seulement leur composition lipidique était modifiée. Après l¿association de la supplémentation en Omega-3 avec l¿entraînement physique, pendant 15 jours, la concentration en protéines était diminuée en 50% par rapport les autres groupes et les paramètres respiratoires et de production d¿H2O2 étaient aussi diminués. En conclusion, le mécanisme par lequel la production d¿H2O2 était diminuée après l¿entraînement et l¿exercice aigu semblerait être différent dans les deux cas. Le premier semble être lié à un léger découplage des mitochondries et le deuxième à la diminution de l¿activité de la Mn-SOD. Dans la deuxième étude, la supplémentation toute seule n¿a pas produit des effets délétères sur le muscle, tandis que son association avec l¿exercice (entraînement), situation ou la production de ROS peut être augmenté, était préjudicielle Doutorado Bioquímica Doutor em Biologia Funcional e Molecular

Orientador: Antonio Carlos Boschero Dissertação (mestrado) - Universidade Estadual de Campinas, Instituto de Biologia Resumo: Dentre os vários compostos inorgânicos que mimetizam as ações da insulina os derivados do vanadato são, sem dúvida, os mais estudados. No presente trabalho, analisamos os efeitos de um desses derivados, o tungstato de sódio, sobre a homeostasia da glicose e a secreção de insulina em ilhotas de Langerhans isoladas de ratos tornados resistentes à insulina pela dexametasona. Quinze dias antes dos experimentos, ratos machos adultos da linhagem Wistar foram distribuídos casualmente em quatro grupos, a saber: controle, dexametasona, tungstato e dexametasona + tungstato. Durante os quinze dias, os ratos dos grupos controle e dexametasona tiveram livre acesso à água e ração. Os ratos dos grupos tungstato e dexametasona + tungstato receberam tungstato de sódio (2mg/ml), dissolvido na água de beber. Nos últimos 5 dias que precederam os experimentos, os ratos dos grupos dexametasona e dexametasona + tungstato receberam, via intraperitoneal, doses diárias de dexametasona (1 mg/kg- Abstract: Among the severa I inorganic compounds that mimic the effect of insulin vanadium derivatives are the most widely studied. In the present work we have analyzed the effects of tungstate on glucose homeostasis and insulin secretion in healthy and in insulin resistant rats by dexamethasone. Fifteen days before the experiments the rats were randomly distributed in four groups: control, dexamethasone, tungstate and dexamethasone + tungstate. Control and dexamethasone groups had free access to water. Tungstate and dexamethasone + tungstate groups received tungstate dissolved in the drink water (2mg/ml). The dexamethasone and dexamethasone + tungstate groups received during the last 5 days daily doses of 1 mg/Kg-1 of dexamethasone, intraperitoneally. In insulin resistant rats, tungstate treatment normalized plasma glucose whereas plasma insulin and triglycerides remained significantly higher than controls. The glucose disappearance rate after an ivlTT and the glucose uptake by soleus muscle of insulin resistant rats were lower compared to control rats and was normalized by tungstate. The dose-response curve of insulin secretion (5.6 to 27.7 mM glucose) in isolated islets from dexamethasone-treated rats was shifted to the left compared to control islets. Administration of tungstate to these animais induced a dose-response curve closar to contrai islets. The EC50 for the dose-response curves were 13.7, 7.9, 15.7 and 11.8 mM glucose for contrai, ...J dexamethasone, tungstate and dexamethasone + tungstate-treated rats, respectively. In conclusion, tungstate-induced plasma glucose normalization seems to be, at least in part, dependent on the restoration of glucose uptake by muscle cells of insulin resistant rats Mestrado Fisiologia Mestre em Biologia Funcional e Molecular

Orientadores: Helena Coutinho Franco de Oliveira, Antonio Carlos Boschero Tese (doutorado) - Universidade Estadual de Campinas, Instituto de Biologia Resumo: Neste trabalho, investigamos se a hipercolesterolemia primária per se, independente de dieta rica em gordura, afeta a homeostase glicêmica e a secreção de insulina estimulada por vários secretagogos em animais knockout para o receptor de LDL (LDLR-/-). Além disso, investigamos os possíveis mecanismos envolvidos na liberação deste hormônio neste modelo animal. Podemos resumir nossos achados da seguinte maneira: camundongos LDLR-/- apresentam hiperglicemia pós-prandial, hipoinsulinemia, intolerância à glicose e sensibilidade periférica à insulina normal. Nós demonstramos que, as alterações na homeostase glicêmica ocorrem em parte, por uma diminuição da sensibilidade das ilhotas à glicose. A secreção de insulina é normal na presença de baixa concentração de glicose, entretanto na presença de 11,1 mmol/l, as ilhotas de animais LDLR-/- liberam menos insulina que as ilhotas controles. A secreção de insulina estimulada por outros secretagogos metabolizáveis (leucina e KIC) também está reduzida nas ilhotas dos animais knockout. O conteúdo total de insulina e DNA são similares entre os grupos, sugerindo que as alterações na secreção de insulina não ocorrem devido a diferenças no tamanho e/ou número de células b. Observamos uma redução na primeira e segunda fase de secreção de insulina estimulada por 11,1 mmol/l de glicose. A oxidação da glicose está reduzida, enquanto a metabolização da leucina está aumentada. Quando adicionamos agentes despolarizantes (KCl, Arginina e Tolbutamida), observamos uma redução da secreção de insulina tanto em concentrações basais quanto estimulatórias de glicose. Na presença de 11,1 mmol/l de glicose e carbacol (agonista colinérgico) ou PMA (ativador da proteína-quinase C), a secreção de insulina foi semelhante entre os grupos LDLR- /- e controles. Entretanto, quando estimulamos a secreção com forskolin ou IBMX, que aumentam os níveis de AMPc, observamos redução na liberação de insulina pelas ilhotas dos animais LDLR-/- em comparação com os controles. A expressão protéica da fosfolipase C (PLCb2) está aumentada enquanto que a expressão da proteína-quinase A (PKA) está reduzida nas ilhotas dos animais LDLR-/-. Assim, observamos que camundongos LDLR-/- apresentam alterações na homeostase glicêmica independente de dieta rica em gordura, provocada por redução na secreção de insulina devido, em parte à redução do metabolismo da glicose, bem como, redução na expressão da PKA Abstract: In this work, we investigated whether primary hyperlipidemia per se, independently of a high-fat diet, affects glycemia and insulin secretion stimulated by several secretagogues in hypercholesterolemic low-density lipoprotein receptor knockout mice (LDLR-/-). In addition, we investigated the possible mechanisms involved in the release of this hormone. We found that, besides higher total cholesterol and triglyceride plasma concentrations, glucose plasma levels were increased and insulin decreased in LDLR-/- compared to the wild type (WT) mice. LDLR-/- mice presented impaired glucose tolerance, but normal whole body insulin sensitivity. In addition, we also demonstrate that the main cause of the impaired glucose homeostasis is a reduced pancreatic islet insulin secretion ability following fuel secretagogue stimuli. LDLR-/- mice have impaired insulin secretion in response to glucose without alterations in the pancreatic total insulin and DNA contents. These findings support the idea that the decreased response to glucose cannot be explained by differences islet size or number of beta cells, but it is probably caused by a defect in the secretory process. Glucose oxidation was 30% lower and L-leucine oxidation 60% higher in LDLR-/- islets than in WT islets. At basal (2.8 mmol/l) and stimulatory (11.1 mmol/l) glucose concentrations, the insulin secretion rates induced by depolarizing agents such as KCl, L-arginine and tolbutamide were significantly reduced in LDLR-/- when compared with WT islets. Insulin secretion induced by the PKA activators, forskolin and IBMX, in the presence of 11.1 mmol/l glucose, was lower in LDLR-/- islets, and it was normalized in the presence of the PKC pathway activators, carbachol and PMA. Western blotting analysis showed that phospholipase C-b2 expression was increased and PKA-a decreased in LDLR-/- compared with WT islets. In conclusion, we demonstrate that genetic hypercholesterolemia, due to complete deficiency of LDLR, impairs the beta cell insulin secretion, leading to hyperglycemia without affecting body insulin sensitivity. The lower insulin secretion in LDLR-/- mice islets may be explained by reduced glucose metabolism and expression of PKA Doutorado Fisiologia Doutor em Biologia Funcional e Molecular

Orientador: Helena Coutinho Franco de Oliveira Dissertação (mestrado) - Universidade Estadual de Campinas, Instituto de Biologia Resumo: Hormônios sexuais modificam o perfil lipoprotéico e o risco de aterosclerose. O objetivo deste trabalho foi investigar o efeito de testosterona sobre os lipídeos plasmáticos e enzimas associadas. Camundongos transgênicos (Tg) para proteína de transferência de colesteril-éster (CETP) e controles (não- Tg) foram estudados após 30 dias de castração ou pseudo-cirurgia (sham) e após 14 dias de suplementação com testosterona por injeções subcutâneas diárias de Durateston (DT), Androgenol (AN) ou placebo (PL). As concentrações plasmáticas de colesterol, triglicérides, ácidos graxos livres, glicose e insulina e as atividades da lipase hepática e da CETP foram semelhantes tanto nos animais castrados comparados aos sham quanto nos animais DT comparados .aos PL No entanto, estes tratamentos induziram modificações significativas da distribuição do colesterol nas lipoproteínas nos animais CETP Tg e não-Tg, as quais foram distintas conforme o genótipo. Em tennos relativos, a deficiência de testosterona nos animais não- Tg provocou aumento de 73 % da VLDL e 79 % da LDL e redução de 11 % da HDL, enquanto nos animais CETP Tg castrados houve aumento de 36 % da LDL e redução de 30 % da HDL. Portanto esses resultados sugerem que a expressão da CETP nos camundongos transgênicos amenizou as modificações desfavoráveis nas apoB-LP observadas nos não-Tg. Em estudos cinéticos com LDL e HDL marcadas radioativamente, verificou-se uma tendência de redução da velocidade de remoção plasmática da LDL e redução do tempo de residência da HDL no plasma dos animais castrados, as quais explicam em parte as alterações das respectivas concentrações plasmáticas destas lipoproteínas. Além disso, a atividade endógena da CETP estava aumentada em 20 % nos animais castrados, contribuindo para redução da HDL nestes animais. A suplementação com testosterona em machos não-Tg e fêmeas CETP Tg também modificou os níveis de apoB-LP. Machos não Xl Tg tratados com DT apresentaram aumento de 42 % da VLDL e 72 % na LDL; remeas CETP Tg tratadas com DI apresentaram aumento de 35 % em VLDL. Concluindo, tanto a deficiência corno a suplementação com testosterona tornaram o perfil lipoprotéico dos camundongos mais aterogênico, independentemente da massa de iipase hepática e de CETP. A magnitude dos efeitos sobre as beta- e alfa-lipoproteínas foi te do genótipo, isto é, da expressão da CETP Abstract: Sex honnones modify the plasma lipoprotein profile and hence the risk of atherosclerosis. ln this study we have investigated the effects of testosterone on plasma lipid and lipoprotein levels and associated enzymes. Transgenic mice (Tg) 1hat express a human cholesteryl ester transfer protein (CETP) minigene with natural flanking sequences and non transgernc (nTg) control mice were studied 30 days after castration or sham operation and 14 days after testosterone supplementation by subcutaneous daily injections of Durateston (DT), Androgenol (AN') Of placebo (PL). Plasma concentrations of cholesterol, triglycerides, free fatty acids, glucose and insulin, as well as the hepatic lipase and CETP activities on exogenous substrates were similar in both conditions, testosterone deficiency (castrated vs. sham) or excess (DT vs. PL) for both groups of mice, CETP Tg and non Tg. However, these treatments induced changes in the cholesterol distribution among plasma lipoproteins that were dependent on the CETP expression. Testosterone deficiency in nTg mice provoked increase of 73 % in VLDL- and 79 % in LDL- and reduction of 11 % in HDL-cholesterol, while in CETP Tg mice there was an elevation of 36 % in LDL- and decrease of 30 % in HDL-cholesterol. Kinetic studies of LDL and HDL labeled with 1311 and 1251, respectively, showed that the LDL fractional plasma removal rate and HDL plasma residence time tend to be lower in CETP Tg castrated as compared to sham mice. These results can explain, at least in pari, the changes in LDL and HDL concentrations in the plasma of the CETP Tg castrated mice. Furthermore, endogenous substrate dependent CETP activity was elevated by 20 % in CETP Tg castrated mice, which contributed to the reduction in HDL-cholesterollevels in these mice. Testosterone ._supplementation induced an increase of 42 % in VLDL- and af 72 % in LDL-cholesterol in X11l, .J the plasma ofnTg mice and a mild 35 % increase in VLDL-cholesterol in plasma offemale CETP Tg mice, while no change was observed in the cholesterol distribution among plasma lipoproteins of male CETP Tg mice. In conclusion, both testosterone deficiency and excess induced a more atherogenic lipoprotein profile in mice, which was independent of the mass ofhepatic lipase and CETP. However, the magnitude ofthe effects were dependent on the CETP expression, which attenuated the elevation on eta-lipoprotein but strengthened the reduction on alpha-lipoprotein cholesterollevels Mestrado Fisiologia Mestre em Biologia Funcional e Molecular

Orientador: Jose Roberto Bosqueiro Tese (doutorado) - Universidade Estadual de Campinas, Instituto de Biologia Resumo: A resistência à insulina (RI) é uma condição que exige maiores níveis de insulina circulante e que normalmente são providenciados pelo aumento da função e população de células ß. A RI pode ser observada a partir de diversos modelos experimentais em roedores tais como os modelos transgênicos, de gravidez, submetidos às dietas hiperlipídicas e hipercalóricas e a partir de infusão venosa de glicose. Estes modelos têm sido úteis para a compreensão dos mecanismos compensatórios observados durante a RI. Os glicocorticóides são amplamente utilizados na indução farmacológica da RI em modelos animais e em seres humanos, com fins científicos. A ativação da sinalização da insulina e das proteínas reguladoras do ciclo celular é crucial para a função e crescimento das células ß adultas. No presente trabalho, apresentamos modelos para investigação da função e crescimento de células ß pancreáticas in vivo a partir da administração diária de três concentrações distintas de dexametasona (DEX) (0,1, 0,5 e 1,0 mg/kg, peso corpóreo, intraperitoneal - DEX 0.1, DEX 0.5 e DEX 1.0, respectivamente) por 5 dias consecutivos. A sensibilidade periférica à glicose e à insulina, parâmetros de secreção de insulina e histomorfométricos foram investigados. A análise dos níveis de proteínas relacionados à função e crescimento de células ß foi realizada por Western blotting. O tratamento com DEX induziu RI de maneira dose- dependente. Aumento da secreção de insulina em resposta à glicose foi observado tanto in vivo quanto ex vivo nos três grupos tratados com DEX. Ratos DEX 1.0, que apresentam hiperglicemia moderada e marcante hiperinsulinemia, exibiram aumento de 5,1 vezes na proliferação além de hipertrofia de células ß, com aumento significativo na massa de células ß comparado aos ratos CTL. Os ratos DEX 0.5, hiperinsulinêmicos, porém normoglicêmicos, também apresentaram aumento significante de 3,6 vezes na proliferação e modesta hipertrofia de células ß. Entretanto, os ratos DEX 0.1, que desenvolveram o menor grau de RI, compensaram à demanda de insulina apenas com aumento da função de células ß. Nenhuma alteração da freqüência de morte celular foi observada nas células ß dos três grupos DEX comparados ao grupo CTL. Foi observada ativação da via IRS-2/PI3- K/Akt/p70S6K, bem como da proteína retinoblastoma nas ilhotas do grupo DEX 1.0 e, em menor grau, no grupo DEX 0.5 quando comparados com as ilhotas do grupo CTL. Assim, aumentando a concentração de dexametasona induzem-se três graus de requerimento de insulina in vivo, servindo como modelo para investigação de alterações compensatórias em células ß. O aumento da demanda de insulina é compensado por aumento da função das células ß (em todos os GRUPOS DEX) e por hiperplasia e hipertrofia de células ß nos GRUPOS DEX 1.0 e DEX 0.5. Baseado nos presentes resultados concluímos que o aumento dos níveis circulantes de insulina parece ser o maior estímulo para proliferação e hipertrofia das células de células ß observado na RI induzida pela dexametasona. Abstract: Insulin resistance (IR) is a condition that demand increased levels of circulating insulin that are normally provided by increase of ß-cell function and mass. The IR can be observed in several experimental rodent models such as transgenic, pregnancy, high-fat or high-caloric diet and from glucose infusion model. These models have aided in elucidating the compensatory mechanisms observed during the IR. The glucocorticoids are widely used to induce the pharmacological IR in animal models and in humans, with scientific purpose. Activation of insulin signaling and cell cycle proteins are crucial to the function and growth of adult ß-cells. At the present study, we showed models to investigation of pancreatic ß-cell function and growth in vivo from the daily administration of three different dexamethasone (DEX) concentration (0.1, 0.5 e 1.0 mg/kg, body weight, intraperitoneal - DEX 0.1, DEX 0.5 and DEX 1.0, respectively) for 5 consecutive days. The peripheral sensibility to glucose and insulin, insulin secretion and histomorphometrical parameters were investigated. The analyses of proteins related to ß -cell function and growth were done by Western blotting. DEX treatment induced IR in a dose-dependent manner. Incease of glucose-stimulated insulin secretion was observed in vivo as well as ex vivo in the three DEX groups. DEX 1.0 rats, that present moderate hyperglicemya and marked hyperinsulinemia, ehibited a 5.1-fold increase in ß-cell proliferation besides hypertrophy, with significant increase of ß -cell mass compared to CTL rats. DEX 0.5 rats, that are hiperinsulinemic and normoglicemic, also exhibited a significant 3.6-fold increase in ß-cell proliferation as well as ß -cell hypertophy. However, DEX 0.1 rats, which exhibited the lowest degree of insulin resistance, compensate for insulin demand by improving only ß -cell function. No alteration in cell death frequency was noted in ß -cells from the three DEX groups compared to CTL group. Activation of IRS-2/PI3-K/Akt/p70S6K pathway as well as the retinoblastoma protein in islets from DEX 1.0 and, in lesser extend, in DEX 0.5 group was observed compared to islets from CTL group. Therefore, increasing doses of dexamethasone induce three different degrees of insulin requirement in living rats, serving as a model to investigate compensatory beta-cell alterations. The increased insulin demand is compensated by increase of ß-cell function (in all DEX groups) and ß -cell hyperplasia and hypertrophy in DEX 0.5 and DEX 1.0 groups. Based on the present results we concluded that the augmented levels of circulating insulin seem to be the major stimulus for ß-cell proliferation and hypertrophy observed in dexamethasone-induced insulin resistance. Doutorado Fisiologia Doutor em Biologia Funcional e Molecular

Orientadores: Carmen Verissima Ferreira, Jose Mauro Granjeiro, Maikel Peppelenbosch Tese (doutorado) - Universidade Estadual de Campinas, Instituto de Biologia Resumo: Este trabalho teve como principal objetivo investigar os mecanismos de transdução de sinal disparados durante a diferenciação de células ósseas. Desta forma, vários aspectos moleculares desse processo foram analisados. A modulação da Src kinase pela proteína tirosina fosfatase de baixo peso molecular (LMWPTP) é essencial para a diferenciação dos pré-osteoblastos induzida pelo ácido ascórbico/glicerofosfato. Outro enfoque dado nesse trabalho foi a avaliação, sob o aspecto molecular e morfológico, da diferenciação de pré-osteoblastos em ¿osteocyte-like cells¿, processo esse induzido quando o Matrigel foi utilizado como substrato. De forma inédita demonstramos que nessa condição as células produziram a proteína sonic hedgehog (Shh), a qual também foi essencial para o processo de diferenciação. A análise do perfil quinômico dessas células apontou uma prevalência das quinases envolvidas com a comunicação celular. Este fato é coerente com a super-expressão de conexina 43 observada. Além disso, observamos que RECK e TIMP-1 modulam a atividade do rearranjo da matriz extracelular durante a diferenciação de osteoblastos, bem como o requerimento das proteínas PP2A e p38 MAPK durante a adesão de osteoblastos. Adicionalmente observamos uma modulação refinada das PTPs (LMWPTP, SHP2 e PTPa) bem como do status redox celular. Os resultados em conjunto demonstram que o estudo de transdução de sinal pode fornecer informações importantes para o entendimento do funcionamento celular bem como definir alvos moleculares que podem servir como ferramentas para diferentes aplicações Abstract: The main goal of this work was to investigate the signal transduction pathways triggered during the bone cells differentiation. In this way, several molecular aspects of this process were analyzed. Src kinase modulation by the low molecular weight protein tyrosine phosphatase (LMWPTP) was essential for the occurrence of the differentiation induced by ascorbic acid and glycerophosphate. We also evaluated, under molecular and morphological patterns, the differentiation of pre-osteoblasts into osteocyte-like cells induced by 3D scaffold (matrigel as substrate). Interestingly, under this condition, the cells produced sonic hedgehog (Shh), which also was essential for stimulating the differentiation signaling pathway. Kinomic profiling of these cells revealed a prevalence of kinases involved in cellular communication, which is in agreement with the overexpression of connexin 43 observed. Besides we observed that RECK and TIMP-1 modulated the extracellular matrix rearrangement and that PP2A and p38 MAPK are required for osteoblasts adhesion. In addition, we observed that during pre-osteoblasts differentiation both PTPs and cellular redox are tightly regulated. Our findings demonstrated that the signal transduction evaluation can provide important information for understanding the cell biology as well as defining molecular targets that can be useful for different applications Doutorado Bioquímica Doutor em Biologia Funcional e Molecular

Orientador: Antonio Herbert Lancha Junior Tese (doutorado) - Universidade Estadual de Campinas, Instituto de Biologia Resumo: Durante o exercício sub-máximo, a utilização de estoques de glicogênio muscular é de suma importância para possibilitar a continuidade do mesmo. A suplementação de Aminoácidos de Cadeia Ramificada (AACR ou BCAA, do inglês Branched Chain Amino Acids) tem sido experimentada como forma de gerar energia para o músculo nessas condições. Através da utilização dos seus esqueletos de carbono, podem ser gerados intermediários do ciclo dos ácidos tricarboxílicos (CAT ou TCA, do inglês Tricarboxilic Acids Cycle); no entanto, há controvérsias quanto à eficiência dos AACR em aumentar a atividade do ciclo, uma vez que autores sugerem a diminuição da eficiência do mesmo após tal estratégia de suplementação. Por outro lado, há toda uma discussão na literatura acerca da importância do aumento dos intermediários do TCA nos primeiros momentos do exercício para apoiar o metabolismo oxidativo, assim como o impacto que as reações anapleróticas, que promovem esse fenômeno, apresentam, considerando-se o fluxo de energia total do TCA. O objetivo desse trabalho foi avaliar se a suplementação dos aminoácidos em questão seria capaz de alterar o desempenho de ratos treinados em exercício sub-máximo, e também a formação de alguns intermediários do TCA ou mesmo a atividade de enzimas importantes para esse fenômeno. Para isso foram utilizados ratos Wistar machos adultos, que foram treinados por 8 semanas em sistema de natação, e receberam na última semana, a suplementação de isoleucina, leucina ou valina, exclusivamente, ou então os três aminoácidos em conjunto, ou placebo, por 7 dias. No sexto dia de suplementação, eles fizeram a última sessão de treinamento de 1 hora de natação, foram mantidos em jejum por 24 horas e, no dia seguinte, foram submetidos a um teste sub-máximo de natação, até a exaustão. O grupo AACR teve aumento na síntese de malato e o grupo isoleucina apresentou maior atividade das transaminases de alanina e aspartato (AAT e AST), quando comparados ao placebo. Não houve diferença no desempenho dos animais em relação à resistência à fadiga, apesar do grupo leucina apresentar menores concentrações de glicogênio muscular que o grupo placebo. Concluiu-se que os AACR não foram capazes de alterar atividade do ciclo de Krebs, nem o desempenho nessas condições experimentais Abstract: During submaximal exercise, muscle glycogen utilization is important. Branched-chain AminoAcids supplementation has been utilized during the past years to provide energy for muscles in this condition, through their carbon skeletons, which might generate tricarboxilic acids cycle's intermediates (TCAI). However, this hypothesis remains controversial. On the other hand, there is a recent discussion on the literature about the real importance of the rapid muscle TCAI raise and its role for de TCA cycle. This study aimed to evaluate if BCAA supplementation in trained rats submitted to sub-maximal exercise were capable of changing TCAI activity or transaminases (AAT and AST) concentration, or even performance in muscle depletion. Wistar Male Adult rats were trained for 8 weeks in a proper swimming system. In the last week they received BCAA supplementation. Before the final experiment, they trained for 1 hour, and then wento through a 24 h fasting. The final test consisted on swimming until exhaustion, then they were euthanized and tissues were kept in liquid Nitrogen until further analysis. BCAA group had higher muscle concentrations of malate. Isoleucine group had higher muscle transaminases¿ concentration, although rats supplemented with leucine alone had lower muscle glycogen levels than placebo group. We concluded that none of the BCAA supplementation was able to affect performance or TCA activity in our experimental conditions Doutorado Bioquímica Doutor em Biologia Funcional e Molecular

Orientador: Marta Helena Krieger Tese (doutorado) - Universidade Estadual de Campinas, Instituto de Biologia Resumo: O Óxido Nítrico (NO) é um radical livre gasoso sintetizado nos vasos sanguíneos principalmente pela enzima óxido nítrico sintase endotelial (eNOS). No sistema cardiovascular ele está diretamente envolvido no controle do fluxo sanguíneo regional, especialmente na musculatura esquelética. O polimorfismo G894T do gene da eNOS vem sendo amplamente investigado e o alelo 894T, que resulta na troca do aminoácido glutamato por aspartato na posição 298 da enzima, parece estar associado ao desenvolvimento de doenças cardiovasculares. No entanto, não se conhece o efeito dessa variante genética na vasodilatação muscular. Neste estudo testou-se a hipótese de que a resposta reflexa de vasodilatação muscular durante o exercício isométrico de handgrip estaria atenuada em indivíduos portadores do alelo 894T. Em adição, que a resposta atenuada estaria ocorrendo em conseqüência de uma biodisponibilidade reduzida do NO e/ou aumento da atividade nervosa simpática vasoconstritora para a musculatura esquelética. Para testar tais hipóteses, 287 voluntários foram previamente genotipados e, deste total, 33 indivíduos saudáveis foram selecionados para representar 3 genótipos: GG (n=15, Idade=43±3 anos, IMC=22,9±0,3 kg/m2), GT (n=9, Idade=39±3 anos, IMC=24,6±1,2 kg/m2) e TT (n=9, Idade=40±4 anos, IMC=23,5±0,9 kg/m2). A freqüência cardíaca (FC; ECG), pressão arterial média (PAM; oscilométrico) e fluxo sangüíneo no antebraço (FSA; pletismografia de oclusão venosa) foram avaliados por 3 minutos no basal e 3 minutos durante o exercício isométrico de handgrip, realizado a 30% da máxima contração voluntária. Não houve diferença nos valores basais de FC, PAM, FSA e condutância vascular no antebraço (CVA) entre GG (69±2 bpm; 91±3 mmHg; 1,81±0,09 ml.min-1.100 ml-1; 2,03±0,12 unidades, respectivamente), GT (69±4 bpm; 94±2 mmHg; 1,80±0,23 ml.min-1.100 ml-1; 1,90±0,24 unidades) e TT (63±3 bpm; 95±3 mmHg; 1,79±0,17 ml.min-1.100 ml-1; 1,89±0,17 unidades). Em resposta ao exercício, a CVA foi significativamente menor no genótipo TT ('delta'=0,07±0,14 unidades, P=.002) quando comparado aos genótipos GG ('delta'=0,57±0,09 unidades) e GT ('delta'=0,64±0,20 unidades). Para investigar os mecanismos responsáveis pela vasodilatação reduzida no genótipo TT, o FSA foi estudado durante a infusão intra-arterial de L-NMMA (4 mg.min-1) e L-NMMA + fentolamina (4 mg.min-1 e 100µg.min-1), num subgrupo de 8 indivíduos com genótipo GG e 7 indivíduos com genótipo TT. Em adição, avaliou-se a xvi atividade nervosa simpática muscular (ANSM; microneurografia). Em resposta ao exercício, L-NMMA não alterou a CVA no genótipo TT ('delta'-0,05±0,20 vs. -0,09±0,18 unidades). Ao contrário, L-NMMA reduziu significativamente a CVA no genótipo GG ('delta'=0,79±0,14 vs. 0,14±0,09 unidades). Desta forma, a diferença entre os genótipos não foi mais observada (P=.62). L-NMMA + fentolamina aumentou similarmente a CVA em resposta ao exercício nos genótipos GG e TT ('delta'=1,16±0,26 vs. 0,56±0,24 unidades, P=.43). A PAM e a ANSM aumentaram significativamente e de forma similar em ambos os genótipos. Estes resultados permitem concluir que o polimorfismo G894T do gene da eNOS está associado à vasodilatação muscular reflexa diminuída em resposta ao exercício. Em adição, esta atenuação na vasodilatação nos indivíduos homozigotos para o alelo 894T parece ser primariamente mediada por uma biodisponibilidade reduzida do óxido nítrico, mas não por um aumento da atividade nervosa simpática muscular Abstract: Nitric oxide (NO) is a free radical synthesized in vessels mainly by endothelial nitric oxide synthase (eNOS) enzyme. In the cardiovascular system NO is involved in the modulation of regional blood flow, mainly in the skeletal muscle. The G894T polymorphism of the eNOS gene has been extensively investigated, and the 894T allele that results in glutamate to aspartate exchange at the position 298 of the eNOS enzyme, has been associated with cardiovascular diseases. However, the effects of 894T allele on muscle vasodilatation are unknown. We hypothesized that the reflex forearm blood flow responses during handgrip isometric exercise would be attenuated in individuals carrying the 894T allele. In addition, these responses would be mediated by impairment in nitric oxide availability and/or an increase in vasoconstrictor sympathetic nerve activity to skeletal muscle. To test the previous hypothesis, 287 volunteers were previously genotyped, and 33 healthy individuals selected to represent three genotypes: GG (n=15, age=43±3 years, BMI=22.9±0.3 kg/m2), GT (n=9, age=39±3 years, BMI=24.6±1.2 kg/m2) and TT (n=9, age=40±4 years, BMI=23.5±0.9 kg/m2). Heart rate (HR; ECG), mean blood pressure (MBP; oscillometric cuff) and forearm blood flow (FBF; venous occlusion plethysmography) were recorded for 3 minutes at baseline and 3 minutes during isometric handgrip exercise performed at 30% of maximal voluntary contraction. Baseline HR, MBP, FBF and forearm vascular conductance (FVC) were similar among GG (69±2 bpm; 91±3 mmHg; 1.81±0.09 ml.min-1.100 ml-1; 2.03±0.12 units, respectively), GT (69±4 bpm; 94±2 mmHg; 1.80±0.23 ml.min-1.100 ml-1; 1.90±0.24 units) and TT (63±3 bpm; 95±3 mmHg; 1.79±0.17 ml.min-1.100 ml-1; 1.89±0.17 units). FVC responses to exercise were significantly lower in TT ('delta'=0.07±0.14 units, P=.002) when compared with GG ('delta'=0.57±0.09 units) and GT ('delta'=0.64±0.20 units). To investigate the mechanisms underlying the lowered vasodilatation in TT genotype, we studied FBF during brachial intra-arterial infusion of L-NMMA (4 mg.min-1) and L- NMMA + phentolamine (4 mg.min-1 and 100µg.min-1, respectively) in a subset of 8 GG and 7 TT individuals. In addition, we directly measured muscle sympathetic nerve activity (MSNA) by means of microneurography. L-NMMA did not significantly change FVC responses to exercise in TT when compared with saline control infusion ('delta'=- 0.05±0.20 vs. -0.09±0.18 units). In contrast, L-NMMA significantly reduced FVC in GG xviii genotype ('delta'=0.79±0.14 vs. 0.14±0.09 units), and the difference between genotypes were no longer observed (P=.62). L-NMMA + phentolamine increased similarly FVC responses to exercise in GG and TT individuals ('delta'=1.16±0.26 vs. 0.56±0.24 units, respectively, P=.43). MBP and MSNA increased significant and similarly throughout experimental protocols in GG and TT genotypes. We concluded that G894T gene eNOS polymorphism is functionally associated with impaired reflex muscle vasodilatation to exercise. In addition, the attenuated vasodilatation responsiveness to exercise in individuals who are homozygous for the 894T allele of the eNOS gene seems to be primarily mediated by a reduced nitric oxide bioavailability, but not increase in MSNA Doutorado Fisiologia Doutor em Biologia Funcional e Molecular

Orientador: Gil Lucio Almeida Dissertação (mestrado) - Universidade Estadual de Campinas, Instituto de Biologia Resumo: Este estudo propõe analisar as estratégias usadas pelo Sistema Nervoso Central para controlar os movimentos multiarticulares, assim como avaliar a importância das informações proprioceptivas na manutenção desta estratégia. Sujeitos. Participaram deste estudo cinco sujeitos normais e dois sujeitos portadores de neuropatia periférica. Método. Os sujeitos permaneciam sentados em uma cadeira estando com o tronco firmemente fIxado no encosto. Nesta condição os sujeitos realizavam movimentos de reversão no plano vertical com o membro superior dominante. Partindo da posição inicial os sujeitos moviam em direção a três alvos o mais rápido possível. Resultados. Os sujeitos normais obtiveram trajetórias retilíneas à custa de uma dissociação do padrão de deslocamento articular e torque muscular entre a articulação do ombro e do cotovelo. Este comportamento determinou baixos índices 'de correlação linear entre os torques musculares gerados nas articulações do ombro e do cotovelo. Por outro lado, sujeitos portadores de neuropatia periférica não puderam dissociar o comportamento cinemático e cinético das duas articulações, estabelecendo altos índices de correlação linear entre os torques musculares. O acoplamento destas duas articulações resultou na formação de trajetórias lineares com menor retilinearidade. Discussão. Portanto, os sujeitos portadores de neuropatia periférica não conseguiram dissociar o comportamento entre as duas articulações para executar uma trajetória retilínea. Estas observações destacam dois pontos fundamentais sobre o controle dos movimentos multiarticulares. Primeiro, o Sistema Nervoso Central íntegro tem como principal estratégia manter a retilinearidade da trajetória e, segundo, as informações proprioceptivas são de fundamental importância para adequar o comportamento de cada articulação envolvida na tarefa em função da trajetória linear Abstract: This study aims amplify the understanding of the strategies launched by the Central Nervous System in the execution of multijoint tasks, as well as establish the differences in the motor behavior between subjects with neuropathies and normal ones. This differences can clarify the way the Central Nervous System integrates the proprioceptive afferent information in the programe configuration and motor commands. Subjects. Five neurologically normal subjects and two subjects with peripheral neuropathy volunteered themselves to participate in this study. Methods. The subjects made reversal movements in the vertical plan being seated in a chair with their upper bodies fnmily flXed to the back of the chairs. Starting from the initial position the subjects made movements in the three ta:çgets direction as fast as possible. No instructions were given as to the trajectory of the movement to be made. Results. The neurologically normal subjects obtained straighter trajectories differentiation in the articulate movement pattem between the shoulder and the elbow, differentiation in the musc1e torque pattem among the articulation and the index of linear correlation among the musc1e torque. However, the subjects with peripheral neuropathies could not make straight trajectories. They presented some compromise in the articulate movement of the elbow, similar to the shoulder pattem. They obtained an altemation in the muscle torque pattem of the elbow, establishing behavior similar to the one the shoulder presents. They determined high index of linear correlation. Discussion. Summarizing, the subjects could not dissociate the articulate dislocation patterns among the articulations of shoulder and elbow to guarantee the execution of a straight trajectory. This behavior would only be possible if the linear correlation index among the muscle torque was reduced. However, the subjects with peripheral neuropathy could not establish the same index present in the neur9logically normal subjects. It is possible that the proprioceptive information from a variety of muscle-skeletal structure would play an important role in elaborating motor programes that will command the sequence of muscle recruitment to establish adequate pattems of muscle torque Mestrado Fisiologia Mestre em Biologia Funcional e Molecular

Orientador: Jose Roberto Bosqueiro Tese (doutorado) - Universidade Estadual de Campinas, Instituto de Biologia Resumo: A desnutrição e a resistência periférica à insulina induzida por administração de glicocorticóides induzem compensações funcionais e morfológicas em ilhotas pan creáticas a fim de manter a homeostase glicêmica. Deste modo, investigamos as alterações desenvolvidas pelo tratamento com dexametasona (Dex) em animais submetidos à restrição protéica. Foram analisados: parâmetros metabólicos, secreção de insulina em resp osta a glicose e proteínas envolvidas na via de sinalização da insulina em ilhotas pancreáticas isoladas. Ratos submetidos à dieta hipoprotéica (LP) apresentaram características padrões que caracterizam a desnutrição como: diminuição de ganho de massa corp oral, redução dos níveis séricos de albumina, proteína total e insulina. Adicionalmente, os ratos LP exibiram aumento da sensibilidade periférica à insulina e redução da área das ilhotas pancreáticas comparadas ao grupo controle ( P < 0,05). Todos estes parâmetros apresentaram valores similares ao grupo controle nos ratos submetidos à dieta hipoprotéica e submetidos ao tratamento com Dex (LPD), exceto para o peso corpóreo ( P < 0,05). A secreção de insulina em ilhotas pancreáticas isoladas de ratos LPD aprese ntou maior responsividade à glicose, em níveis estimulatórios, comparados a secreção em ilhotas de ratos LP (P < 0,05). Paralelo aos resultados de secreção, os ratos LPD exibiram redução do conteúdo protéico de IRS-1, IRS-2 e aumento dos níveis protéicos d e p-FoxO1, p-ERK e PKC comparados ao grupo LP (P < 0,05). Concomitantemente, as ilhotas dos ratos LPD mostraram ¿se hipertrofiadas comparadas com ilhotas de ratos LP ( P < 0,05). Em conclusão, o tratamento com dexametasona reverte, ao menos parcialmente, os efeitos no metabolismo analisados e no funcionamento das ilhotas pancreáticas causados pela restrição protéica, confirmando a grande plasticidade das células ß frente a condições adversas facultativas e/ou permanentes Abstract: Malnutrition caused by protein restriction and dexamethasone -induced insulin resistance, in vivo treatment (Dex) are conditions associated with morphological and functional alterations in pancreatic islets. Thus, the present study evaluated the dexamethasone treatment effects on the metabolic parameters, glucose-stimulated insulin secretion and proteins involved in the insulin - signalling pathway over low protein diet fed rats (LP). LP rats showed decrease in body weight, serum insulin, total serum protein, and serum albumin, patte rns that characterize the LP rats. Moreover, LP rats presented improved peripheral insulin sensibility and reduced islets area (P < 0,05). Except for the body weight (P < 0,05), all these parameters were proned to be normalized in rats exposed to a low protein diet and treated with dexamethasone (LPD), whose islets showed increased glucose stimulated insulin secretion (GSIS). In addition, LPD rats showed lower protein expression of IRS-1, IRS-2 and higher in p-FoxO1, p-ERK and PKC, while presenting pancreatic islet hypertrophy compared to LP rats islet. In conclusion, dexamethasone treatment revert the effects related to metabolism and islet function caused by diet protein restriction, confirming ß-cells wide plasticity, even in transient or lasting adverse conditions Doutorado Fisiologia Doutor em Biologia Funcional e Molecular

Orientador: Jose Mauro Granjeiro Tese (doutorado) - Universidade Estadual de Campinas, Instituto de Biologia Resumo: As fissuras orais exercem uma profunda influência sobre a vida de seus portadores. Esses indivíduos apresentam, desde o nascimento, dificuldades na alimentação, disturbios ósseos maxilar e mandibular, na arcada dentária, na fala e, em alguns casos, na audição. Além disto, fissurados e seus familiares enfrentam sérios problemas psicológicos decorrentes do comprometimento estético causado pela anomalia. Sem dúvida alguma, a morfogênese do palato secundário é um dos pontos mais críticos na formação da face e do palato. Depende de uma sequência complexa de eventos que possuem em comum o remodelamento de matriz extracelular (MEC), regulado, principalmente, pelas metaloproteinases de matriz (MMPs). Esta éa primeira vez que RECK, uma proteína indutora da reversão tumoral, rica em cisteína e com motivos kazal, é pesquisada neste processo. O primeiro objetivo deste estudo foi investigar se há expressão de RECK durante os eventos envolvidos na formação do palato secundário em camundongos. A partir dos resultados obtidos, indicando a presença de RECK nesses eventos, objetivou-se estabelecer um padrão temporal e espacial dessa expressão, assim como analisar o padrão de distribuição de MMP-2 e MMP-9, comparando os resultados obtidos entre si. Para tanto, cabeças inteiras e palatos dissecados de embriões de camundongos com 13; 14; 14,5 e 15 dias de desenvolvimento embrionário (DE) foram submetidos a reações de PCR em tempo real, hibridização in situ, imunoistoquímica e zimografia. As reações de PCR em tempo real indicaram a presença de mRNA de RECK (mRECK) em todos os períodos analisados, os níveis do transcrito aumentaram gradativamente e foram significativamente diferentes entre 13 e 15DE e entre 14 e lSDE. Os resultados de hibridização in situ e imunoistoquímica apontaram, consecutivamente, um padrão variável de distribuição de mRECK e da proteína RECK no mesênquima, epitélio e linha de junção (LI) formada entre as paredes palatais, no transcorrer dos períodos analisados. Com relação ao padrão de expressão das MMPs, a análise imunoistoquímica revelou a presença de MMP-2 no mesênquima, epitélio e LI em todos os períodos. A MMP-9 foi expressa no 14DE, 14,SDE e lSDE na LI e mesênquima palatal. A análise zimográfica confirmou a atividade de MMP-2 e MMP-9. Dessa forma, concluímos que RECK está presente nos principais eventos de formação do palato secundário, apresentando um padrão de expressão variável no tempo e espaço, que quando compar~o ao padrão de " expressão de MMP-2 e MMP-9 apresentam, na maioria das vezes, similaridades entre si. Esses , achados sugerem um provável envolvimento dessas moléculas na organogênese do palato secundário e uma possível interação/modulação entre elas Abstract: The oral clefts show a great influence in the size of their hosts. They have, since birthy, difficulties in alimentation, problems in the maxilar bones, in dental arch, in speech, and in some cases, in hearing. In addition, the hosts and their families have serious psychological problems due to the esthetic lenght caused by anomalia. With no doubt, the formations of the secondary palate is one of the most critial phases during the formation of the surface and of the palate. Depending on a sequente of complex events that have in common the remodeling of the extracellular matrix (ECM), mainly regulated by matrix metalloproteinases (MMPs). This is first time that the presence of RECK, a reversion-inducing cystein-rich protein with kazal motifs, this is process is researched. The first objective of this study was to investigate the RECK expression during events involved in formation of the secondary palate in mice. Based on the results obtained, which indicated the presence of RECK in these events, the objective was to establish a temporal and spatial pattern of such expression, as well as to analyze the pattern of distribution of MMP-2 and MMP-9, comparing the results obtained to each other. For that purpose, whole heads and dissected palates of mice aged 13, 14, 14.5 and 15 days of embryonic development (ED) were submitted to real-time PCR, in situ hybridization, immunohistochemistry and zymography. The real-time PCR indicatedthe presence of mRNA of RECK (mRECK) in all periods analyzed; the transcript levels were gradually increased and were significant1y different between 13 and 15ED and between 14 and 15ED. The results of in situ hybridization and immunohismchemistry consecutively indicated a variable pattern of distribution of mRECK and RECK protein in the mesenchyme, epithelium and in midline edge seam (MES) formed between the palatal shelves during the study periods. With regard to the pattern of expression of MMPs, immunohistochemical analysis revealed the presence of MMP- 2 in the mesenchyme, epithelium and MES in all periods. The MMP-9 was expressed in the MES and palatal mesenchyme at 14ED, 14.5ED and 15ED. Zymographic analysis confirmed the activity of MMP- 2 and MMP-9. Therefore, it was concluded that RECK is present in the main events of formation of the secundary pala te, presenting a variable pattern of expression along time and space, which often present similarities to each other compared to the pattern of expression of MMP-2 and MMP-9. These findings suggest probable .involvement of these molecules in the formation of the secondary palate and possible interaction/modulation among them Doutorado Bioquímica Doutor em Biologia Funcional e Molecular

Orientadores: Eneida de Paula, Daniele Ribeiro de Araujo Tese (doutorado) - Universidade Estadual de Campinas, Instituto de Biologia Resumo: O controle da dor é de extrema importância em odontologia, já que a maioria dos procedimentos odontológicos envolve estímulos dolorosos. Com a descoberta dos anestésicos locais, que se caracterizam pela capacidade de abolir a dor sem a perda da consciência, deu-se um grande passo para o avanço da odontologia. Um anestésico local ideal deve apresentar ação anestésica duradoura (suficiente para os procedimentos operatórios) e baixa toxicidade. Várias pesquisas têm sido desenvolvidas com anestésicos locais objetivando prolongar a duração de seu efeito e diminuir sua toxicidade. Um caminho muito promissor foi aberto com o desenvolvimento de formulações anestésicas de liberação prolongada, utilizando carreadores como lipossomas, que mantêm o fármaco por mais tempo e em maior concentração no sítio de ação. Este trabalho teve por finalidade preparar formulações de liberação prolongada do anestésico local prilocaína, muito usado em odontologia. Objetivouse: (i) preparar prilocaína encapsulada em lipossomas; (ii) caracterizar físicoquimicamente essa formulação, (iii) avaliar a atividade terapêutica, com testes de nocicepção em animais e (iv) avaliar a formulação quanto à estabilidade e à toxicidade local. Após a preparação, testes de caracterização físico-química demonstraram a interação da prilocaína com os lipossomas. Com a técnica de Ressonância Paramagnética Eletrônica pôde-se observar um decréscimo de 11% no parâmetro de ordem da membrana lipossomal, em presença do anestésico local. Com a análise por espalhamento de luz quase-elástico (light scattering) observou-se que as vesículas lipossomais apresentaram diâmetro médio de 382nm (±30), que não sofreu variação significativa (p>0,05) após encapsulação da prilocaína. Ensaios de liberação in vitro evidenciaram taxa de liberação mais lenta para a prilocaína lipossomal (equilíbrio em 90 min) que para prilocaína em solução (60 min). Análises por light scattering (p>0,05), de peroxidação lipídica (p>0,05) e ressonância magnética nuclear de prótons (H1-NMR) mostraram que, após processo de esterilização em autoclave, a prilocaína lipossomal permaneceu estável por um período de 30 dias após a preparação. Esses experimentos não mostraram diferenças na estabilidade físico-química da prilocaína ou da preparação lipossomal, estéreis ou não. Testes de bloqueio do nervo infraorbital em ratos e de tail-flick em camundongos revelaram maior efeito analgésico para a prilocaína lipossomal em relação à prilocaína em solução (p0,05) para o efeito da prilocaína lipossomal. A avaliação da toxicidade local em ratos mostrou que a prilocaína lipossomal não provocou edema de pata, quando comparada com soluções controle: salina, tampão, prilocaína em solução e lipossoma (p>0,05). Na avaliação histológica da mucosa oral dos ratos, não houve diferença significativa (p>0,05) entre os animais tratados com prilocaína lipossomal e seus controles. Com esses resultados, pôde-se concluir que a encapsulação de prilocaína em lipossomas aumentou a duração do bloqueio nervoso sensorial sem induzir o aumento na toxicidade local, podendo ser considerada mais uma opção no arsenal já disponível para a anestesia local em odontologia Abstract: Pain control is an extremely important issue in dentistry since most of the dentistry procedures involve painful stimuli. The discovery of local anesthetics, which have the capability of abolishing the pain without loosing the consciousness, meant a major step in dentistry advance. An ideal local anesthetic must present lasting anesthetic action (long enough for surgery procedures) and low toxicity. Many researches have been developed with local anesthetics aiming at the prolongation of their anesthetic effect duration and decrease of their toxicity. A very promising path was open with the development of long-acting local anesthetics formulations, using carriers as liposomes that are able to enhance the bioavailability, to reduce the systemic toxicity and to increase the local anesthetic half-life in vivo. This present study comprised (i) the preparation of liposomal prilocaine ( a local anesthetic widely used in dentistry) formulation, (ii) the physicochemical characterization of the formulation, (iii) the assessment of its anesthetic efficacy and (iv) the evaluation of its physicochemical stability, as well as of its toxic effects. After preparation, the physicochemical characterization showed the prilocaine-liposome interaction. Electron spin resonance results showed a decrease in the order parameter of liposomal membrane, in presence of prilocaine. Laser light-scattering analysis revealed a vesicle population of liposomes with 382nm (± 30) diameter, without size changes after prilocaine incorporation. In the in vitro drug release assay, the liposomal formulation led to a slower release rate of prilocaine compared to its plain formulation. Equilibrium was delayed from 60 min (prilocaine in solution) to 90 min with the drug delivery system. Liposomal prilocaine was found to be stable up to 30 days after preparation, according to the analysis by laser light scattering (p > 0.05), thiobarbituric acid reactions (p > 0.05) and H1-nuclear magnetic resonance, once these assays did not show differences on physicochemical stability of prilocaine in solution or prilocaine liposomal, sterilized or not. Rat infraorbital nerve blockade and mice tail-flick tests revealed that a prolonged anesthetic effect was produced by liposomal prilocaine in comparison to prilocaine in solution (p0,05). Local toxicity evaluation in rats showed that the liposomal prilocaine did not evoke rat paw edema when compared to the control groups: saline, Hepes buffer, prilocaine in solution and liposome (p > 0.05). There were no statistical differences (p > 0.05) between lipossomal prilocaine and their controls, in histological evaluation of rat oral mucous. In conclusion, the prilocaine encapsulation in liposomes enhanced the nerve sensorial blockade, without increasing local toxicity. Liposomal prilocaine can, therefore, be considered an option to local anesthesia in dentistry Doutorado Bioquímica Doutor em Biologia Funcional e Molecular

Orientador: José Mauro Granjeiro Tese (doutorado) - Universidade Estadual de Campinas, Instituto de Biologia Resumo: O objetivo do trabalho foi avaliar comparativamente a neoformação óssea e o perfil de gelatinases 2 e 9 durante o reparo de defeito crítico em crânio de ratos tratados com osso autógeno ou xenoenxerto desmineralizado. Um defeito ósseo de tamanho crítico (8 mm) foi confeccionado no crânio de 90 ratos Wistar (90 dias de vida), e preenchido com osso autógeno (grupo controle) obtido durante a confecção do defeito ou com matriz óssea bovina desmineralizada (grupo teste). Após os períodos de 7, 14, 21, 30 e 90 dias, os animais foram eutanasiados e as peças coletadas para análises histomorfométrica (em hematoxilina e eosina) e zimográfica. A análise paramétrica foi realizada utilizando análise de variância (teste de Tukey se p

Orientador: Gil Martins Felippe Dissertação (mestrado) - Universidade Estadual de Campinas, Instituto de Biologia Resumo: Foram estudados os efeitos da secagem artificial e de diversas condições de armazenamento na germinação e manutenção de viabilidade de sementes de limão cravo (Citrus reticulata var. austera Hib. -Swingle), respectivamente. A influência de fatores ambientais (temperatura e luz) e dos tegumentos das sementes na germinação foi analisada, bem como as relações entre as mudanças de níveis hormonais endógenos nas diferentes fases do armazenamento com a manutenção ou a queda da viabilidade das sementes. A secagem artificial de sementes causou um pequeno decréscimo inicial de germinação, mas estatisticamente diferente quando comparado com as sementes frescas. Entretanto, com a evolução do período de armazenamento, as sementes secas mantiveram a mesma porcentagem de germinação (em torno de 80%), enquanto que as sementes frescas perderam rapidamente o poder germinativo, que atingiu zero aos 8 meses. Estes resultados foram corroborados por testes de tetrazólio. Através de testes de germinação em condições de laboratório mostrou-se que a secagem das sementes até 6% de umidade, seguida de enlatamento hermético e conservação sob temperatura de '4 GRAUS'C foi a melhor das condições de armazenamento testadas, resultado este confirmado posteriormente em condições de campo e em testes de tetrazólio. Sob temperaturas constantes de 5, 10, 40 e '45 GRAUS'C não ocorreu a germinação de semente... Observação: O resumo, na íntegra, poderá ser visualizado no texto completo da tese digital Abstract: Germination and viability maintenance of limão cravo (Citrus reticulata var. austere Hib. ? Swingle) seeds under artificial drying and several storage conditions, respectively, were studied. Environmental factors as temperature and light, and presence / absence of seed coats (testa and tegmen) were analysed as to their influences on seed germination as well as the relationships between hormonal level changes throughout the several storage periods studied and seed viability losses. Artificial drying induced a slight but significant However, dried seeds were able to maintain high germination percentages (about 80%) throughout the storage period while fresh seeds had their germination percentagens drastically reduced, reaching zero after 8 months storage. These results have been corroborated by tetrazolium tests. The best storage conditions were found to be those in which seed were dried to 6% moinsture content, hermetically sealed in cans and subsequently stored at '4 GRAUS'C. these findings were later confirmed by tetrazolium tests and field trials. No seed germination at constant temperatures of 5, 10, 40 and '45 GRAUS'C was observed. On the other hand constant temperatures of 25, 30 and '35 GRAUS'C induced high germination percentages while seed germination was delayed at constant temperatures of 15 and '20 GRAUS'C... Note: The complete abstract is available with the full electronic digital thesis or dissertations Mestrado Mestre em Biologia Funcional e Molecular

Orientadores: Antonio Carlos Boschero, Fernanda Ortis Dissertação (mestrado) - Universidade Estadual de Campinas, Instituto de Biologia Observação: O resumo, na íntegra, poderá ser visualizado no texto completo da tese digital. Note: The complete abstract is available with the full electronic digital thesis or dissertations. Mestrado Fisiologia Mestra em Biologia Funcional e Molecular

Orientadores: Hiroshi Aoyama, Celso Eduardo Benedetti Tese (doutorado) - Universidade Estadual de Campinas, Instituto de Biologia Resumo: Em nosso laboratório foram purificadas quatro isoformas de fosfatases ácidas, a partir de sementes de soja quiescentes, tendo sido também estudadas suas propriedades cinéticas e físico-químicas. Estudos físicos e estruturais destas enzimas requerem uma grande quantidade da proteína pura, o que exigiria várias purificações convencionais, que, em geral, são bastante trabalhosas. Devido a este fato e a existência de poucas de tais proteínas clonadas e expressas, nos propusemos a clonar e expressar uma proteína tirosina fosfatase (PTP) de soja. O estudo da cinética da PTP recombinante revelou que esta enzima possui características típicas de uma fosfatase e maior especificidade para tirosina-fosfato em relação a outros substratos analisados. Foi feito o estudo de desnaturação térmica da enzima, através de dicroísmo circular, que mostrou que a enzima recombinante apresenta baixa estabilidade térmica. Identificamos por western blot a presença da GmPTP nos diferentes tecidos de soja, germinados tanto no claro como no escuro. Estes resultados, confrontados com os obtidos no PCR quantitativo, mostram uma expressão aumentada do tecido raiz, quando comparada aos outros tecidos avaliados, que está em concordância com o encontrado na literatura, referente à importância fisiológica da enzima neste tecido. Níveis adequados de fósforo são necessários para o crescimento e desenvolvimento de todos os organismos para o bom funcionamento de funções como estrutura molecular, geração de energia e regulação metabólica. A demanda por fósforo e sua conseqüente absorção do solo pelas raízes, aumenta dramaticamente durante o período de rápido crescimento e divisão, por exemplo, na germinação de sementes. Sendo assim, como supridores importantes de fósforo para o metabolismo da planta, podemos citar as fitases e fosfatases, que, além de contribuírem para prover nutrientes, as fosfatases também desempenham papel importante no controle de diferentes funções da planta, particularmente na regulação das cascatas de transdução de sinal. Utilizamos microarranjos de quinases como ferramenta para avaliação do quinoma da raiz nas plântulas de soja germinadas na presença e ausência de luz. Assim, concluímos que fatores ambientais, como a presença de luz e disponibilidade de nutrientes fazem com que diferentes vias estejam ativas e que diferentes fitormônios estejam agindo predominantemente. Relacionando as condições de germinação das plântulas de soja com esses fatores e às quinases mais ativadas no chip, propomos um modelo de sinalização onde o hormônio ácido abscísico responde ao estresse através da ativação de vias como as de MAPKs e de cálcio, causando modulação da atividade de fosfatases e quinases, resultando em respostas como proliferação e rearranjo do citoesqueleto das raízes. Neste trabalho, nós descrevemos a clonagem, expressão de uma de soja, sua caracterização cinética, localização tecidual e investigação da possível relação com a sinalização disparada pela presença ou ausência de luz. A investigação e caracterização de PTPs em plantas podem fornecer informações relevantes no campo de pesquisa do metabolismo vegetal. Sendo assim, nós disponibilizamos dados bioquímicos relevantes os quais sugerem que as plântulas de soja contêm PTP típicas que são principalmente expressas em raízes e aparentemente desempenham papel importante durante a germinação da semente. Abstract: Our group previously described the purification and characterization of four acid phosphatase isoforms obtained from mature soybean seeds, and determined the kinetic and physico-chemical properties of these enzymes. Structural and physical studies demand high amounts at purity levels of these enzymes, requiring efforts in laborious conventional purifications. Due to this fact and to the existence of few plant proteins that already has been cloned and expressed, we proposed to clone and express a protein tyrosine phosphatase (PTP) from soybean. The kinetic studies of the recombinant PTP revealed an enzyme with phosphatase typical features and higher specificity toward Tyr-phosphate when compared to other analysed substrates. The analysis of thermal inactivation of the enzyme was carried out by circular dichroism, which showed that GmPTP had low thermal stability. The immunolocalization of GmPTP, by western blot, identified the enzyme in different soybean tissues, which were germinated in the presence and absence of light. These results are in agreement with those obtained from the quantitative PCR results, that showed a higher expression of GmPTP in roots when compared with other evaluated tissues. The physiological importance of this tissue to the plant metabolism corroborates our results, because adequate levels of phosphorus are required for the good operation of metabolic functions, as growth and development. The phosphorus demand and the consequent soil absorption through the roots dramatically increase in periods of high growth rate, for instance, during germination. Therefore, phytases and phosphatases are important suppliers for plant metabolism and besides the contribution to provide nutrients, phosphatases could play an important role in regulation of signal transduction cascades. Kinase microarrays were employed as a strong tool to analyse the root kinome in soybean plantlets germinated in light and dark conditions. We concluded that abiotic factors as light presence and nutrients availability were responsible for the activation of different pathways and different phytormones prevalence. Relating the germination conditions of soybean plantlets to these factors and to the analysis of the most activated kinases on the chip, we propose a signaling model to explain that, when the hormone abscisic acid is the main response of stress stimuli, it triggers the activation of MAPK and calcium signaling, and the resulting modulation of kinases and phosphatases activities led to proliferation and cytoskeleton rearrangement in roots. In this work, we described the cloning and expression of a soybean PTP, its kinetic characterization, tissue distribution and investigation of a putative relationship with the signaling pathway triggered by light and dark. The investigation and characterization of PTPs from plants can add relevant information in the plant metabolism research field. Therefore, we provided a wealth biochemical data which suggest that soybean plantlets contain typical PTP, which is mainly expressed in roots and apparently plays a critical role during germination. Doutorado Bioquímica Doutor em Biologia Funcional e Molecular

Orientador : Hiroshi Aoyama Dissertação (mestrado) - Universidade Estadual de Campinas, Instituto de Biologia Resumo: O objetivo central do presente trabalho foi avaliar a estabilidade conformacional da fosfatase ácida de sementes quiescentes de soja. Através de estudos de desnaturação térmica, verificou-se uma temperatura de transição (TM) de 65 oC que mostra uma resistência incomum frente à temperatura. Observaram-se efeitos da concanavalina A (lectina) e de molibdato (inibidor) no perfil de desnaturação enzimática com alterações na TM. A desnaturação enzimática por dodecilsulfato de sódio (SDS) foi muito pouco significativa em presença do fosfoenolpiruvato (PEP) como substrato. Essa insensibilidade ao agente desnaturante pode ser explicada pela alta afinidade apresentada pela fosfatase em relação ao substrato em questão. A desnaturação térmica da enzima em presença do PEP revelou que este substrato produz uma mudança significativa no perfil de desnaturação, induzindo uma diminuição na temperatura de transição (TM) que representa um efeito antagônico àquele observado na desnaturação por SDS. A análise de aminoácidos revelou informações valiosas que explicam propriedades como o pI relativamente baixo (5,0), e o número expressivo de resíduos ácidos pode estar relacionado à estabilidade conformacional da enzima. Os estudos sistemáticos da desnaturação reversível por uréia e cloreto de guanidínio (GuaCl) foram realizados utilizando-se a fluorescência como técnica de monitoramento. O cálculo da Estabilidade Conformacional (deltaG H2O) foi feito tomando-se os deslocamento nos comprimentos de onda de máxima emissão de fluorescência como parâmetro e o valor obtido foi de 2,48 kcal/mol -1. Os cálculos de centro de massa foram tomados em função da concentração do agente desnaturante em ambos os casos. A análise de carboidratos, realizada por HPLC revelou a presença de manose, glicosamina e galactosamina e a remoção da fração de carboidratos não foi possível mesmo após tratamento com 300 mU das endoglicosidases endo-H, endo-F e endo-F1 Abstract: The central aim of the present work was to evaluate the conformational stability of an isoform of soybean seeds acid phosphatase. Through thermal denaturation studies, the transition temperature (TM) value determined (65 oC), indicated an unusual resistance of the enzyme under high temperatures. Effects of strongly binding compounds such as concanavalin A (lectin) and molybdate (inhibitor) on the denaturation profile and transition temperature values were also observed. Enzymatic denaturation by sodium dodecyl sulfate (SDS) was insignificant in presence of phosphoenolpyruvate (PEP) which might be explained by the high affinity of the enzyme for this substrate. Thermal denaturation studies in presence of PEP showed both a significant change on the denaturation profile and a reduction on the transition temperature value. Aminoacid analysis contributed to important informations that are in accordance with some properties of the enzyme such as the relatively low isoelectric point (pI): 5.0. Furthermore, the expressive number of acid residues seems to be related to the conformational stability of the polypeptidic chain. Systematic studies of reversible denaturation by urea and guanidinium chloride (GuaCl) were carried out using fluorescence as a monitoring technique. Conformational Stability calculations were made based on the wavelengths corresponding to the maximum fluorescence emission as a parameter and the value obtained was 2.48 kcal.mol-1. Calculations of the centre of mass were made as a function of the denaturating agent concentration in both cases. Carbohydrate analysis was carried out by using High Performance Liquid Chromatography (HPLC) revealed mannose, glucosamine and galactosamine as main carbohydrates in the glycoconjugated structure. Carbohydrate removal was not possible even after treatment with 300 mU/mL of the endo-beta-N-acetylglucosaminidases-H, F and F1 Mestrado Bioquímica Mestre em Biologia Funcional e Molecular

Orientadores: Gonçalo A. Guimarães Pereira, Francisco Javier Medrano Martin Tese (doutorado) - Universidade Estadual de Campinas, Instituto de Biologia Resumo: A doença Vassoura-de-bruxa do cacaueiro (Theobroma cacao) é causada pelo fungo basidiomiceto Moniliophthora perniciosa e atualmente constitui um dos maiores problemas fitopatológicos do Brasil. Análises do genoma de M. perniciosa permitiram identificar três genes codificadores para proteínas indutoras de necrose e etileno (NEPs) descritas em oomicetos, bactérias e alguns fungos ascomicetos. Os genes codificadores das proteínas NEP de M. perniciosa (MpNEPs) parecem estar localizados no mesmo cromossomo e foram nomeados 1 e 2 (o terceiro gene está incompleto) segundo a descoberta no genoma (1) ou em uma biblioteca de cDNA de interação M. perniciosa-cacaueiro (2). Os genes codificadores para estas proteínas foram clonados, e expressos usando um sistema de expressão heterólogo em E. coli produzindo proteínas de fusão a cauda de histidinas. As proteínas recombinantes foram purificadas usando colunas de afinidade a metais. MpNEP1 e MpNEP2 apresentam alta similaridade em sua seqüência de aminoácidos e são capazes de induzir necrose e síntese de etileno tanto em folhas de tabaco quanto em cacau. Ambas as MpNEPs apresentam perfis de expressão diferencial nas fases de vida do fungo: MpNEP1 é expressa de forma similar nas fases biotrófica e saprofítica enquanto que MpNEP2 é mais expressa na fase biotrófica. Importantes diferenças no comportamento físico das proteínas foram detectadas: MpNEP1 se comporta como um agregado (dímero ou trímero) em solução e é sensível a tratamento térmico enquanto que MpNEP2 se comporta como monômero e mantém a atividade de necrose depois de submetida a altas temperaturas. Estas diferenças sugerem que estas proteínas podem ter funções complementares durante o desenvolvimento da doença. Esta é a primeira vez que se descreve a presença desta família de proteínas em fungos basidiomicetos e seu estudo pode ser de grande importância para a compreensão dos mecanismos da doença Vassoura-de-bruxa Abstract: The hemibiotrophic basidiomycete Moniliophthora perniciosa is the causal agent of Witches¿ broom disease of Theobroma cacao, which constitutes one of the main phytopathological problems of Brazil. An analysis of the M. perniciosa draft genome led to the identification of three putative genes encoding Necrosis and Ethylene inducing Proteins, which have been described in oomycetes, bacteria, and some species of ascomycetous fungi. The NEP proteins of M. perniciosa (MpNEPs) are apparently located on the same chromosome and were named 1 and 2 according to their discovery in the genome (1) or in a cDNA library containing transcripts from the interaction M. perniciosa-cacao (2). The genes codifying MpNEPs were cloned and expressed using a heterologous expression system in E. coli producing recombinant proteins with a minimal N-terminal His-tagged fusion peptide. MpNEPs were purified using nickel affinity columns. MpNEP1 and 2 have highly similar amino acid sequences and are able to induce necrosis and ethylene emission in both tobacco and cacao leaves. These MpNEPs showed different expression profiles according to the developmental stage of the fungus: MpNEP1 was expressed in a similar way in the biotrophic and saprotrophic mycelias, while MpNEP2 was preferentially expressed in the biotrophic phase. Furthermore, important differences were also detected in the physical properties of these two proteins. MpNEP1 in solution behaves as an oligomer (dimer or trimer) and is very sensitive to temperature. On the other hand, MpNEP2 in solution behaves as a monomer and is able of rapid renaturation after boiling, thus keeping its necrotic activity. These differences indicate that these highly similar NEPs may have complementary roles during disease development. This is the first report of NEP1-like proteins in basidiomycetes and their study will be of great importance in order to acquire a better understanding of the molecular mechanisms underlying Witches¿ broom disease Doutorado Bioquímica Doutor em Biologia Funcional e Molecular

Orientador: Maria Ligia Rodrigues Macedo Tese (doutorado) - Universidade Estadual de Campinas, Instituto de Biologia Resumo: Este estudo descreve a purificação e a caracterização parcial de uma nova proteína de sementes de Pouteria torta, pertencente à família Sapotaceae. A proteína foi purificada pela combinação de filtração em gel, cromatografias de troca iônica e fase reversa. PAGE-SDS da proteína purificada resultou em uma única banda de 14 kDa e aglutinou eritrócitos humanos e animais. A atividade de lectin-like foi melhor inibida pelas glicoproteínas fetuína, asialofetuina, heparina, orosomucoide e ovoalbumina. A proteína mostrou um conteúdo de carboidrato de 22 %, estabilidade entre 37- 60 ºC e pH 5.0-10.0. Pouterin teve um conteúdo relativamente extenso de aminoácidos como Asx, Glx e Leu, e também um número alto de resíduos de Cys. Pouterin inibiu o crescimento dos fungos Fusarium oxysporum, Colletotrichum musae e da levedura Saccharomyces cerevisiae. A proteína lectina-like foi avaliada em relação ao seu papel inseticida sobre C. maculatus (Coleoptera) e A. kuehniella (Lepidoptera). A incorporação de pouterin em dieta artificial (0,12 %) causou 50 % de mortalidade das larvas de Callosobruchus maculatus, enquanto que a 0,08 % pouterin produziu uma ED50. Pouterin não produziu efeitos significativos na sobrevivência larval de A. kuehnuella; entretanto, a uma ca 1 %, produziu uma redução de 71, 4 % no peso médio larval. Os resultados de utilização da dieta realizados com larvas de A. kuehniella apresentaram uma redução em ECI, ECD e AD, e um aumento no CM. Pouterin aumentou os níveis de atividade triptica no intestino médio e nas fezes das larvas de A. kuehniella. A citotoxicidade de pouterin em linhagens celulares tumorigênicas e não tumorigênicas também foram investigadas. Nós verificamos que as células tumorais HeLa, Hep-2 e HT-29 foram altamente sensíveis a citotoxicidade de pouterin de maneira dose-dependente, enquanto células Vero não tumorigênica foram relativamente resistentes a proteína. Dentre as linhagens de células tumorais, células HeLa mostraram uma maior susceptibilidade a citotoxicidade de pouterin, exibindo um aumento tempo-dependente na dosagem de LDH e um valor de IC50 de 5 µg/mL. Alterações morfológicas como arredondamento, retração citoplasmática e condensação da cromatina, consistente com morte celular apoptótica foram observados. A indução de apoptose foi demonstrada pela fragmentação de DNA como detectado pelo TUNEL. Além disso, células HeLa incubadas com pouterin mostraram rompimento do citoesqueleto de actina. Análise em western blot revelou que pouterin provocou um aumento na expressão da p21, indicando parada do ciclo celular. Estudos subseqüentes forneceram evidencias de que a apoptose pode ser parcialmente explicada pela ativação da sinalização do receptor 1 TNF (TNFR1). Interessantemente, uma diminuição tempo dependente da expressão da subunidade do fator nuclear kappa B p65 (NF?B), concomitante com a dowregulação do inibidor da proteína 1 da apoptose (IAP1) foram observados, sugerindo que a apoptose mediado pelo TNF é a via predominante induzida por pouterin em células HeLa. Nossos resultados sugerem que pouterin é uma proteína lectina-like com ampla aplicabilidade biológica, e pode ser uma ferramenta para produzir plantas transgênicas mais resistentes a patogênos e insetos utilizando técnicas de biologia molecular. Finalmente, desde que as células Hela, Hep-2 e HT-29 foram altamente sensíveis a citotoxicidade induzida pela lectina-like, futuras investigações são necessárias, pois suas propriedades podem ser uma ferramenta útil, importante nos estudos da terapia contra o câncer humano Abstract: This study describes the purification and characterization of a novel protein from the seeds of Pouteria torta, belong to the Sapotaceae family. The protein was purified by a combination of gel filtration, ion-exchange and reverse phase chromatographies. SDS-PAGE of the purified protein resulted in a single protein band of 14 kDa and agglutinated human and animal erythrocytes. The lectin-like activity of pouterin was best inhibited by glycoproteins such as fetuin, asialofetuin, heparin, orosomucoid and ovoalbumin. The protein showed a carbohydrate content of 22 %; stability between 37 and 60 ºC and at pH 5.0-10.0. Pouterin had a relatively large content of amino acids such as Asx, Glx and Leu, and there were also a high number of Cys residues. Pouterin inhibited the growth of the fungi Fusarium oxysporum and Colletotrichum musae and of the yeast Saccharomyces cerevisiae. The lectin-like protein was tested for anti-insect activity against C. maculatus (Coleoptera) and A. kuehniella (Lepidoptera). The incorporation of pouterin into an artificial diet (0.12%) caused 50% mortality in larvae of the insect Callosobruchus maculatus, whereas 0.08 % Pouterin produced an ED50. Pouterin did not produce significant effects on survival of A. kuehnuella larvae; however, at a ca 1 %, it produced a 71.4 % reduction in the average weight of the larvae. The results from dietary utilization experiments realized with A. kuehniella larvae presented a reduction in ECI, ECD and AD, and an increase in CM. Pouterin increased the level of trypsin activity in larval midgut and faeces of A. kuehniella. The cytotoxicity of pouterin in tumourigenic and non-tumourigenic mammalian cell lines also was investigated. We found that HeLa, Hep-2 and HT-29 tumor cells were highly sensitive to pouterin cytotoxicity in a dose-dependent manner, whereas non-tumourigenic Vero cells were relatively resistant to the protein. Among the tumor cell lines, HeLa cells showed the highest susceptibility to pouterin cytotoxicity, exhibiting a time-dependent increase in LDH leakage and an IC50 value of 5 µg/mL. Morphological alterations such as rounding, cell shrinkage and chromatin condensation, consistent with apoptotic cell death were observed. Apoptosis induction was demonstrated by DNA fragmentation as detected by terminal dUTP nick-end-labeling (TUNEL). Furthermore, HeLa cells incubated with pouterin showed disruption of the actin cytoskeleton. Western blot analysis revealed that pouterin caused increased expression of p21, thus indicating cell cycle arrest. Subsequent studies provided evidence that apoptosis may be partially explained in the activation of the TNF receptor 1 (TNFR1) signalling. Interestingly, a time-dependent decrease of the expression of p65 nuclear factor kappa B (NF?B) subunit, concomitant with a downregulation of the inhibitor of apoptosis protein 1 (IAP1) was observed, suggesting that TNFR-mediated apoptosis is the predominant pathway induced by pouterin in HeLa cells. Our results suggest that pouterin is a lectin-like protein with wide biological application and could be a tool for the molecular biology. The transformation of the genes coding for this lectin-like could be useful in the development of insect resistance in important agricultural crops. Finally, since Hela, Hep-2 and Ht-29 cells were highly sensitive to lectin-like-induced cytotoxicity, pouterin merits further investigation due to its properties can be a useful tool in therapy against human cancer Doutorado Bioquímica Doutor em Biologia Funcional e Molecular

Orientador: Jose Camillo Novello Dissertação (mestrado) - Universidade Estadual de Campinas, Instituto de Biologia Resumo: Venenos de serpentes contêm uma ampla variedade de enzimas. As proteases purificadas de veneno são geralmente dassificadas por sua estrutura em: serinoproteases e metaloproteases, e apresentam potente efeito na ativação ou inibição da coagulação sangüínea, agindo na hemostasia, trombose, fibrinólise e agregação plaquetária. A presente dissertação teve por objetivo purificar e caracterizar a serinoprotease Uruprot do veneno de Bothrops altematus, uma serpente da família Viperidae. Uruprot foi purificada em dois passos cromatográficos: Sephadex G75 e DEAE 5PW, em sistema HPLC. A homogeneidade de Uruprot foi monitorada em gel SDS-PAGE e em coluna de fase reversa C18. O gel de eletroforese em condições desnaturantes evidenciou uma banda com massa molecular aparente de 32 kDa na presença de 0,1 M de DTT, sugerindo que esta é formada por uma única cadeia polipeptídica. A eletroforese de duas dimensões de Uruprot demonstrou ser seu ponto isoelétrico em torno de 4,6, confirmando massa molecular observada em SDS-PAGE. A análise da composição de aminoácidos de Uruprot apresentou alta concentração dos aminoácidos glicina, treonina, fenilalanina, isoleucina, serina e glutamina e baixos níveis de aminoácidos básicos como histidina e arginina, ratificando o resultado da 2D caracterizando um pl ácido. Uruprot teve reação positiva quando submetida à coloração para carboidrato, sugerindo a existência de carboidratos ligados covalentemente à sua estrutura. O estudo da homologia seqüencial da região N-terminal da seqüência consenso (WGGDECNINEHR-LVAI) indicou alto grau de homologia com as serinoproteinases: TVSPA (94%), KLE 11 (94%) e Ancrod (92%) entre outras. Uruprot não induziu a agregação em plaquetas lavadas, mas inibiu a indução da aglutinação de eritrócitos na presença de Ristocetina na concentração mínima de 1 O ~g/mL. O conjunto de resultados obtidos com Uruprot monstram fortes indícios de que essa pode desempenhar a função de ativadora do plasminogênio, entretanto o papel da atividade "in vivo" das serinoproteases de venenos em envenenamentos patológicos é pouco conhecido. Estudos adicionais são necessários para a obtenção de maiores informações sobre esse grupo de enzimas Abstract: Snake venoms contain a high variety of toxic compounds and enzymes. Venom purified proteases are structurally dassified as serine proteases and metalloproteases, and showa potent effect on blood coagulation, acting on hemostasis, thrombosis, fibrinolysis and platelet aggregation. The aim of this work was the purification and characterization of a serine protease from the venom of Bothrops altematus snake, called Uruprot. Uruprot was purified in a two step chromatography: Sephadex G-75 and DEAE 5PW both in HPLC system. Its homogenity was monitored in SDS-PAGE and reversedphase C18 chromatography. In denaturing conditions, 0,1 M DTT, a band of 32 kDa apparent molecular mass was evidenced, suggesting that the protein consists in one polypeptidic chain. The two dimensional electrophoresis of Uruprot showed its isoelectric point at about 4,6, confirming the apparent molecular mass observed in SDS-PAGE. Uruprot's amino acid analysis composition showed a high concentration of glycine, threonine, phenylalanine, isoleucine, serine and glutamine and low levels of basic amino aCids, as histidine and arginine, ratifying the result obtained from bidimensional electrophoresis wich showed an acid pl. Uruprot showed a positive reaction when submitted to carbohydrate coloration indicating the presence of carbohydrate covalentely bound to its structure. The N-terminal sequence homology study showed a consensus sequence (WGGDECNINEHR-LVAI) and indicated a high homology with serine proteinase TSV-PA (94%), KLE 11 (94%), Ancrod (92%), and others. Uruprot did not induce platelet aggregation but inhibits erytrocytes agglutination in the presence of ristocetin, in a minimum concentration of 10llg/mL. Ali the results obtained indicates that Uruprot is a serine protease plasminogen activator, however, the role of "in vivo" activity of venom serine proteases in envenomation remains unclear. Additional studies are necessary to provide more information about this enzyme grou Mestrado Bioquímica Mestre em Biologia Funcional e Molecular

Orientadores : Lucia Pereira da Silva, Denise Vaz de Macedo Dissertação (mestrado) - Universidade Estadual de Campinas, Instituto de Biologia Resumo: O BN-Page ("Blue Native Polyacrylamide gel electrophoresis") é uma técnica desenvolvida para análise de proteínas de membrana. Associada à coloração histoquímica, essa técnica permite análise e caracterização dos complexos enzimáticos da cadeia de transporte de elétrons. A grande vantagem dessa técnica é a utilização de uma pequena quantidade de tecido (30mg) permitindo análise das atividades das enzimas acima especificadas, sem a necessidade do isolamento de mitocôndrias. Dessa forma, esse método pode ser utilizado no estudo de diversas alterações que podem ser induzidas por condições especiais, dentre as quais: o exercício físico, a DPOC e doenças que afetam a função mitocondrial (Parkinson, Alzheimer etc). O objetivo desse trabalho foi a padronização da técnica de BN-Page associada à coloração histoquímica específica dos complexos I e IV da cadeia de transporte de elétrons em músculo esquelético de rato. Os músculos utilizados foram o sóleo, o gastrocnêmio (porção vermelha e branca) e o semitendinoso. A atividade das enzimas foi medida através de densitometria óptica usando a banda referente ao complexo V isolado por eletroforese e corado com Coomassie Blue como padrão interno. Nossos resultados indicaram uma boa resolução dos géis e uma correlação ótima entre a atividade da enzima citrato sintas e (conhecida como marcador de quantidade de mitocôndria) e a área/intensidade da banda referente ao complexo V, indicando que essa também pode ser utilizada como marcador de conteúdo mitocondrial. A atividade do complexo I e IV dos músculos mais oxidativos (sóleo e gastrocnêmio vermelho) apresentou uma variação bem pequena e uma correlação linear com a área do complexo V. Já nos músculos mais glicolíticos houve maior variação na atividade de ambos complexos e sua correlação com o complexo V foi menor Abstract: BN-PAGE (Blue Native Polyacrylamide gel electrophoresis) is a technique developed for the analysis of membrane proteins. This technique added to the histochemical staining enables the analysis and characterization of the activity of the enzymatic complexes of the mitochondrial electron transport chain. A key advantage of this technique is the small quantity of tissue required (30 mg) for homogenate extraction, allowing the use of this analysis for tissues from different species, inc1uding humano This method can be used for protein defects characterization in mitochondrial myopaties such as Leber's disease, Parkinson and A1zheimer diseases among other pathologies such as COPD (chronic obstructive pulmonary disease) and biochemical adaptations induced by physical exercise. The aim of this work was the standardization of this technique using histochemical staining for Complexes I and N of the eletron-transport chain in four rat skeletal musdes (soleus, red and white gastrocnemius and semitendinosus). The enzyme activity was measured by optical density (Image master lD - Pharmacia Biotech) using the Blue stained complex V area obtained from BN-Page as an internal standard. Its good resolution and the good correlation between its areajintensity and citrate synthase activity indicates that complex V is a good quantitative marker of mithocondrial contento The activity of complex I and N of oxidative musc1es (soleus and red gastrocnemius) presented a narrow range of values and a dose linear correlation wtih complex V. On the other hand, the glycolytic musdes (white gastrocnemius and semitendinosus) presented a wide range in their enzyme activity of both complexes and had a little correlation Mestrado Bioquímica Mestre em Biologia Funcional e Molecular

Orientador: Regina Celia Spadari-Bratfisch Dissertação (mestrado) - Universidade estadual de Campinas, Instituto de Biologia Resumo: No estresse observa-se a elevação das concentrações plasmáticas de hormônios tais como as catecolaminas, os glicocorticóides e o glucagon. Estes hormônios determinam alterações em funções metabólicas, entre elas as que ocorrem em tecido adiposo, estimulando a lipólise e inibindo a lipogênese, e em tecido hepático, estimulando a glicogenólise, a gliconeogênese e a síntese de lipoproteínas. Além disso, havíamos previamente observado que o estresse por choque repetido nas patas, induz alterações de sensibilidade na resposta lipolítica a agonistas beta-adrenérgicos em adipócitos brancos isolados de ratos. Neste trabalho, utilizamos ratos alimentados e conscientes, submetidos a três sessões diárias de estresse por choque nas patas, para determinar: 1) as concentrações plasmáticas de corticosterona, glicose, glicerol e triacilgliceróis; 2) as concentrações plasmáticas de glicose, glicerol e triacilgliceróis mediante a infusão endovenosa dos agonistas beta-adrenérgicos: isoproterenol, noradrenalina ou BRL37344; 3) verificar se as alterações de sensibilidade lipolítica previamente demonstradas in vitro se refletem nas concentrações plasmáticas de glicerol, em resposta à infusão dos agonistas beta-adrenérgicos citados acima. Nossos resultados mostraram que a concentração plasmática basal de corticosterona era elevada em comparação àquela observada em ratos anestesiados, e aumentou significativamente após as sessões de estresse, enquanto que a concentração plasmática de triacilgliceróis se elevou após a primeira sessão e a de glicose aumentou após as segunda e terceira sessões de estresse. As concentrações plasmáticas de glicerol não sofreram alterações significativas, antes ou após as sessões de estresse. Os ratos submetidos a estresse foram mais sensíveis à infusão de isoproterenol e noradrenalina junto com prazosin, mantendo elevadas as concentrações plasmáticas de glicose durante a infusão, e respondendo com elevação das concentrações plasmáticas de glicerol e de triacilgliceróis. A infusão de BRL37344, causou elevação significativa da concentração plasmática de glicerol em ratos submetidos a estresse É provável que esta maior sensibilidade de ratos estressados aos agonistas beta-adrenérgicos utilizados esteja relacionada à influência permissiva da corticosterona endógena. Apenas o BRL37344 causou elevação da concentração plasmática de glicerol em ratos estressados, em comparação às suas próprias concentrações basais, provavelmente porque adrenoceptores-beta3 parecem não estar envolvidos na síntese hepática de triacilgliceróis, permitindo que o glicerol liberado pela lipólise acumule-se no plasma. Os resultados apresentados sugerem que o glicerol liberado do tecido adiposo, estaria sendo inicialmente utilizado pelas células hepáticas para a síntese de triacilgliceróis, mas que, com a repetição do estresse, a função hepática poderia estar sendo redirecionada para a liberação de glicose, possivelmente utilizando o glicerol como um dos substratos. Entretanto esta hipótese necessita ser testada Além disso, embora adipócitos isolados sejam subsensíveis à noradrenalina, in vivo a resposta à infusão de isoproterenol, noradrenalina e BRL37344 é mais pronunciada em ratos estressados do que em ratos controle Abstract: Stress hormones can cause alterations in metabolic functions at the adipose tissue and liver. Moreover, repeated footshock stress induce alterations on the sensitivity to beta-adrenergic agonists in the rat white adipocytes lipolytic response. Therefore, our objective was to determine in fed and conscious male rats submitted to three daily footshock stress sessions: 1) plasma corticosterone, glucose, glycerol and triacylglycerols levels; 2) plasma glucose, glycerol and triacylglycerols levels in response to beta-adrenergic agonists infusion. Our results have shown that plasma corticosterone leveI increased significantly after each stress session while triacylglycerols increased after the first session and glucose increased after the second and third sessions. Glycerol level did not show any alteration after stress. These results suggest that repeated footshock stress might induce metabolic changes, driven towards glucose instead of triacylglycerols release by hepatic tissue, probably by using the glycerol as one of the subtracts in both pathways. Stressed animaIs were more sensitive to noradrenaline plus prazosin and to isoproterenol infusion, maintaining elevated plasma glucose leveI and increasing the plasma glycerol and triacylglycerols levels. Probably, the higher sensitivity to isoproterenol and noradrenaline in stressed animaIs is related to the permissive influence of plasma corticosterone. Only BRL37344 increased the plasma glycerol leveI in stressed rats probably because beta3-adenoceptors seem not to be involved in the hepatic triacylglycerols synthesis, allowing the glycerol backlog in the plasma Mestrado Fisiologia Mestre em Biologia Funcional e Molecular

Orientadores: Everardo Magalhães Carneiro, Rosane Aparecida Ribeiro Dissertação (mestrado) - Universidade Estadual de Campinas, Instituto de Biologia Resumo: No acoplamento estímulo/secreção das células ?, os canais de K+ sensíveis ao ATP (KATP) e os canais de Ca2+ sensíveis à voltagem (Cav) contribuem para a geração e sustentação do potencial de ação. Alterações na sua expressão/atividade resultam em prejuízos na secreção de insulina. A restrição protéica e dieta hiperlipídica alteram o fluxo iônico e secreção de insulina nas células ?, e o aminoácido taurina (Tau) regula o fluxo iônico. O objetivo desse estudo foi caracterizar a expressão e o funcionamento dos KATP e Cav, assim como proteínas de extrusão dos grânulos de insulina em ilhotas pancreáticas de camundongos desnutridos alimentados com dieta hiperlipídica e suplementados com Tau. Camundongos machos C57Bl/6J receberam dieta controle (C) ou dieta lipoproteica (R) por 6 semanas. Em sequência metade desses grupos foi alimentados por 8 semanas com dieta hiperlipídica sem (CH e RH) ou com suplementação de 5% de Tau (CHT e RHT). Foi verificado que camundongos R tiveram menor crescimento e desenvolvimento dos órgãos. Camundongos RH e CH apresentaram aumento de peso corporal e estoques de gordura, hipercolesterolemia, intolerância à glicose e resistência à insulina. A suplementação com Tau preveniu o acúmulo de gordura e prejuízos na homeostase da glicose apenas no grupo CHT. Ilhotas isoladas de camundongos R secretaram menos insulina em resposta a 2,8 mM ou 11,1mM de glicose em associação com 30 mM de K+ ou 100 ?M de tolbutamida (Tolb). O influxo de Ca2+ em resposta à Tolb não diferiu entre ilhotas R e C. Ainda, ilhotas R tiveram redução do conteúdo total de insulina, da expressão protéica da SNAP-25, e aumento da subunidade Kir6.2 dos KATP e da sua atividade em resposta à glicose. Ilhotas CH secretaram mais insulina frente a 11,1 mM de glicose e agentes despolarizantes, associada à maior inibição dos KATP e ativação dos Cav em resposta à glicose. O grupo RH apresentou menor secreção de insulina frente a 2,8 mM de glicose e 30 mM de K+, e secreção similar ao grupo C frente a 11,1 mM de glicose e agentes despolarizantes, com aumento na expressão da SNAP-25 e inibição dos KATP em resposta à glicose. No grupo CHT houve normalização da liberação de insulina e aumento na expressão das subunidades ?1.2 e ?2 do Cav, SNAP-25 e sintaxina. Nas ilhotas RHT houve aumento na secreção de insulina frente à glicose e agentes despolarizantes, maior expressão da sintaxina e da subunidade Kir6.2 do KATP, bem como de sua inibição em resposta à glicose. Prejuízos na secreção de insulina no grupo R estão associados à menor expressão de proteínas envolvidas no processo exocitótico e aumento da expressão e atividade dos KATP. O grupo RH, com resistência à insulina similar ao grupo CH, não apresenta a mesma adaptação funcional das células ?, sem hipersecreção nesse grupo. A melhora na capacidade secretória do grupo RHT pode decorrer da ação da Tau sobre os KATP contribuindo para o adequado acoplamento estímulo/secreção e a extrusão dos grânulos de insulina via sintaxina Abstract: In ? cells stimulus/secretion coupling, ATP-sensitive K+ channels (KATP) and voltage-sensitive Ca2+ channel (Cav) contribute to generating and sustaining the potential action. Changes in the expression or activity of these channels lead to insulin secretion impairment. Protein restriction as well as high-fat diet alters ?-cells ionic handling modifying insulin secretory profile. Taurine (Tau) regulates ion flux and improves ?-cell function. The aim of this study was to characterize the expression and function of KATP and Cav channels, as well as exocitotic proteins in isolated islets from malnourished mice submitted to high-fat diet and supplemented with Tau. Male C57Bl/6J mice received control (14% protein-C) or low-protein diet (6% protein-R) for 6 weeks. After, half of these groups were submitted to high-fat diet for 8 weeks without (CH and RH) or combined with 5% of Tau (CHT and RHT). Protein restricted mice showed lower growth and organs development. Both, CH and RH mice presented higher body weight, fat stores, hypercholesterolemia, glucose intolerance and insulin resistance. Tau supplementation prevented fat accumulation and glucose intolerance only in CHT group. Isolated islets from malnourished mice secreted less insulin in response to 2.8 mM glucose in combination with 30 mM K + or 100 ?M tolbutamide (Tolb). However, Ca2+ influx in these conditions did not differ. R group also released less insulin in response to 11.1 mM glucose in combination or not with depolarizing agents. In addition, R islets showed lower insulin and SNAP-25 protein content, whereas an increased protein expression of the Kir6.2 subunit of the KATP channel, as well as its activation during glucose stimulus. However, CH islets presented increased hormone release in the presence of 11.1 mM glucose in combination or not with depolaring agents, effect associated with enhanced KATP inhibition and Cav activation in response to glucose. RH group showed a lower insulin secretion in response to 2.8 mM glucose plus K+, and a similar secretion to C group upon 11.1 mM glucose together or not with depolarizing agents. Also, RH islets showed increased SNAP-25 protein levels. In CHT islets, Tau supplementation normalized insulin release and increased protein amount of ?1.2 and ?2 subunits of the Cav without modify its activity, and enhanced islet SNAP-25 and syntaxin protein levels. But, in RHT islets, enhanced insulin secretion in response to glucose and depolarizing agents, and increased syntaxin and Kir6.2 protein expression. In addition, RHT islets showed improved KATP inhibition and Cav activation in the presence of the sugar. In conclusion, insulin secretory dysfunction in R islets was associated with the lower expression of the exocytotic proteins and altered protein expression and activity of the KATP . Whereas, despite RH mice showed insulin resistance in a similar extent of that observed in CH mice, they did not present ?-cells functional adaptations to this condition, since RH islets did not hypersecret insulin. In addition, RHT islets presented a better secretory capacity probably due to the higher content of KATP and it inhibition induced by Tau which contributes to enhance the insulin exocytosis via syntaxin protein Mestrado Fisiologia Mestre em Biologia Funcional e Molecular

Orientadores: Dora Maria Grassi-Kassisse, Regina Celia Spadari-Bratfisch Tese (doutorado) - Universidade Estadual de Campinas, Instituto de Biologia Resumo: A literatura é escassa quanto à modelos de estresse relacionados ao estudo da utilização periférica de glicose, com o objetivo de compreender os mecanismos através dos quais a situação de estresse possa levar a resistência à insulina. Nosso modelo de estresse induzido por choques nas patas aplicados em três dias consecutivos em ratos apresenta um quadro metabólico bastante semelhante àquele apresentado em quadros iniciais de diabetes tipo 2, tornando-se fundamental o estudo da captação de glicose pelos tecidos neste modelo animal. Considerando que o modelo de estresse por choque nas patas promove alterações fisiológicas que têm repercussões endócrinas e metabólicas possíveis de serem demonstradas in vivo e in vitro, os objetivos deste trabalho foram investigar a captação periférica de glicose em ratos estressados utilizando as técnicas de ivGTT, clamp euglicêmico-hiperinsulinêmico e captação de glicose em adipócitos isolados. Nossos resultados demonstraram que: a captação de glicose pelos adipócitos isolados de ratos estressados está menos sensível a insulina e mais sensível a noradrenalina quando comparado aos adipócitos de ratos controle; a estimulação adrenérgica da captação de glicose é principalmente mediada pelo a1-AR; a estimulação do ß2-AR não teve efeito em adipócitos de ratos controle, mas inibiu significativamente a captação de glicose pelos adipócitos isolados de ratos estressados, que pode ser uma troca da via de sinalização Gs para Gi; os adipócitos isolados de tecido adiposo epididimal de ratos estressados não apresentam alteração na produção de lactato basal e nem estimulada quando comparado aos provenientes de ratos controle; os adrenoceptores do subtipo a1 estão envolvidos na captação de glicose in vivo demonstrada pelos ensaios de ivGTT; o modelo de choque nas patas alterou a sensibilidade dos receptores de insulina, avaliada pelo ensaio de clamp euglicêmico-hiperglicêmico apenas em parte da população estudada. Este conjunto de dados permite concluir que a indução de estresse por choques nas patas causa alterações na captação periférica de glicose, principalmente através da sinalização adrenérgica, que caracterizam este modelo como uma importante ferramenta para o estudo de alterações metabólicas induzidas pelo estresse Abstract: There are few animal models to study the peripheral glucose uptake alterations induced by stress. Rat foot-shock stress model induces metabolic alterations similar to diabetes type 2. Considering that rat foot-shock stress model causes physiological alterations which are possible to be studied carrying out experiments in vivo or in vitro we claim in this work evaluate glucose uptake in stressed rats throughout ivGTT, clamp euglycemic-hyperinsulemic, glucose uptake and lactate production in isolated adipocytes. Our results show that: glucose uptake by isolated stressed rat adipocytes is decreased by insulin and increased by a1-AR agonists; besides ß2-AR stimulation significantly inhibit glucose uptake induced by a1-AR; there is no alteration in lactate production by isolated adipocytes rats; a1-ARs are involved in glucose uptake demonstrated in ivGTT assays; sensitivity to insulin receptors were decreased in some rats when available by clamp assays. All these results together suggested that stress induced by foot-shock in rats induces alterations in glucose uptake, mainly throughout adrenergic mechanisms, and this model could be very useful as a tool to study metabolic alterations during stress response Doutorado Fisiologia Doutor em Biologia Funcional e Molecular

Orientador: Marcio Alberto Torsoni Tese (doutorado) - Universidade Estadual de Campinas, Instituto de Biologia Resumo: O hipotálamo desempenha importante papel na manutenção da homeostase da glicose. Robustos sinais originados pela leptina e insulina agem coordenando a ingestão alimentar, o gasto energético e o metabolismo periférico. No hipotálamo e nos tecidos periféricos, a AMPK é um sensor energético que regula o metabolismo celular através do controle entre a produção e consumo de ATP. Ela é inibida em resposta à insulina, leptina e na presença de disponibilidade de nutrientes. O citrato é conhecido como um modulador de algumas enzimas, como a fosfofrutoquinase e acetil-CoA carboxilase. Neste estudo a hipótese do citrato modular enzimas relacionadas com controle da saciedade e do metabolismo periférico foi testada. Primeiramente, foi mostrado que o citrato intracerebrbventricular inibe a fosforilação do sistema AMPK/ACC, diminuie a ingestão alimentar, promove a perda de peso, aumenta a expressão de neuropeptídeos anorexigênicos (POMC e CRH) e diminuiu o tecido adiposo epididimal e perirenal. O clearance da glicose avaliado pelo clamp euglicêmicohiperinsulinêmico e GTT foi maior em animais tratados previamente com citrato, bem como ocorreu maior captação de glicose pelo adiposo e pelo músculo esquelético. Corroborando com o efeito do citrato na homeostase da glicose, a fosforilação de IR, IRS1, IRS2 e AKt avaliada por imunoblotting foi maior, em ambos os tecidos, nos animais que receberam previamente o citrato via ICV. A translocação do GLUT para a membrana plasmática também foi potencializada pelo tratamento prévio com citrato via ICV, tanto no tecido adiposo epididimal como no tecido muscular. Por outro lado, a AMPK no músculo esquelético e no adiposo não foi ativada por citrato ICV, descartando seu efeito na captação de glicose. Nós concluímos que o citrato pode participar com um indicador do estado energético nos neurônios e, portanto, modular o comportamento alimentar, captação de glicose e metabolismo periférico Abstract: Hypothalamic neurons display important role in the glucose homeostase. Robust signals from leptin and insulin act coordinating the food intake, energy expenditure and peripheral metabolism. In the hypothalamus and peripheral tissue the AMPK is an energy sensor that regulates cellular metabolism through its sensitivity to the cellular energy status. It is inhibited in response to insulin, leptin and nutrients availability. The citrate is well known as a modulator of some enzymes, such as phosphofructokinase and acetyl-CoA carboxilase. Here, we hypothesized that citrate participates of neuronal feeding control and glucose homeostasis. Firstly, we show that intracerebroventricular citrate inhibits AMPKlACC phosphorylation. In addition, we show that citrate also decreases food intake; promotes weight loss, increases the expression ofanorexigenic neuropeptides (POMC and CRH) and increases the epididymal fat pad andperirenal adipose tissue. Glucose clearance evaluated by hyperinsulinemic-euglycemic clamp and GTT was increased in animais treated previously with citrate, as well as adipose and skeletal muscle tissue glucose uptake. Corroborating the effect of the citrate on the glucose homeostase, IR, IRS2, IRS1 and AKt phosphorylation evaluated by immunoblotting was improved by citrate treatment in both tissues, as well as GLUT 4 location in thl~ membrane compartment. On the other hand, AMPK in the skeletal muscle anej adipose tissue was not activated by citratelCV injection discarding their effect on the glucose uptake. We concluded that citrate could be an indicator regarding to energy status of the neuron. This in turn changes the neuropeptides expression to modulate feeding behavior, glucose uptake and peripheral metabolism Doutorado Bioquímica Doutor em Biologia Funcional e Molecular

Orientador: Marcelo Lancellotti Dissertação (mestrado) - Universidade Estadual de Campinas, Instituto de Biologia Resumo: Em 1998, foi relatada a transferência lateral do gene sodC do gênero Haemophilus para a espécie Neisseria meningitidis. Sabe-se que, nestes dois grupos a dinâmica deste gene é bastante distinta. Este trabalho tem por objetivo estimar árvores filogenéticas que possam apontar qual a espécie do gênero Haemophilus compartilhou o gene sodC com a espécie N. meningitidis. Testes de seleção positiva foram empregados no intuito de avaliar quais forças evolutivas estão subjacentes ao processo de diversificação molecular do gene nestas espécies ao longo do tempo. Além disso, foi realizada uma modelagem protéica computacional por homogia para avaliar quais substituições de aminoácidos tinham impacto no processo adaptativo da enzima nas espécies consideradas. Ao se reconstruir uma filogenia para o gene sodC, foi constatado que a origem deste gene na espécie H. influenzae é distinta. Um grupo de linhagens recebeu o gene, provavelmente por transferência lateral, da espécie H. haemolyticus, enquanto o outro grupo recebeu o gene da espécie H. parainfluenzae. Neste grupo, o gene sofreu pseudogeneização. Foi observado também que as sequências de N. meningitidis agrupam com as sequências que compartilham um ancestral comum com a espécie H. haemolyticus, porém as sequências do meningococo formam um ramo distinto dentro deste clado. Dada à alta clonalidade das sequências de N. meningitidis, foi constatado que o evento de transferência lateral de genes foi muito recente na escala do tempo. O teste de seleção positiva demonstrou que seleção positiva está atuando especificamente no ramo da árvore que compartilha um ancestral comum com a espécie H. haemolyticus, através da modificação de uma alanina por uma serina na posição 72, embora a nota geral da árvore tenha sido menor que 1. Sabe-se que pseudogenes, por não codificarem uma proteína ativa e, portanto, por não estarem sob nenhum tipo de restrição funcional, estão sob uma ação maior da deriva genética. Portanto, diferentes forças evolutivas estão governando a evolução deste gene nas espécies consideradas. A modelagem protéica concluiu que tal modificação contribuiu para o aumento do potencial redox do sítio ativo. Desta forma, a ação da seleção positiva sob um único resíduo de aminoácido foi benéfica para a função da enzima como um todo Abstract: In 1998, it was reported the lateral transfer of the sodC gene from the genus Haemophilus to Neisseria meningitidis. It is known that this two groups show a quite distinct dynamics of this gene. This study aims to estimate phylogenetic trees that might point to which species of the genus Haemophilus shared the sodC gene with N. meningitidis. In addition, tests of positive selection were employed in order to assess which evolutionary forces are governing the process of molecular diversification of the gene in these species through time. Moreover, we performed a computational protein modeling by homology to asses which amino acids substitutions had an impact on the adaptative process of the enzyme in the species considered. A phylogeny of the sodC gene was reconstructed and it was found that this gene in H. influenzae has two different origins. A group of lineages has received the gene, probably by lateral transfer, from H. haemolyticus, whereas the other group has received the gene from H. parainfluenzae. In the latter, the gene has become a pseudogene. It was also observed that the sequences from N. meningitides group together with those sequences that share a common ancestor with H. haemolyticus, but they form a distinct branch within this clade. Given the high clonality of the sequences from N. meningitidis, it was found that the lateral gene transfer event is very recent in the time scale. A test of positive selection showed that positive selection is acting specifically in the branch that shares a common ancestor with H. haemolyticus through the substitution of an alanine to a serine at position 72, though the overall score of the tree is less than one. It is known that pseudogenes do not encode active proteins and therefore they are not under any kind of functional constraints, so they are under greater influence of genetic drift. Thus, it was concluded that different forces are driving the evolution of this gene in the species considered here. Protein modeling concluded that this modification contributed to the increase in the redox potencial of the active site. Thus the action of positive selection under a single amino acid residue was beneficial to the function of the enzyme as whole Mestrado Bioquímica Mestra em Biologia Funcional e Molecular

Orientadores: Stephen Hyslop, Carla Beatriz Collares-Buzato Tese (doutorado) - Universidade Estadual de Campinas, Instituto de Biologia Resumo: As peçonhas de serpentes Bothrops são responsáveis por diversos danos locais (na região da mordida) e sistêmicos durante o envenenamento. Dentre as manifestações sistêmicas, a insuficiência renal aguda e um dos mais importantes efeitos tóxicos causados por acidentes botropicos. Esta tese teve como objetivos: 1) investigar a ação da peçonha bruta de B. alternatus em células epiteliais renais MDCK; 2) proceder a purificação e caracterização de uma DNase acida presente nesta peçonha; e 3) determinar a possível ação apoptotica desta DNase sobre células MDCK em cultura. Com relação as ações in vitro do peçonha bruta de B. alternatus, observamos modificações no citoesqueleto, nas junções intercelulares e sobre a morte celular das células MDCK tratadas com 10 ou 100 µg/mL de peçonha bruta. Dentre as modificações observadas, houve uma diminuição da resistência transpitelial, uma redistribuição de algumas proteínas associadas as junções intercelulares acompanhada por um desarranjo do citoesqueleto envolvendo as fibras de estresse na superfície basal e adesão focal associada a F-actina na região de contato celula-matriz. A analise morfometrica mostrou uma diminuição do numero de células entrando em mitose e um aumento do numero de células com núcleos picnoticos ou morfologicamente alterados apos tratamento com o peçonha. Microscopia eletrônica de varredura revelou uma densidade de microvilosidades diminuída, assim como a alteração da morfologia celular normal, de poliédrico para um formato fusiforme, nas células tratadas. O tipo principal de morte celular induzido pelo tratamento com o peçonha bruta foi a necrose, com uma freqüência pequena de indução de apoptose. O pré-tratamento das células MDCK com catalase, superoxido dismutase e L-NAME inibiu os efeitos sobre morte celular causados pelo peçonha bruta, indicando o envolvimento de espécies reativas de oxigênio e nitrogênio nos danos causados pelo envenenamento pela peçonha de B. alternatus. As peçonhas ofídicas possuem uma grande variedade de enzimas que degradam ácidos nucléicos e seus constituintes. As desoxirribonucleases (DNases) são endonucleases presentes em peçonhas de serpentes que hidrolisam acido desoxirribonucleico (DNA). Sua ação no envenenamento ocorre em conjunto com outras enzimas que quebram ligações fosfato (ATPases, 5¿-nucleotidases, fosfodiesterases, ribonucleases). Vários estudos sobre endonucleases em mamiferos sugerem que a DNase II (DNase acida) seria responsável pela fragmentacao do DNA durante a apoptose. E também conhecido que peçonhas são capazes de induzir apoptose em células. Através de uma combinação de cromatografias de troca iônica, gel filtração, afinidade e HPLC, foi purificada uma DNase da peçonha de B. alternatus, com atividade especifica de 3.489 unidades/mg (atividade especifica da peçonha: 65 unidades/mg) e fator de purificação de ~54 vezes. As características bioquímicas desta enzima são: uma massa molecular de ~31 kDa, ausência de subunidades, pI de 4,4-5,2, pH otimo de atividade de 4,7, termo estabilidade ate 40oC. O Km e Vmax são 10.1 µg/mL e 352.5 U/mg, respectivamente. A enzima degrada preferencialmente DNA de dupla fita, com atividade menor sobre DNA desnaturado; também degrada DNA circular (dos plasmideos pGEM e pBR322) mas não degrada RNA ou poly A. E inibida por altas concentrações (100 mM) de cations (Ca2+, Mg2+ e Zn2+), e também por N-etilmaleimida, iodoacetamida, acido aurintricarboxilico e DTT, mas não por EDTA. A enzima e reconhecida por IgG antibotropica em Western blot e no ELISA e por anti-DNase II humana no Western blot. Em celulas MDCK, a DNase produz alterações morfologicas como vacuolacão do citoplasma, retração e destacamento das celulas em monocamada, presença de núcleos condensados e/ou fragmentados. Através de ensaios de viabilidade e citotoxicidade, verificamos que a DNase e citotoxica as células MDCK em doses a partir de 400 U/mL (~20 µg/mL). Alem disso, causa fragmentação de DNA e um aumento no numero de células apoptoticas, em menor proporção, de células em necrose. A via de apoptose estimulada pela enzima envolve a ativação das caspases 3, 8 e 9, e uma diminuição na expressão da proteína anti-apoptotica Bcl-2. Estes resultados mostram que a peçonha de B. alternatus e citotoxica as células MDCK, com parte desta toxicidade mediada pela DNase II. Esta enzima induz apoptose que poderia contribuir para a toxicidade geral da peçonha Abstract: Bothrops snake venoms are cytotoxic to a variety of cells (endothelial, smooth muscle, renal and inflammatory cells), and may cause cell death by apoptosis. The venom components implicated in apoptosis include metalloproteinases and L-amino acid oxidase. In contrast, although acidic deoxyribonucleases (DNase II) have been implicated in DNA fragmentation during apoptosis in mammals, nothing is known of the involvement of venom deoxyribonucleases in this phenomenon. In this thesis, we 1) investigated the cytotoxicity of Bothrops alternatus venom in Madin-Darby canine kidney (MDCK) epithelial cells, 2) purified and characterized an acidic DNase from this venom, and 3) assessed the apoptotic activity of this DNase in MDCK cells. Treatment with B. alternatus venom (10 and 100 µg/mL) markedly decreased the transepithelial electrical resistance of cultured cells, and caused redistribution of some junctional proteins followed by cytoskeletal rearrangement involving stress fibers at the basal cell surface and focal adhesion-associated F-actin in the cell-matrix contact region. There was a decrease in the number of mitotic cells and an increase in the number of cells with pycnotic or morphologically altered nuclei. Scanning electron microscopy revealed a decrease in microvillar density and alteration in the normal cell morphology from polyhedric to fusiform. Staining with annexin V-FITC and electrophorese of cellular DNA suggested that cell death was predominantly by necrosis. Pretreating the cells with catalase, superoxide dismutase or L-NAME significantly attenuated the venom-induced cell death, indicating the possible involvement of reactive oxygen and nitrogen species in this phenomenon. DNase II was purified from B. alternatus venom by a combination of ion exchange and gel filtration chromatographies (specific activity = 1.9x103 units/mg vs. 36.1 units/mg for venom, purification factor = 51.2, with a protein yield of 1.75%). The molecular mass of 26.4 kDa (SDS-PAGE) was unaffected by dithiothreitol or i-mercaptoethanol, indicating a single-chain protein. Immunoblotting with affinity-purified IgG from commercial bothropic antivenom also yielded a single protein band with the same molecular mass. The enzyme was also recognized by antibothropic IgG in ELISA and crossreacted with anti-human DNase II in western blots. The isoelectric point determined by 2Dgel electrophoresis was ~5.0. DNase II cleaved double-stranded DNA, denatured DNA and circular DNA (from the plasmids pGEM and pBR 322), but there was no degradation of RNA. The enzyme was active in the pH range of 4.5-5.5, with an optimum at 4.7; activity was lost at >50oC. The Km and Vmax were 10.1 µg/mL and 352.5 U/mg, respectively. Enzymatic activity was inhibited by aurintricarboxylic acid (25 µM), iodoacetamide (1 mM), DTT (1 mM) and Ca2+, Mg2+ and Zn2+ (100 mM), but not by EDTA (5 mM). In MDCK cells, DNase II produced cytoplasmic vacuolization, cell shrinkage and cell detachment from the substrate, as well as condensed and/or fragmented nuclei. DNase was cytotoxic to MDCK cells at > 400 U/mL (~20 µg/mL), caused DNA fragmentation, and increased the proportion of apoptotic cells. The apoptotic pathway stimulated by this enzyme involved the activation of caspases 3, 8 and 9, and a decrease in the expression of the anti-apoptotic protein Bcl2. These results show that B. alternatus venom is cytotoxic to MDCK cells, with part of this toxicity probably being mediated by DNase II. This enzyme induces apoptosis that could contribute to the general cytotoxicity of the venom Doutorado Bioquímica Doutor em Biologia Funcional e Molecular

Orientador: Antonio Ari Gonçalves Dissertação (mestrado) - Universidade Estadual de Campinas, Instituto de Biologia Resumo: A participação do sistema nervoso parassimpático na modulação da secreção de insulina manifesta-se claramente durante a fase cefálica a qual se segue ao estímulo iniciado pelo estímulo sensorial provocado pelo alimento na boca. O objetivo deste trabalho foi estudar os efeitos, a curto e médio prazo, que a vagotomia subdiafragmática seletiva do ramo pancreático poderia provocar na permeabilidade da membrana plasmática ao Ca2+. Para avaliar os efeitos da vagotomia usamos os secretagogos: glicose e arginina e a potencialização pela carbamilcolina sobre os efeitos de glicose. Adicionalmente estudamos os efeitos sistêmicos que esta desnervação poderia provocar sobre a tolerância à glicose e à insulina. Antes de avaliar os efeitos da vagotomia (após 8 e 30 dias) verificamos que a resposta característica da fase cefálica, estava ausente, resultando em aumento da glicemia ¿Observação: O resumo, na íntegra poderá ser visualizado no texto completo da tese digital Abstract: purpose of this work was to study the effects of pancreatic vagotomy on the systemic responses to glucose (GTT) , insulin (ITI), and on the B cell membrane permeability to Ca2+. The experiments were performed on vagotomized rats (pancreatic branch) after being checked for the absence of the cephalic phase of secretion, 8 or 30 days after surgery. In the absence of the parasympathetic control, the glycemia was not altered after 12 h fasting levels of (P>0,05). However, the handling of an overload of glucose (1g/kg of body weight) was affected by vagotomy ...Note: The complete abstract is available with the full electronic digital thesis or dissertations Mestrado Fisiologia Mestre em Biologia Funcional e Molecular

Orientador: : Leonardo Fernandes Fraceto Dissertação (mestrado) - Universidade Estadual de Campinas, Instituto de Biologia Resumo: A "Revolução Verde" ocorreu na década de 60 e previa o aumento da produção agrícola devido ao crescimento populacional, onde foi intensificado o estudo de novas tecnologias para o aumento da produção de alimentos e rentabilidade dos agricultores. Entre as várias tecnologias, destacou-se a utilização de defensivos agrícolas no controle, prevenção e na eliminação de doenças que interferem na produtividade agrícola. O uso de nanopartículas (NPs) para o carreamento de compostos bioativos para liberação sustentada aumenta o tempo de ação e estabilidade química do ativo no meio, bem como a disponibilidade para ação junto ao organismo alvo. Na agricultura, o uso de NPs visa reduzir a concentração efetiva do ativo a ser utilizado, reduzir de aplicações, reduzir a toxicidade, diminuir a periculosidade e os riscos de contaminação ambiental. O presente trabalho propôs o desenvolvimento de NPs poliméricas de poli-épsilon caprolactona (PCL) como sis-temas carreadores para o herbicida atrazina (ATZ) bem como a avaliação das características físico-químicas destes sistemas, a atividade herbicida e a genotoxicidade das formulações preparadas. As nanocápsulas (NCs/ATZ) e as nanoesferas (NEs/ATZ) contendo ATZ apresentaram diâmetro médio de 483,1 ± 10,4 nm e 408,5 ± 2,5 nm, respectivamente. A ATZ apresentou uma eficiência de encapsulação acima de 90% para as formulações de NE e NC e foram observadas alterações no perfil de liberação da ATZ em comparação com o herbicida ATZ. A estabilidade coloidal e físico-química das formulações foi mantida por um período de 90 dias. O uso de NPs aumentou a retenção da ATZ em ensaios com coluna de solo, sendo que a atividade herbicida se mostrou mais eficaz quando comparada ao ativo ATZ apenas e ao de uma formulação comercial (Gesaprin). A investigação da genotoxicidade das formulações, utilizando o ensaio de aberração cromossômica Allium cepa, mostrou que a encapsulação da ATZ reduziu os efeitos sobre o número de aberrações cromossômicas quando comparadas ao ativo ATZ e à formulação comercial. As formulações de NPs contendo ATZ preparadas neste trabalho apresentam grande potencial para aplicação na agricultura, uma vez que estas podem ter ação herbicida utilizando menor concentração de ativo, reduzem a mobilidade da ATZ no solo e diminuem os efeitos genotóxicos, tornando-se mais seguras ao meio ambiente e reduzindo os riscos de contaminação Abstract: The "Green Revolution" occurred during the decade of 60 and it aimed towards the rapid increase on agriculture production due to population growth, when was intensified the research and development to increase agriculture production and profitability. Among several technologies, herbicides and pesticides have emerged to control, prevent and destroy diseases that interfere in the agricultural productivity. The use of nanoparticles (NPs), as drug delivery system loads to modified drug release profile, increase time of action and increased chemical stability is wells is increase in bioavailability. In agriculture the use of NPs can reduces the amount of chemical used and the number of applications with decrease in toxicity, minimizing the risks of an environmental contamination. This study aims to develop NPs pre-pared with poly-épsilon-caprolactone (PCL) as a carrier system for the herbicide atrazine (ATZ). The formulations were characterized and the herbicide activity and genotoxicity were investigated. The nanocapsules (NCs/ATZ) and nanospheres (NE/ATZ) containing ATZ showed a size average diameter of 483.1±10.4 nm and 408.5±2.5 nm respectively. The ATZ presented encapsulation efficiency over 90% on formulations of NC and NE. The release profiles of the ATZ encapsulated in NPs were changed in relation to the ATZ herbicide only. The colloidal stability over 90 days showed that the formulations were stable. The use of NPs increased the retention of ATZ on soil column and showing that the herbicide was more active when compared to ATZ or a commercial formulation (Gesaprin). The genotoxicity evaluation showed that the encapsulation of ATZ reduced the toxic effects on the number of chromosomal aberration when compared to active ATZ and commercial formulation. NPs formulation containing ATZ prepared in this study presented a great potential for application in agriculture, since these formulations have the same herbicide activity (using lower concentration of active compound), reduce the ATZ soil mobility and also decrease the genotoxicity effects of ATZ, and in this way, reducing the risks of environmental contamination Mestrado Bioquímica Mestre em Biologia Funcional e Molecular

Orientador: Fernanda Klein Marcondes Tese (doutorado) - Universidade Estadual de Campinas, Instituto de Biologia Resumo: Altas doses de esteróides anabólicos androgênicos (EAA) são utilizadas, sem indicação terapêutica, por indivíduos que visam aumentar a força muscular ou melhorar a aparência física. Entretanto, os efeitos benéficos destas substâncias sobre o desempenho atlético são questionáveis, e sabe-se que esta prática é acompanhada de muitos efeitos colaterais. Como os efeitos dos EAA sobre o sistema cardiovascular ainda não estão esclarecidos, o objetivo do presente estudo foi avaliar a influência da nandrolona e do treinamento físico resistido sobre a função cardíaca de ratos Wistar machos, de 2 meses de idade, divididos em quatro grupos experimentais: sedentário + veículo (SV); treinado + veículo (TV); sedentário + EAA (SEAA); treinado + EAA (TEAA). Os animais foram tratados, por 6 semanas, com veículo (propilenoglicol, 0,2 mL/Kg) ou decanoato de nandrolona (Deca-Durabolin®, 5 mg/ Kg), i.m., 2 x/ semana. O treinamento físico foi realizado através de saltos em meio líquido (4 séries, 10 repetições, 30 segundos de intervalo entre as séries), 50-70% do peso corporal, 5 dias/semana, 6 semanas. Ao final do período experimental, os ratos foram sacrificados, o átrio direito foi isolado para obtenção de curvas concentração-efeito às catecolaminas in vitro e o ventrículo esquerdo (VE) foi analisado para quantificação de colágeno (n = 5- 10/grupo). Outros animais, submetidos aos mesmos tratamentos, foram anestesiados e submetidos a ecodopplercardiograma (n=7-10/grupo). Os dados foram analisados por Análise de Variância Bifatorial e teste de Tukey (p SEAA:184±18 = TEAA:151±14 mL/min/g) e aumentou o conteúdo de colágeno no coração (SV:2,93±0,22 = TV:6,48±1,01 Abstract: High doses of anabolic androgenic steroids (AAS) are used without therapeutic indication in order to increase the muscle power or improve the physical appearance. However the beneficial effects of AAS on the athletic performance are still questionable and it is well established that AAS abuse is associated with many detrimental side-effects. Since the sideeffects of AAS on the cardiovascular system are not well understood, the aim of this study was to evaluate the influence of nandrolone and resistance physical training on the cardiac function in male Wistar rats divided into 4 groups: sedentary + vehicle (SV), trained + vehicle (TV), sedentary + AAS (SAAS) and trained + AAS (TAAS). The animals were treated for 6 weeks with vehicle (propyleneglycol, 0.2 mL/Kg) or nandrolone decanoate (Deca-Durabolin, 5 mg/Kg), i.m., 2x/ week. Training was performed by jumping into water (4 sets, 10 repetitions, 30 seconds rest), 50-70% body weight-load, 5 days/week, 6 weeks). At the end of experimental period, the rats were sacrificed, right atria was isolated to obtained in vitro concentration-effect curves (CEC) to catecholamines and left ventricle (LV) was analyzed for collagen quantification (n=5-10/group). Other rats, submitted to the same treatments were anesthetized and submitted to echodopplercardiography (n=7- 10/group). Data were compared by two-way ANOVA and Tukey test (p SAAS:184±18 = TAAS:151±14 mL/min/g) and increased cardiac collagen content (SV:2.93±0.22 = TV:6.48±1.01 Doutorado Fisiologia Doutor em Biologia Funcional e Molecular

Orientador: Denise Vaz de Macedo Dissertação (mestrado) - Universidade Estadual de Campinas, Instituto de Biologia Resumo: Os objetivos deste estudo foram: i) estabelecer intervalos de referência para parâmetros hematológicos em uma população fisicamente ativa (3 h de atividade diária). Um sub­grupo de sujeitos dessa população, submetidos a um treinamento com características aeróbicas foi monitorado mensalmente nesses parâmetros hematológicos. O treinamento de três meses foi planejado objetivando a realização de um teste de aptidão física com índice eliminatório; ii) comparar parâmetros hematológicos e bioquímicos em amostras de sangue coletadas por punção digital e punção venosa em um grupo de atletas. Participaram do primeiro estudo 182 jovens do sexo masculino (17-19 anos), no primeiro estágio de preparação escolar e física para a carreira militar do Exército. Participaram do segundo estudo 21 atletas de modalidades diferentes (handebol feminino e futsal masculino). Os resultados apresentados no primeiro estudo mostraram que os intervalos de referência foram ligeiramente diferentes dos relatados na literatura, com faixas mais estreitas e valores superiores mais altos. Os resultados mostraram também uma melhora significativa no eritrograma já no primeiro mês de treinamento, com manutenção dê valores mais altos nos meses subseqüentes. Os leucócitos elevaram-se na primeira e segunda coletas, embora dentro dos intervalos de referência estabelecidos, retomando para valores próximos ao basal no último mês de treinamento. A comparação de parâmetros bioquímicos e hematológicos por punção venosa e punção digital, apresentada no segundo estudo, mostrou que embora tenham sido observadas diferenças estatisticamente significativas em alguns parâmetros, os valores de todos os parâmetros analisados apresentaram alta correlação entre as duas formas de coleta, se situando dentro da faixa de referência. Esses dados confirmam que a punção digital pode ser utilizada em substituição à punção venosa, desde que todas as amostras sejam provenientes de um único tipo de coleta ao longo dos estudos, principalmente os longitudinais Abstract: The present study was designed: i) to establish reference intervals for different hematological parameters in a physically active population (3 h activity/day) and to folJow, monthly, the effect of a training with aerobic characteristics, looking forward the design of a eliminatory physical test, in a sub-group of this population; ii) to compare biochemical and hematological parameters, in blood collected from skin puncture and venous puncture in a group of athletes. One Hundred and eighty two young mal e (17-19 years), in the first period of training to enter The Army career, have participated in the first study. Twenty one athletes of different modalities (female handball and male futsal) had participated in the second study. The results presented in the first study showed reference intervals slightly different from those in the literature, with narrower intervals and higher maximum values. The results had also shown a significant increase in the number of the red blood cells in the first month of training, with high values maintened in the subsequent months. The leukocytes had raised in the first and the second collections, inside the established intervals of reference, returning to basal values in the last month of training. The comparison of biochemical and hematological parameters for venous and digital puncture presented in the second study, exhibited significant difference in some parameters, although a high degree of correlation was observed between the two techniques for ali parameters, which had within the normal expected range. These data confirm that skin puncture can be used in place of venous punction, as far as blood collection were conducted in the same way along the study, mainly in the longitudinal ones. For being a less invasive technique, digital punction facilitates the longitudinal study in sport teams through these hematological and biochemical analyses Mestrado Bioquímica Mestre em Biologia Funcional e Molecular

Orientador : Gil Martins Felippe Dissertação (mestrado) - Universidade Estadual de Campinas, Instituto de Biologia Resumo: Foi acompanhado o crescimento de milho de três culturas realizadas em 1979, 1980 e 1981. Observou-se que durante estes três anos houve uma variação no tempo de duração do ciclo do milho. Esta variação deve ter sido devido às diferentes condições climáticas presentes em cada ano. As características morfológicas das plantas de milho, bem como as práticas utilizadas no seu cultivo (espaçamento), permitem que haja incidência de luz solar direta no interior da campo, mesmo quando totalmente desenvolvido. Isto facilita muito a germinação das sementes e o desenvolvimento das plântulas de ervas invasoras. Durante os três anos foram observadas a época de aparecimento das plântulas de ervas invasoras bem como o local onde apareciam, isto é, se ocorriam no interior ou nas margens do campo ou ocorriam indiferentemente. A maioria das espécies apareceu tanto no interior como nas margens do campo. Poucas espécies apareceram sempre em um mesmo local. Com isto pode ser feito um levantamento das espécies invasoras que ocorriam no campo de cultura. Foi constatada então a presença de um total de 48 espécies, sendo que apareceram 30 em 1989, 38 em 1980 e 43 em 1981, a maioria repetindo-se durante os três anos. ...Observação: O resumo, na íntegra, poderá ser visualizado no texto completo da tese digital Abstract: Not informed. Mestrado Fisiologia Mestre em Biologia Funcional e Molecular