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Orientador: Celso Eduardo Benedetti Tese (doutorado) - Universidade Estadual de Campinas, Instituto de Biologia Resumo: O cancro cítrico resulta da interação compatível entre a bactéria Xanthomonas axonopodis pv. citri e Citrus spp. A doença não tem cura, é de fácil disseminação e difícil controle. O cenário é preocupante, pois a doença diminui drasticamente o rendimento e a qualidade dos frutos de plantas infectadas, ocasionando um forte impacto econômico na citricultura mundial. Os principais sintomas do cancro cítrico, resultantes dos processos de hipertrofia (aumento do volume celular) e hiperplasia (aumento da divisão celular), são dependentes da proteína efetora PthA de X. citri. PthA integra a família de fatores de transcrição conhecida como efetores ativadores de transcrição (transcription activator-like ou TAL). O principal homólogo de PthA é o efetor AvrBs3 de X. campestris pv. vesicatoria que atua regulando a transcrição de genes do hospedeiro em benefício do patógeno. A similaridade entre estas proteínas gira em torno de 97%, sugerindo, portanto, função semelhante para PthA. Através de uma série de microarranjos, investigou-se o perfil de expressão gênica de laranja doce (Citrus sinensis) dependente de PthA (X. citri) e de PthCs de X. aurantifolii, uma bactéria que causa cancro cítrico apenas no limão galego e que, em laranja doce, induz uma reação de hipersensibilidade. Desta forma, verificou-se a regulação positiva ou negativa de uma série de genes. Os PthCs regularam negativamente genes associados à sinalização por auxina e induziram a expressão de genes de defesa e silenciamento gênico. Em contrapartida, PthAs induziram uma série de genes intimamente relacionados aos sintomas de cancrose, incluindo: genes associados aos processos de aumento e divisão celular, síntese e remodelamento de parede celular, bem como genes envolvidos na sinalização por auxina e giberelina. Neste sentido, efetuou-se o isolamento de regiões promotoras de cinco genes, os quais são potencialmente regulados por PthA. A análise destas regiões revelou a presença de um possível TATA-box notavelmente semelhante àquele encontrado no gene upa20, denominado UPA-box (up-regulated por AvrBs3), sugerindo que estes genes poderiam ser transativados por PthA em citros. De fato, ensaios de retardamento de mobilidade eletroforética (electrophoretic mobility shift assay ou EMSA), demonstraram a ligação específica de PthA2 e 4 ao TATA-box encontrado na região promotora do gene que codifica uma proteínas relacionada à patogênese (pathogenesis-related proteins ou PR). Este resultado corrobora com a hipótese de que os efetores TAL atuam como proteínas ligadoras de elementos TATA. Finalmente, experimentos de co-imunoprecipitação de cromatina (ChIP) e cotransformação demonstraram, ainda que em resultados preliminares, que particularmente PthA4 é capaz de transativar pr5 in planta. Embora o cancro cítrico ainda não seja completamente entendido a nível molecular, os dados aqui apresentados sugerem fortemente a ação de PthAs como fatores de transcrição, bem como aponta candidatos à regulação positiva intimamente associados aos processos de hipertrofia e hiperplasia. Além disso, as regiões promotoras aqui isoladas podem ajudar no desenvolvimento de novas estratégias para a geração de plantas resistentes à cancrose Abstract: Citrus canker is a result of a compatible interaction between Xanthomonas axonopodis pv. citri and Citrus spp. There is no cure for citrus canker, and the disease is easily spread and difficult to be managed. The scenario is threatening since the disease dramatically diminishes the quality of fruits in infected plants leading to great economic losses for the world citrus producers. The main citrus canker symptoms known as hypertrophy (cell enlargement) and hyperplasia (cell division) are PthA-dependent. PthA is an effector protein from X. citri which belongs to the TAL effectors (transcription activatorlike) family. The closest homologue of PthA is AvrBs3 from Xanthomonas campestris pv. vesicatoria, a TAL effector that acts as a transcriptional factor to modulate host transcription to the pathogen's benefit. Similarity shared by these two proteins is around 97%, suggesting that PthA plays a similar role in the citrus host. Through a number of microarray experiments, we investigate the gene transcription in sweet orange (Citrus sinensis) in response to the transient expression of PthA from X. citri or PthC from X. aurantifolii, pathotype C, a bacteria that causes citrus canker in Mexican lime but in orange trigger a hypersensitive response in sweet orange. We observed that PthCs down-regulated various auxin signaling genes and induced the expression of genes involved in defense and gene silencing. On the other hand, PthAs induces several genes implicated in canker development such as cell division and elongation, cell-wall synthesis and remodeling, synthesis, mobilization and signaling of auxin and gibberellin. Promoter regions of PthA-induced genes were isolated and shown to have predicted PthA and PthC binding sites at or near their putative TATA boxes. Moreover, competition gel shift assays confirmed that PthA4 shows preferential binding to the TATA box of the pathogenesis-related (pr5) gene promoter, supporting the idea that TAL effectors may act as general TATA-binding proteins. Finally, both chromatin immunoprecipitation (ChIP) and co-transformation assays demonstrated however as preliminary results, that PthA4 is able to transactivate pr5 in planta. Albeit the molecular mechanism by which citrus canker develop remains elusive at the molecular level, we provided data supporting the notion that PthA acts as a transcriptional factor, as well as identified PthA-induced genes associated with hypertrophy and hyperplasia. Furthermore, the promoter regions isolated here might be useful to obtain citrus plants resistant to the canker bacteria Doutorado Bioquímica Doutor em Biologia Funcional e Molecular

Orientador: Celso Eduardo Benedetti Tese (doutorado) - Universidade Estadual de Campinas, Instituto de Biologia Resumo: O cancro cítrico, causado pela bactéria Xanthomonas citri (X. citri), afeta a maioria das espécies de Citrus, ocorre praticamente em todos continentes e se destaca como uma séria ameaça à citricultura brasileira. O mecanismo molecular pelo qual X. citri causa cancro não é inteiramente conhecido, entretanto, sabe-se que a bactéria utiliza o sistema secretório tipo III para injetar proteínas de patogenicidade, entre elas, PthAs da família AvrBs3/PthA, também conhecidas como efetores TAL (transcriptional activator-like). Os efetores TAL atuam como fatores de transcrição transativando genes específicos da planta que vão beneficiar a bactéria ou desencadear respostas de defesa. Com o objetivo de entender os mecanismos moleculares pelos quais os efetores TAL atuam, a técnica de duplo híbrido foi usada para identificar proteínas de laranja doce (Citrus sinensis) que interagem com PthA4, um dos efetores TAL de X. citri necessário para o desenvolvimento do cancro cítrico. A maioria das proteínas de laranja identificadas como alvos de PthA4 apresenta domínios de ligação à DNA ou RNA e está envolvida no controle da transcrição, estabilização de mRNAs e tradução. Várias dessas proteínas interagem entre si, sugerindo a presença de um complexo multiproteico como alvo de efetores TAL. Entre as proteínas envolvidas no controle da transcrição, destacamos a CsMAF1, uma proteína homóloga à MAF1 humana que atua como regulador negativo da RNA Polimerase III. Os resultados obtidos nesse trabalho revelam que CsMAF1 complementa o fenótipo do mutante maf1 de levedura, reprimindo a expressão de tRNAHis e que a expressão de PthA4 na cepa complementada restaura a síntese desse tRNA. Portanto, os dados mostram que CsMAF1 atua como um repressor da RNA Pol III em levedura e que PthA4 altera o estado repressor de CsMAF1 sobre a RNA Pol III. De forma surpreendente, verificamos que plantas de citros com níveis reduzidos de CsMAF1 apresentaram aumento significativo no número e intensidade de lesões hiperplásticas ou eruptivas quando infiltradas com X. citri, indicando que CsMAF1 desempenha um papel crítico no desenvolvimento dos sintomas do cancro cítrico. O aumento das lesões do cancro nas plantas silenciadas para CsMAF1 se correlaciona com um aumento expressivo de tRNAs, incluindo o tRNAHis, confirmando assim o papel repressor de CsMAF1 sobre a RNA Pol III em citros. Além disso, mostramos nesse trabalho que CsMAF1 é uma fosfoproteína que se encontra na forma dimérica em solução, uma característica singular ainda não descrita para membros dessa família de proteínas. Verificamos que CsMAF1 é fosforilada in vitro pelas quinases PKA e PKC e que apresenta sítios adicionais de fosforilação conservados para a quinase TOR, incluindo o resíduo Thr62. Curiosamente, tais sítios se localizam na interface de dimerização de CsMAF1, sugerindo que a fosforilação desses sítios deve regular a função da proteína e/ou seu estado multimérico. De fato, verificamos que a substituição do resíduo de treonina Thr 62 para ácido aspártico (Asp 62) diminui a proporção dímero:monômero de CsMAF1, indicando que a fosforilação de resíduos na interface do dímero desestabiliza o dímero, e que esse pode ser um mecanismo regulatório novo para essa classe de proteína. Desse modo, esses achados abrem novas perspectivas para o entendimento não só dos mecanismos moleculares envolvidos na regulação da RNA Pol III pela CsMAF1, como também do papel de PthA4 na interação com CsMAF1 e sua modulação da transcrição Abstract: Citrus canker, caused by Xanthomonas citri (X. citri), is a disease that affects most of the Citrus species, occurs in almost all continents and stands as a threat to the Brazilian citrus industry. The molecular mechanism by which X. citri causes canker is poorly understood, however the bacterium injects pathogenicity proteins via the type III secretion system (T3S) including proteins of AvrBs3/PthA family, also known as transcriptional activator-like (TAL) effectors. TAL effectors have been extensively studied and are known to act as transcription factors that transactivate specific plant genes which either benefit the bacteria or trigger defense responses. To gain insights into the molecular mode of action of TAL effectors, a twohybrid screening was performed to identify sweet orange (Citrus sinensis) proteins that interact with PthA4, one of the X. citri TAL effectors required for citrus canker development. Among the proteins identified as PthA4 interactors, most are DNA and/or RNA-binding factors involved in chromatin remodeling and repair, transcriptional control and mRNA stabilization/modification. Several of these proteins interact with each other, suggesting the presence of a multiprotein complex as a target of TAL effectors. Among the proteins involved in transcription control, we selected for further studies the CsMAF1, a homolog of the human MAF1 that acts as a negative regulator of RNA polymerase III. The results presented here reveal that CsMAF1 complements the yeast maf1 mutant phenotype by repressing the tRNAHis transcription, and that PthA4 expression in the complemented strain restores the tRNAHis synthesis. Thus, the data show that CsMAF1 acts as a RNA Pol III repressor in yeast and that PthA4 somehow suppresses the repressor activity of CsMAF1 upon on the RNA Pol III. Surprisingly, we found that citrus plants with reduced levels of CsMAF1 showed a significant increase in the number, morphology and size of eruptive or hyperplastic lesions when infiltrated with X. citri, indicating the CsMAF1 plays a critical role in canker development. Increased canker lesions in CsMAF1 silenced plants correlated with a significant increase of tRNAs expression, including tRNAHis, thus confirming the repressor role of CsMAF1 upon the citrus RNA Pol III. Furthermore, we showed in this work that CsMAF1 is a phosphorylated and a dimer in solution, a feature that so far has not been reported for any member of this protein family. We found that CsMAF1 is phosphorylated in vitro by PKA and PKC, and has additional phosphorylation sites for the TOR kinase, including the Thr 62 residue. Interestingly, these phosphorylation sites are located at the dimerization interface of CsMAF1, suggesting that phosphorylation of such sites might regulate the function of the protein and / or its multimeric state. Indeed, mutation of threonine residue Thr62 to aspartic acid (Asp62) decreases the dimer:monomer CsMAF1 ratio, indicating that phosphorylation of the residues at the interface of the dimer destabilizes the dimer, and this may be a novel regulatory mechanism for this class of protein. Thus, these findings open new perspectives for the understanding of the molecular mechanisms involved in RNA Pol III regulation by CsMAF1, as well as for the role of PthA4 in the modulation of RNA Pol III transcription mediated by CsMAF1 Doutorado Genética Vegetal e Melhoramento Doutor em Genética e Biologia Molecular