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Utilisation de la spectrophotométrie UV-visible pour le dosage quantitatif des glucides et des protéines

This study is about the electrostatic and structural properties of proteins diffracting at high X-ray resolution. Two different aspects are tackled which are 1) the analysis of properties derived from their charge distribution, parting from a fundamental point of view and 2) the application of methods used in high resolution macromolecular crystallography to two enzymes of major interest.After the analysis of the structure and electrostatic properties of PfluDING protein, the binding mode of a phosphate ion, located in the active site, was elucidated at two different pH values. Particularly, this study demonstrates that a diffuse hydrogen bond assures the protonation state of the phosphate ion, which is thus identical at each pH value. The second enzyme studied is the proteine DFPase which is capable of hydrolysing nerve agents. A high resolution X-ray structure and a medium resolution neutron structure where compared. The analysis points out the differences between the two models and a new catalytic mechanism could be proposed.The more fundamental aspects of this study are about the secondary structural elements of proteins: their electrostatic properties in terms of electrostatic moments (dipole and quadrupole moments of helices and sheets) as well as the hydrogen bond network assuring the cohesion of helices have been analyzed. It has been shown that certain interactions between peptide units within helices, represented usually as hydrogen bonds, should actually be considered as pure electrostatic contacts; Cette étude est consacrée à l'analyse des propriétés électrostatiques et structurales des protéines diffractant à haute résolution. Les travaux se déclinent en deux aspects principaux qui sont, d'une part, l'analyse d'un point de vue fondamental des propriétés dérivées de leur distribution de charge des structures des protéines, et, d'autre part, l'application pratique des méthodes de la cristallographie haute résolution des macromolécules à deux enzymes.Grâce à une analyse structurale et électrostatique de la protéine PfluDING, le mode de fixation du phosphate a été mis en évidence à deux pH différents. En particulier, cette étude a permis de démontrer la présence d'une liaison hydrogène diffuse assurant un mode de fixation identique quelque soit le pH. La seconde enzyme étudiée est la protéine DFPase, capable de dégrader les organophosphorés. La structure de la DFPase obtenue par diffraction X haute résolution et la structure affinée contre des données neutroniques ont été comparées. L'analyse pointe les différences d'interprétation des deux modèles, et permet de proposer un nouveau mécanisme d'action.Les aspects plus fondamentaux de cette étude portent sur les éléments de structure secondaire des protéines : leurs propriétés électrostatiques en termes de moments électriques (moments dipolaires et quadripolaires des hélices et des feuillets), et le réseau des interactions (dont les liaisons H) assurant la cohésion des hélices ont été analysés. Il a été démontré comment certaines interactions entre liaisons peptidiques au sein d'hélices, classiquement représentées comme des liaisons hydrogène, devaient être considérés comme des contacts purement électrostatiques

The Neisseria gonorrhoeae and Neisseria meningitidis species are human obligatory pathogenic bacteria, which acquired various defense mechanisms to detect and fight oxidative stress generated by mechanisms of host defense during infection. The periplasmic PilB protein, specific to these bacteria, would be part of such mechanisms and would be associated with their pathogenicity. PilB is composed of three domains: an N-terminal domain (Nter) with disulfide oxidoreductase activity, and central and C-terminal domains with Methionine sulfoxide reductase activity (Msr) of A and B class respectively. The study of isolated domains of PilB showed that the Nter domain selectively reduced MsrB domain. Moreover, this Nter domain presents a DsbE-fold. The DsbE are periplasmic disulfide oxidoreductases involved in the maturation of cytochrome c. In particular, Dr. Adeline Gand identified the DsbE1 from N. meningitidis during his PhD. During my PhD, the study of PilB proteins from N. meningitidis and Fusobacterium nucleatum allowed me to show that: 1) the selective reduction of Nter domain for the MsrB domain is not conserved, 2) the selective reduction of Nter domains observed on the isolated domains is not found in entire PilB, and 3) in all PilB, the MsrB domain reduction by Nter domain could be an intramolecular mechanism. Moreover, we studied the in vivo effect of the pilB gene deletion on the survival of a strain of N. meningitidis in the presence of oxidants. And, the N-terminal domain of DsbD protein (nDsbD) from N. meningitidis was identified as the reducing partner of periplasmic PilB and DsbE1 of N. meningitidis. Finally, the characterization of apocytochrome c reductase activity of DsbE1 N. meningitidis was complemented by in vitro and in vivo approaches in N. meningitidis; Les espèces Neisseria gonorrhoeae et Neisseria meningitidis, sont des bactéries pathogènes obligatoires de l'Homme, qui ont acquis différents mécanismes de défense pour détecter et combattre le stress oxydant généré par les mécanismes de défense de l'hôte lors de l'infection. La protéine PilB périplasmique, ferait partie de ces mécanismes et serait de ce fait associée à leur pathogénicité. PilB est composée de trois domaines : un domaine N-terminal (Nter) à activité disulfure oxydoréductase, et les domaines central et C-terminal à activité Méthionine Sulfoxyde Réductase (Msr) respectivement de classe A et B. L'étude des domaines isolés de PilB avait montré que le domaine Nter réduit sélectivement le domaine MsrB. Par ailleurs, le domaine Nter présente un repliement de type DsbE. Les DsbE sont des disulfure oxydoréductases périplasmiques impliquées dans la maturation des cytochromes c. En particulier, la DsbE1 de N. meningitidis a été identifiée par le Dr Adeline Gand lors de son doctorat.Lors de ma thèse, l'étude des protéines PilB de N. meningitidis et de Fusobacterium nucleatum m'a permis de montrer que : 1) la sélectivité de réduction du domaine Nter pour le domaine MsrB n'est pas conservée, 2) la sélectivité de réduction des domaines Nter observée sur les domaines isolés n'est pas retrouvée sur les PilB entiers ; et 3) dans tous les PilB, la réduction du domaine MsrB par le domaine Nter peut se faire selon un mécanisme intramoléculaire. De plus, nous avons étudié in vivo l'effet de la délétion du gène pilB sur la survie d'une souche de N. meningitidis en présence d'agents oxydants. D'autre part, le domaine N-terminal de la protéine DsbD (nDsbD) de N. meningitidis a été identifié comme étant le réducteur périplasmique de PilB et de la DsbE1 de N. meningitidis. Enfin, la caractérisation de l'activité apocytochrome c réductase de la DsbE1 de N. meningitidis a été complétée par des approches in vitro et in vivo chez N. meningitidis

The Neisseria gonorrhoeae and Neisseria meningitidis species are human obligatory pathogenic bacteria, which acquired various defense mechanisms to detect and fight oxidative stress generated by mechanisms of host defense during infection. The periplasmic PilB protein, specific to these bacteria, would be part of such mechanisms and would be associated with their pathogenicity. PilB is composed of three domains: an N-terminal domain (Nter) with disulfide oxidoreductase activity, and central and C-terminal domains with Methionine sulfoxide reductase activity (Msr) of A and B class respectively. The study of isolated domains of PilB showed that the Nter domain selectively reduced MsrB domain. Moreover, this Nter domain presents a DsbE-fold. The DsbE are periplasmic disulfide oxidoreductases involved in the maturation of cytochrome c. In particular, Dr. Adeline Gand identified the DsbE1 from N. meningitidis during his PhD. During my PhD, the study of PilB proteins from N. meningitidis and Fusobacterium nucleatum allowed me to show that: 1) the selective reduction of Nter domain for the MsrB domain is not conserved, 2) the selective reduction of Nter domains observed on the isolated domains is not found in entire PilB, and 3) in all PilB, the MsrB domain reduction by Nter domain could be an intramolecular mechanism. Moreover, we studied the in vivo effect of the pilB gene deletion on the survival of a strain of N. meningitidis in the presence of oxidants. And, the N-terminal domain of DsbD protein (nDsbD) from N. meningitidis was identified as the reducing partner of periplasmic PilB and DsbE1 of N. meningitidis. Finally, the characterization of apocytochrome c reductase activity of DsbE1 N. meningitidis was complemented by in vitro and in vivo approaches in N. meningitidis, Les espèces Neisseria gonorrhoeae et Neisseria meningitidis, sont des bactéries pathogènes obligatoires de l'Homme, qui ont acquis différents mécanismes de défense pour détecter et combattre le stress oxydant généré par les mécanismes de défense de l'hôte lors de l'infection. La protéine PilB périplasmique, ferait partie de ces mécanismes et serait de ce fait associée à leur pathogénicité. PilB est composée de trois domaines : un domaine N-terminal (Nter) à activité disulfure oxydoréductase, et les domaines central et C-terminal à activité Méthionine Sulfoxyde Réductase (Msr) respectivement de classe A et B. L'étude des domaines isolés de PilB avait montré que le domaine Nter réduit sélectivement le domaine MsrB. Par ailleurs, le domaine Nter présente un repliement de type DsbE. Les DsbE sont des disulfure oxydoréductases périplasmiques impliquées dans la maturation des cytochromes c. En particulier, la DsbE1 de N. meningitidis a été identifiée par le Dr Adeline Gand lors de son doctorat.Lors de ma thèse, l'étude des protéines PilB de N. meningitidis et de Fusobacterium nucleatum m'a permis de montrer que : 1) la sélectivité de réduction du domaine Nter pour le domaine MsrB n'est pas conservée, 2) la sélectivité de réduction des domaines Nter observée sur les domaines isolés n'est pas retrouvée sur les PilB entiers ; et 3) dans tous les PilB, la réduction du domaine MsrB par le domaine Nter peut se faire selon un mécanisme intramoléculaire. De plus, nous avons étudié in vivo l'effet de la délétion du gène pilB sur la survie d'une souche de N. meningitidis en présence d'agents oxydants. D'autre part, le domaine N-terminal de la protéine DsbD (nDsbD) de N. meningitidis a été identifié comme étant le réducteur périplasmique de PilB et de la DsbE1 de N. meningitidis. Enfin, la caractérisation de l'activité apocytochrome c réductase de la DsbE1 de N. meningitidis a été complétée par des approches in vitro et in vivo chez N. meningitidis

This study is about the electrostatic and structural properties of proteins diffracting at high X-ray resolution. Two different aspects are tackled which are 1) the analysis of properties derived from their charge distribution, parting from a fundamental point of view and 2) the application of methods used in high resolution macromolecular crystallography to two enzymes of major interest.After the analysis of the structure and electrostatic properties of PfluDING protein, the binding mode of a phosphate ion, located in the active site, was elucidated at two different pH values. Particularly, this study demonstrates that a diffuse hydrogen bond assures the protonation state of the phosphate ion, which is thus identical at each pH value. The second enzyme studied is the proteine DFPase which is capable of hydrolysing nerve agents. A high resolution X-ray structure and a medium resolution neutron structure where compared. The analysis points out the differences between the two models and a new catalytic mechanism could be proposed.The more fundamental aspects of this study are about the secondary structural elements of proteins: their electrostatic properties in terms of electrostatic moments (dipole and quadrupole moments of helices and sheets) as well as the hydrogen bond network assuring the cohesion of helices have been analyzed. It has been shown that certain interactions between peptide units within helices, represented usually as hydrogen bonds, should actually be considered as pure electrostatic contacts, Cette étude est consacrée à l'analyse des propriétés électrostatiques et structurales des protéines diffractant à haute résolution. Les travaux se déclinent en deux aspects principaux qui sont, d'une part, l'analyse d'un point de vue fondamental des propriétés dérivées de leur distribution de charge des structures des protéines, et, d'autre part, l'application pratique des méthodes de la cristallographie haute résolution des macromolécules à deux enzymes.Grâce à une analyse structurale et électrostatique de la protéine PfluDING, le mode de fixation du phosphate a été mis en évidence à deux pH différents. En particulier, cette étude a permis de démontrer la présence d'une liaison hydrogène diffuse assurant un mode de fixation identique quelque soit le pH. La seconde enzyme étudiée est la protéine DFPase, capable de dégrader les organophosphorés. La structure de la DFPase obtenue par diffraction X haute résolution et la structure affinée contre des données neutroniques ont été comparées. L'analyse pointe les différences d'interprétation des deux modèles, et permet de proposer un nouveau mécanisme d'action.Les aspects plus fondamentaux de cette étude portent sur les éléments de structure secondaire des protéines : leurs propriétés électrostatiques en termes de moments électriques (moments dipolaires et quadripolaires des hélices et des feuillets), et le réseau des interactions (dont les liaisons H) assurant la cohésion des hélices ont été analysés. Il a été démontré comment certaines interactions entre liaisons peptidiques au sein d'hélices, classiquement représentées comme des liaisons hydrogène, devaient être considérés comme des contacts purement électrostatiques

Le suppresseur de tumeur p53 permet à la cellule de se défendre contre différentes formes de stress. Il joue un rôle de barrière s'opposant à la tumorigenèse: en effet la perte de p53 chez la souris prédispose grandement ces animaux à développer des tumeurs; de même le locus p53 est inactivé dans près de 50% des tumeurs humaines.p53 constitue un facteur de transcription qui se lie à des séquences particulières de l'ADN et active l'expression des gènes adjacents. L'expression orchestrée de ces gènes conduit, directement ou indirectement et suivant le contexte cellulaire, soit à la mort de la cellule soit à l'inhibition de la division cellulaire.Les mécanismes moléculaires médiant ces deux activités biologiques essentielles de p53, de même que les mécanismes influençant le choix de la réponse cellulaire, sont encore mal compris. L'importance de p53 dans ce choix reste également à démontrer.Afin de contribuer à la compréhension de ces mécanismes, le modèle murin déficient pour Mdm4, un régulateur négatif de l'activité de p53, a été choisi. L'inactivation de Mdm4 chez la souris conduit en effet à l'activation ectopique de p53 in vivo et l'induction de deux types de réponse: apoptose dans le neuroépithélium et arrêt de la prolifération cellulaire dans les tissus non neuronaux. Le profil d'expression des gènes dans les tissus neuronaux et non neuronaux a donc été comparé entre embryons de souris sauvage et mdm4-/- par la technique d'hybridation de biopuces à ADN. Les résultats obtenus suggèrent que le type de réponse dépend du type cellulaire et non de p53 lui-même. En effet les profils d'expression des gènes dans les tissus neuronaux (conditions d'apoptose) et non neuronaux (conditions d'arrêt de la prolifération cellulaire) chez l'embryon de souris mdm4-/- sont comparables.Nous nous sommes ensuite particulièrement intéressés à deux nouveaux gènes dont l'expression est augmentée dans les embryons mdm4-/-. Dans un premier temps, leur induction transcriptionnelle chez l'embryon de souris mdm4-/- a été confirmée par différentes techniques et il a été vérifié qu'ils constituaient tous deux des cibles directes de p53 induites suite à un stress génotoxique.Le premier gène code Dapk1, une protéine suppresseur de tumeur pro-apoptotique présentant une activité de type sérine/thréonine kinase. Ce travail a permis d'établir que Dapk1 participait à une boucle de rétroaction du contrôle de l'activité de p53.Le deuxième gène identifié code la protéine Ptprv, un récepteur transmembranaire présentant une activité de type tyrosine phosphatase. En vue d'étudier la signification physiologique de l'induction transcriptionnelle de ptprv suite à l'activation de p53, des expériences effectuées à partir de matériel biologique issu de souris déficientes pour Ptprv ont été réalisées. Ces expériences confirment le rôle essentiel de Ptprv comme médiateur de l'arrêt du cycle cellulaire en phase G1 induit par p53 suite à un stress génotoxique, à la fois in vitro et in vivo. Par contre, Ptprv ne semble pas influencer l'apoptose induite suite à l'activation de p53. Ce travail a également permis d'établir le rôle essentiel de Ptprv dans la suppression de tumeurs induites chez la souris par activation constitutive de l'oncogène Ras., Doctorat en sciences, Spécialisation biologie moléculaire, info:eu-repo/semantics/nonPublished

Cette thèse se place dans le cadre de l'étude in silico, c'est-à-dire assistée par ordinateur, des liens qui unissent la séquence d'une protéine à la (ou aux) structure(s) tri-dimensionnelle(s) qu'elle adopte. Le décryptage de ces liens présente de nombreuses applications dans divers domaines et constitue sans doute l'une des problématiques les plus fascinantes de la recherche en biologie moléculaire.Le premier aspect de notre travail concerne le développement de potentiels statistiques dérivés de bases de données de protéines dont les structures sont connues. Ces potentiels présentent plusieurs avantages: ils peuvent être aisément adaptés à des représentations structurales simplifiées, et permettent de définir un nombre limité de fonctions énergétiques qui incarnent l'ensemble complexe d'interactions gouvernant la structure et la stabilité des protéines, et qui incluent également certaines contributions entropiques. Cependant, leur signification physique reste assez nébuleuse, car l'impact des diverses hypothèses nécessaires à leur dérivation est loin d'être clairement établi. Nous nous sommes attachés à l'étude de certaines limitations des ces potentiels: leur dépendance en la taille des protéines incluses dans la base de données, la non-additivité des termes de potentiels, et l'importance souvent négligée de l'environnement protéique spécifique ressenti par chaque résidu. Nous avons ainsi mis en évidence que l'influence de la taille des protéines de la base de données sur les potentiels de distance entre résidus est spécifique à chaque paire d'acides aminés, peut être relativement importante, et résulte essentiellement de la répartition inhomogène des résidus hydrophobes et hydrophiles entre le coeur et la surface des protéines. Ces résultats ont guidé la mise au point de fonctions correctives qui permettent de tenir compte de cette influence lors de la dérivation des potentiels. Par ailleurs, la définition d'une procédure générale de dérivation de potentiels et de termes de couplage a rendu possible la création d'une fonction énergétique qui tient compte simultanément de plusieurs descripteurs de séquence et de structure (la nature des résidus, leurs conformations, leurs accessibilités au solvant, ainsi que les distances qui les séparent dans l'espace et le long de la séquence). Cette fonction énergétique présente des performances nettement améliorées par rapport aux potentiels originaux, et par rapport à d'autres potentiels décrits dans la littérature.Le deuxième aspect de notre travail concerne l'application de programmes basés sur des potentiels statistiques à l'étude de protéines qui adoptent des structures alternatives. La permutation de domaines est un phénomène qui affecte diverses protéines et qui implique la génération d'un oligomère suite à l'échange de fragments structuraux entre monomères identiques. Nos résultats suggèrent que la présence de "faiblesses structurales", c'est-à-dire de régions qui ne sont pas optimales vis-à-vis de la stabilité de la structure native ou qui présentent une préférence marquée pour une conformation non-native en absence d'interactions tertiaires, est intimement liée aux mécanismes de permutation. Nous avons également mis en évidence l'importance des interactions de type cation-{pi}, qui sont fréquemment observées dans certaines zones clés de la permutation. Finalement, nous avons sélectionné un ensemble de mutations susceptibles de modifier sensiblement la propension de diverses protéines à permuter. L'étude expérimentale de ces mutations devrait permettre de valider, ou de raffiner, les hypothèses que nous avons proposées quant au rôle joué par les faiblesses structurales et les interactions de type cation-{pi}. Nous avons également analysé une autre protéine soumise à d'importants réarrangements conformationnels: l'{alpha}1-antitrypsine. Dans le cas de cette protéine, les modifications structurales sont indispensables à l'exécution de l'activité biologique normale, mais peuvent sous certaines conditions mener à la formation de polymères insolubles et au développement de maladies. Afin de contribuer à une meilleure compréhension des mécanismes responsables de la polymérisation, nous avons cherché à concevoir rationnellement des protéines mutantes qui présentent une propension à polymériser contrôlée. Des tests expérimentaux ont été réalisés par le groupe australien du Professeur S.P. Bottomley, et ont permis de valider nos prédictions de manière assez remarquable.The work presented in this thesis concerns the computational study of the relationships between the sequence of a protein and its three-dimensional structure(s). The unravelling of these relationships has many applications in different domains and is probably one of the most fascinating issues in molecular biology.The first part of our work is devoted to the development of statistical potentials derived from databases of known protein structures. These potentials allow to define a limited number of energetic functions embodying the complex ensemble of interactions that rule protein folding and stability (including some entropic contributions), and can be easily adapted to simplified representations of protein structures. However, their physical meaning remains unclear since several hypotheses and approximations are necessary, whose impact is far from clearly understood. We studied some of the limitations of these potentials: their dependence on the size of the proteins included in the database, the non-additivity of the different potential terms, and the importance of the specific environment of each residue. Our results show that residue-based distance potentials are affected by the size of the database proteins, and that this effect can be quite strong, is residue-specific, and seems to result mostly from the inhomogeneous partition of hydrophobic and hydrophilic residues between the surface and the core of proteins. On the basis of these observations, we defined a set of corrective functions in order to take protein size into account while deriving the potentials. On the other hand, we developed a general procedure of derivation of potentials and coupling terms and consequently created an energetic function describing the correlations between several sequence and structure descriptors (the nature of each residue, the conformation of its main chain, its solvent accessibility, and the distances that separate it from other residues, in space and along the sequence). This energetic function presents a strongly improved predictive power, in comparison with the original potentials and with other potentials described in the literature.The second part describes the application of different programs, based on statistical potentials, to the study of proteins that adopt alternative structures. Domain swapping involves the exchange of a structural element between identical proteins, and leads to the generation of an oligomeric unit. We showed that the presence of “structural weaknesses”, regions that are not optimal with respect to the folding mechanisms or to the stability of the native structure, seems to be intimately linked with the swapping mechanisms. In addition, cation-{pi} interactions were frequently detected in some key locations and might also play an important role. Finally, we designed a set of mutations that are likely to affect the swapping propensities of different proteins. The experimental study of these mutations should allow to validate, or refine, our hypotheses concerning the importance of structural weaknesses and cation-{pi} interactions. We also analysed another protein that undergoes large conformational changes: {alpha}1-antitrypsin. In this case, the structural modifications are necessary to the proper execution of the biological activity. However, under certain circumstances, they lead to the formation of insoluble polymers and the development of diseases. With the aim of reaching a better understanding of the mechanisms that are responsible for this polymerisation, we tried to design mutant proteins that display a controlled polymerisation propensity. An experimental study of these mutants was conducted by the group of Prof. S.P. Bottomley, and remarkably confirmed our predictions., Doctorat en sciences appliquées, info:eu-repo/semantics/nonPublished

Not available, La levure pichia pastoris IFP 206 a été cultivée dans un milieu à base de sels minéraux contenant comme source de carbone soit du méthanol (levure très floculante) soit du glucose (levure peu floculante). L'analyse chimique des parois et des phosphopeptidomannanes (PPM) isolés de cellules entières de cette levure a montré des différences significatives notamment dans leur teneur en acides aminés qui augmente avec le degré de floculation et inversement en ce qui concerne celle des hexosamines. Nous n'avons pas observé une forte élévation de la teneur en mannose et en phosphore des parois ou des PPM parallèlement avec le degré de floculation, ce qui laisse supposer que chez la levure pichia pastoris IFP 206, ce phénomène biologique se fait plutôt par le biais d'un facteur parietal caractéristique. En effet, l'étude structurale des oligomannosides composant les PPM a montré qu'ils renferment des liaisons de type alpha (1-2) et/ou beta (1-2) et que le mannopentaose, nettement plus important dans les mannanes de la levure floculante que ceux de la levure peu floculante, pourrait être considéré comme l'un des facteurs responsables de la floculation de la levure pichia pastoris IFP 206

Not available, La levure pichia pastoris IFP 206 a été cultivée dans un milieu à base de sels minéraux contenant comme source de carbone soit du méthanol (levure très floculante) soit du glucose (levure peu floculante). L'analyse chimique des parois et des phosphopeptidomannanes (PPM) isolés de cellules entières de cette levure a montré des différences significatives notamment dans leur teneur en acides aminés qui augmente avec le degré de floculation et inversement en ce qui concerne celle des hexosamines. Nous n'avons pas observé une forte élévation de la teneur en mannose et en phosphore des parois ou des PPM parallèlement avec le degré de floculation, ce qui laisse supposer que chez la levure pichia pastoris IFP 206, ce phénomène biologique se fait plutôt par le biais d'un facteur parietal caractéristique. En effet, l'étude structurale des oligomannosides composant les PPM a montré qu'ils renferment des liaisons de type alpha (1-2) et/ou beta (1-2) et que le mannopentaose, nettement plus important dans les mannanes de la levure floculante que ceux de la levure peu floculante, pourrait être considéré comme l'un des facteurs responsables de la floculation de la levure pichia pastoris IFP 206