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[ES] Las mutaciones puntuales dirigidas a través de técnicas de edición del genoma tienen un gran potencial para desarrollar variedades mejoradas de cultivos, ya que muchos rasgos agronómicos están determinados por polimorfismos de un solo nucleótido (SNP). La edición de bases es una nueva técnica de edición del genoma que permite la creación de cambios precisos de un solo par de bases de una manera programable. Hay dos tipos de editores de base (BE): los editores de base de citosina (CBE) que realizan conversiones de base de C-a-T y los editores de base de adenina (ABE) que realizan conversiones de base de A-a-G. Recientemente, se han desarrollado CBE para ediciones de base C-a-G o C-a-A para animales y bacterias. En este estudio, desarrollamos CBE para la edición de bases C-a-G / C-a-A en plantas. Para cuantificar la eficiencia de la edición, desarrollamos un sistema de selección de GFP para detectar rápidamente la edición de base en protoplastos de maíz. El sistema emplea un reportero de GFP inactivo que se activa con la conversión de bases de C-a-G o C-a-A. Se probaron siete CBE y seis reporteros GFP, sin embargo, no se observó edición de base de C-a-G o de C-a-A usando los reporteros. La edición de bases puede variar según el gene diana. Por lo tanto, evaluar los editores de base en genes endógenos puede proporcionar una estimación más precisa de la eficiencia de edición del editor de base en genes que codifican para rasgos específicos en plantas. Probamos trece sitios diana dentro de seis genes de maíz (GRF1, FEA3, SMK1, LG2, DWF4, EMP16) mediante edición de base única y multiplex. Once de los sitios de diana [GRF1, FEA3 (1-1, 1-2), SMK1 (2-1, 2-2), LG2 (3-1, 3-2), DWF4 (4-1, 4-2)], EMP16 (5-1, 5-2)] mostró >10% de edición C-a-T y solo un sitio diana [DWF4 (4-2)] mostró un 9% de edición C-a-G. Nuestros resultados sugieren que nuestros BE tienen una baja actividad de edición C-a-G / C-a-A y que utilizar genes endógenos para cuantificar este tipo de ediciones puede ser una mejor estrategia que utilizar un sistema reportero fluorescente., [EN] Targeted point mutations via genome editing techniques have great potential for developing improved crop varieties as many important agronomic traits are determined by single nucleotide polymorphisms (SNPs). Base editing is a new genome-editing technique that enables the creation of precise single base-pair changes in a programmable manner. There are two types of base editors (BEs): Cytosine Base editors (CBEs) that make C-to-T base conversions and Adenine Base Editors (ABEs) that make A-to-G base conversions. Recently, CBEs for C-to-non-T base edits have been developed for mammalian and bacterial systems. In this study, we developed CBEs for C-to-G/C-to-A base editing in plant systems. To quantify editing efficiency, we developed a GFP screening system to quickly detect base editing in maize protoplasts. The system employs an inactive GFP reporter that is activated upon C-to-G or C-to-A base editing. Seven CBEs and Six GFP reporters were tested, however, no C-to-G or C-to-A base editing was observed using the reporter systems. Base editing activity can vary depending on the target site. Thus, testing base editors on endogenous targets can give a more accurate estimation of base editor editing efficiency on specific traits in plants. Here, we tested thirteen target sites within six maize genes (GRF1, FEA3, SMK1, LG2, DWF4, EMP16) by single and multiplex base editing. Eleven of the target sites [GRF1, FEA3 (1-1, 1-2), SMK1(2-1, 2-2), LG2 (3-1, 3-2), DWF4 (4-1, 4-2), EMP16 (5-1, 5-2)] showed >10% of C-to-T base editing and only one target site [DWF4 (4-2)] showed a 9% of C-to-G base editing. Our results suggest that our BEs have low C-to-G/C-to-A editing activity and that endogenous targets can be a better approach than a fluorescent reporter system to quantify C-to-G or C-to-A editing outcomes.

Orientadores: Renato Bonatelli Junior, Maristela O. Azevedo, Maria Sueli S. Felipe Dissertação (mestrado) - Universidade Estadual de Campinas, Instituto de Biologia Resumo: Foram estabelecidas neste trabalho, duas metodolo-gias para linhagens de Aspergillus niger com o interesse voltado para sua utilização na Tecnologia do DNA Recombi- nante (TDR). A primeira delas teve por objetivo o melhoramento da técnica de produção de protoplastos para esta linhagem, assim como a definição de melhores condições de regenera-ção. As melhores preparações de protoplastos provieram do micélio desenvolvido _na presença de Tween 80. Durante a produção foi possível obter até 2,1 x 108 protoplastos/ml quando o sulfato de magnésio 0,5M foi utilizado como estabilizador nesta etapa. A associação do sorbitol ao MgSO4, em baixa concentração (50 mM) possibilitou um aumento signifi-cativo da taxa de regeneração (de até, aproximadamente 20%) quando o sorbitol foi mantido como único estabilizador. Os clorotoplastos obtidos pelo método de GAMBINO e col. (1984) por nós adaptado, apresentaram-se túrgidos e permitiram uma análise cito lógica com visualização de numerosos núcleos. A segunda metodologia objetivou a melhoria do pro-cedimento da extração de DNA deste fungo resultando em uma preparação rápida (3,5 horas de manipulação) em que o DNA apresentou as seguintes características: - peso molecular elevado ( 50Kb) quando comparado ao mar-cador fago ?. -alto grau de pureza (A260: A280= 1,8 - 2,0) . - susceptibilidade à ação de enzimas de restrição (Eco RI e Pst I) e de ligação (T4 DNA-ligase) A determinação da quantidade de DNA obtido após extra-ção, utilizando-se a metodologia desenvolvida durante o trabalho, foi feita por dosagem colorimétrica da difenila-mina (DF A). A recuperação do DNA extraído foi de 70% e sua alta reprodutibilidade permitiu inclusive, autilização desta metodologia para extração desta macromolécula de ou-tros fungos filamentosos Abstract: This research was done aiming the improvement of two methods of great relevanceto the Recombinant DNA Tech-nology (RDT) in Aspergillus niger. Firstly, the method of production and regeneration of protoplasts was improved. The best protoplasts preparations (2. 1 x 108 protoplasts/ml) were obtained when the my-celium was grown in medium containing Tween 80 and magne-sium sulphate 0.5M, the latter used as an osmotic stabili-zer. However, regeneration could only be significantly im-proved when magnesium sulphate was used at a lower concen-tration (50 mM) associated with sorbitol (1.2 M) during the production of protoplasts. Cytological analysis with protoplasts isolated by using the method of GAMBINO et alii (1984)revealed that up to 32 nuclei can be counted per protoplast. The method for isolation of DNA from this species was also improved. The final procedure is rapid (3.5 hours of manipulation before cesium chloride ¿ ethidium bromide gradient) and DNA isolated has showed the following characteristics: - high molecular weight; approximately 50 Kb. ¿ low level of proteic contamination (A260: A280= 1,8 - 2,0).- susceptibility to restriction (Eco RI and Pst I) and ligation (T4 DNA - ligase) enzymes. The DFA method was -.applied to estimate the recovery of DNA by using this improved procedure. DNA yields as high as 70% (ratio between final and inicial DNA concentrations) were obtained. The improved procedure has also proved to be suita-ble for extraction of DNA from others species of filamen-tous fungi Mestrado Genética Mestre em Ciências Biológicas

Orientador : Renato Bonatelli Jr Dissertação (mestrado) - Universidade Estadual de Campinas, Instituto de Biologia Mestrado Genética Mestre em Ciências Biológicas

Esta investigación ha sido financiada por los fondos FEDER EU, el Ministerio de Economía y Competitividad de España (AGL2017-86531-C2-1-R), y el contrato FPI PRE2018-085509. La fresa es un fruto blando de gran importancia económica, particularmente en Andalucía. La mejora de las cualidades organolépticas del fruto y la disminución del reblandecimiento para alargar la vida postcosecha del fruto, son unos de los principales objetivos de los programas de mejora en este cultivo. El reblandecimiento del fruto es consecuencia del desmantelamiento de la pared celular, la disolución de la lámina media y la pérdida de turgencia. En fresa, el silenciamiento mediante la transformación en antisentido de genes que codifican poligalacturonasas (PG) aumenta la firmeza del fruto y la vida postcosecha (Paniagua et al., 2020). Por tanto, estos genes son excelentes dianas para la edición génica con el fin de mejorar la calidad del fruto de la fresa. La transfección de protoplastos con complejos preensamblados Cas9-sgRNA permite la producción de plantas editadas vía CRISPR/Cas9 libres de ADN foráneo, que podrían ser consideradas como no transgénicas. En esta investigación, se ha optimizado un protocolo para la transfección de protoplastos de fresa, con el objetivo final de producir plantas no transgénicas con el gen de poligalacturonasa FaPG1 mutado. Como fuente de material vegetal se utilizaron hojas de plantas de Fragaria x ananassa, cv. ‘Chandler’, micropropagadas en medio Murashige y Skoog (MS) suplementado con 2 mg/L de BA. Para la extracción de protoplastos se utilizó el protocolo descrito por Barceló et al. (2019). A las 24 h del aislamiento, los protoplastos fueron transfectados con el plásmido pHBT-sGFP(S65T)-NOS que contiene el gen marcador GFP, mediante un tratamiento con polietilenglicol (PEG), como se describe en Yoo et al. (2007). Se evaluaron, entre otras variables, el efecto de la concentración y tiempo de incubación en PEG y la concentración de ADN. Los valores más altos de protoplastos con actividad GFP a las 48 h de la transfección, entre el 15-18%, se obtuvieron tras la incubación en 20% de PEG en presencia de 5 µg de ADN. Universidad de Málaga. Campus de Excelencia Internacional Andalucía Tech.

La papaya (Carica papaya) es un cultivo de importancia económica y alimenticia. Por su relevancia, ha existido interés en mejorar genéticamente esta especie usando el género Vasconcellea como recurso génico. Algunas especies de este género poseen características de interés agronómico como resistencia al virus de la mancha anular de la papaya, tolerancia al frío, mayor contenido de enzimas proteolíticas y propiedades organolépticas agradables. Una alternativa para transferir estas características de Vasconcellea a C. papaya es la fusión de protoplastos. En este trabajo se aisló protoplastos de hojas de C. papaya y se determinó que el uso de una solución enzimática con 1,0% m/v de celulasa y 0,5% m/v de macerozima permite obtener un rendimiento adecuado para continuar con pasos posteriores de cultivo y fusión. Con respecto al aislamiento a partir de callos embriogénicos de C. papaya, se recomienda utilizar la misma solución enzimática, pero adicionándole 0,5% m/v de hemicelulasa. En cuanto a los protoplastos de callos de Vasconcellea sp, la variación en el contenido de celulasa no modificó el rendimiento del proceso. Sin embargo, se determinó que la adición de hemicelulasa redujo el porcentaje de protoplastos fluorescentes luego de ser teñidos con blanco de calcoflúor, que es indicativo de una mayor remoción de la pared celular, y que se debe utilizar callos friables para incrementar el rendimiento del proceso. Para realizar la fusión de los protoplastos, primeramente, se determinó si las soluciones de fusión reducen la viabilidad de los protoplastos. De las seis soluciones probadas se definió que tres de ellas no modifican este parámetro. Posteriormente se realizaron pruebas de fusión de los protoplastos; sin embargo, el éxito de las pruebas realizadas fue bajo. Un factor que pudo influenciar el proceso es la diferencia de tamaño de los protoplastos de ambas especies. Para identificar a futuro posibles híbridos se evaluó la reacción en cadena de la polimerasa combinada con la detección de polimorfismos de longitud de fragmentos de restricción (PCR-RFLP) y se encontró que las regiones ITS1-ITS4 y trnK1-trnK2 permiten diferenciar ambas especies luego de realizar la digestión con endonucleasas. Con respecto al cultivo de los protoplastos, se observó que, para ambas especies por separado, el medio de cultivo KM8P-S permitió la formación de la pared celular más rápidamente que con respecto a los otros tres medios de cultivo probados. Por último, la reducción en 50% del contenido de manitol en el medio KM8P-S permitió obtener microcolonias de protoplastos de C. papaya más grandes con respecto al testigo. Sin embargo, no se llegó a obtener la formación de callos. Universidad de Costa Rica/[734-B5-066]/UCR/Costa Rica UCR::Vicerrectoría de Investigación::Sistema de Estudios de Posgrado::Ciencias Agroalimentarias::Maestría Académica en Ciencias Agrícolas y Recursos Naturales con énfasis en Biotecnología

Introduction. Coffee (Coffea spp) is one of the most important crops worldwide, providing economic livelihood to millions of people in developing countries. There are more than 130 species of the Coffea genus, but only three species are commercially cultivated: Coffea arabica L. (2n=4x=44), Coffea canephora P. (2n=2x=22), and Coffea liberica L. (2n=2x=22). Which present limitations for their genetic improvement through conventional programs because of their perennial nature and differences in level of ploidy and incompatibility. Additionally, there are important characteristics such as resistance to pests or pathogens, which are not present in the available germplasm.Genetic engineering techniques have been used to solve this barrier, and significant advances have been generatedduring the last decades. Objective. The objective of this work was to provide an overview of the methodologies and advances in coffee genetic improvement through time, and ends with perspectives about the use of new technologies that have emerged in recent years. Development. The improvement began with the selection by crosses andinterspecific backcrosses, to move to the selection assisted by molecular markers. Subsequently, the culture and fusionof protoplasts was reported, with the disadvantage in the regeneration process. Genetic engineering through physical (electroporation and biolistics), and biological techniques (A. tumefaciens and A. rhizogenes) helped to overcome the limitations of regeneration, although the optimization processes are still laborious, so, new technologies for editing genomes such as CRISPR-Cas9, can solve problems of time and work in the laboratory for the crop. Conclusion.The improvement of coffee began three decades ago and has progressed mainly since the beginning of transgenictechnologies, and with the new techniques of specific modification of genes, the crop will benefit in the coming years. Introducción. El café (Coffea spp) es uno de los cultivos más importantes a nivel mundial y provee sustento económico a millones de personas en países en vías de desarrollo. Existen más de las 130 especies del género Coffea, pero solo tres son cultivadas comercialmente: Coffea arabica L. (2n=4x=44), Coffea canephora P. (2n=2x=22) y Coffea liberica Bull. (2n=2x=22). Las cuales presentan limitantes para su mejoramiento genético a través de programas convencionales por su carácter perenne y diferencias de nivel de ploidía e incompatibilidad. Además, existen características de importancia como resistencia a plagas o patógenos, que no se encuentran presentes en el germoplasma disponible. Técnicas de ingeniería genética se han utilizado para solventar esta barrera y se han generadoavances significativos durante las últimas décadas. Objetivo. El objetivo del presente trabajo fue proporcionar un panorama de las metodologías y avances en mejoramiento genético a través del tiempo que se han realizado en café,y finaliza con perspectivas sobre el uso de nuevas tecnologías que han surgido en los últimos años. Desarrollo. Elmejoramiento inició con la selección por cruces y retrocruces interespecíficos, para pasar a la selección asistida pormarcadores moleculares. Posteriormente, el cultivo y fusión de protoplastos fue reportado, con el inconveniente en su proceso de regeneración. La ingeniería genética por medio de las técnicas físicas (electroporación y biobalística) y biológicas (A. tumefaciens y A. rhizogenes), ayudó a sobrepasar las limitantes de regeneración, aunque los procesosde optimización aún son laboriosos, por lo que, nuevas tecnologías de edición de genomas como CRISPR-Cas9,pueden solucionar problemas de tiempo y trabajo en el laboratorio para el cultivo. Conclusión. El mejoramiento del café inició hace tres décadas y ha progresado principalmente desde el inicio de las tecnologías transgénicas, y con lasnuevas técnicas de modificación específica de genes, el cultivo se beneficiará en los próximos años.

Resumen Introducción. El café (Coffea spp) es uno de los cultivos más importantes a nivel mundial y provee sustento económico a millones de personas en países en vías de desarrollo. Existen más de las 130 especies del género Coffea, pero solo tres son cultivadas comercialmente: Coffea arabica L. (2n=4x=44), Coffea canephora P. (2n=2x=22) y Coffea liberica Bull. (2n=2x=22). Las cuales presentan limitantes para su mejoramiento genético a través de programas convencionales por su carácter perenne y diferencias de nivel de ploidía e incompatibilidad. Además, existen características de importancia como resistencia a plagas o patógenos, que no se encuentran presentes en el germoplasma disponible. Técnicas de ingeniería genética se han utilizado para solventar esta barrera y se han generado avances significativos durante las últimas décadas. Objetivo. El objetivo del presente trabajo fue proporcionar un panorama de las metodologías y avances en mejoramiento genético a través del tiempo que se han realizado en café, y finaliza con perspectivas sobre el uso de nuevas tecnologías que han surgido en los últimos años. Desarrollo. El mejoramiento inició con la selección por cruces y retrocruces interespecíficos, para pasar a la selección asistida por marcadores moleculares. Posteriormente, el cultivo y fusión de protoplastos fue reportado, con el inconveniente en su proceso de regeneración. La ingeniería genética por medio de las técnicas físicas (electroporación y biobalística) y biológicas (A. tumefaciens y A. rhizogenes), ayudó a sobrepasar las limitantes de regeneración, aunque los procesos de optimización aún son laboriosos, por lo que, nuevas tecnologías de edición de genomas como CRISPR-Cas9, pueden solucionar problemas de tiempo y trabajo en el laboratorio para el cultivo. Conclusión. El mejoramiento del café inició hace tres décadas y ha progresado principalmente desde el inicio de las tecnologías transgénicas, y con las nuevas técnicas de modificación específica de genes, el cultivo se beneficiará en los próximos años. Abstract Introduction. Coffee (Coffea spp) is one of the most important crops worldwide, providing economic livelihood to millions of people in developing countries. There are more than 130 species of the Coffea genus, but only three species are commercially cultivated: Coffea arabica L. (2n=4x=44), Coffea canephora P. (2n=2x=22), and Coffea liberica L. (2n=2x=22). Which present limitations for their genetic improvement through conventional programs because of their perennial nature and differences in level of ploidy and incompatibility. Additionally, there are important characteristics such as resistance to pests or pathogens, which are not present in the available germplasm. Genetic engineering techniques have been used to solve this barrier, and significant advances have been generated during the last decades. Objective. The objective of this work was to provide an overview of the methodologies and advances in coffee genetic improvement through time, and ends with perspectives about the use of new technologies that have emerged in recent years. Development. The improvement began with the selection by crosses and interspecific backcrosses, to move to the selection assisted by molecular markers. Subsequently, the culture and fusion of protoplasts was reported, with the disadvantage in the regeneration process. Genetic engineering through physical (electroporation and biolistics), and biological techniques (A. tumefaciens and A. rhizogenes) helped to overcome the limitations of regeneration, although the optimization processes are still laborious, so, new technologies for editing genomes such as CRISPR-Cas9, can solve problems of time and work in the laboratory for the crop. Conclusion. The improvement of coffee began three decades ago and has progressed mainly since the beginning of transgenic technologies, and with the new techniques of specific modification of genes, the crop will benefit in the coming years.

El agua disponible a nivel celular así como la temperatura, afectan significativamente el crecimiento y desarrollo de las hortalizas ytambién influyen posteriormente en la etapa postcosecha, afectando su calidad y vida útil. En este sentido, el principal problemade la rúcula (Eruca sativa) es su rápido deterioro luego de su recolección, ocasionado principalmente por la pérdida de agua,provocando su marchitamiento. En este trabajo se evaluó, mediante un sistema modelo experimental, la influencia del estrésosmótico, en las propiedades superficiales de protoplastos aislados de nervaduras de hojas de rúcula. Se observó, en la superficie delos protoplastos aislados la formación de regiones hidrofóbicas cuando el volumen celular se incrementa, según se detectó medianteel empleo de la sonda Merocianina 540 (MC540). El análisis del equilibrio de las especies del colorante indica que la distribución demonómeros y dímeros de MC540 varía en cada estadío osmótico. Se sugiere que lo observado es una consecuencia de los cambiosproducidos en el empaquetamiento superficial a nivel de la membrana, debido a la afinidad de este colorante con los ambienteslipídicos, que podrían ser importantes para la interacción de enzimas y otros solutos producidos por las plantas durante el estréshídrico. Este análisis puede ser de importancia para predecir los cambios en el estado del cultivo bajo ciertas condiciones, causadaspor estreses bióticos y abióticos, y también para obtener información sobre los cambios que ocurren en la morfología a nivel celular,producidos en los diversos estadios de conservación de la rúcula. Por medio de la metodología aplicada sería posible comprendermejor los procesos involucrados, relacionándolos con los cambios macroscópicos, ampliando así las herramientas tecnológicas parael control de los procesos que afectan la calidad poscosecha de hortalizas Fil: Sain, Pablo Martin. Universidad Nacional de Santiago del Estero; Argentina. Consejo Nacional de Investigaciones Científicas y Técnicas. Centro Científico Tecnológico Conicet Noa Sur. Centro de Investigación en Biofísica Aplicada y Alimentos. - Universidad Nacional de Santiago del Estero. Centro de Investigación en Biofísica Aplicada y Alimentos; Argentina Fil: Rodriguez, Silvia del Carmen. Consejo Nacional de Investigaciones Científicas y Técnicas. Centro Científico Tecnológico Conicet Noa Sur. Centro de Investigación en Biofísica Aplicada y Alimentos. - Universidad Nacional de Santiago del Estero. Centro de Investigación en Biofísica Aplicada y Alimentos; Argentina. Universidad Nacional de Santiago del Estero; Argentina Fil: Disalvo, Edgardo Anibal. Universidad Nacional de Santiago del Estero; Argentina. Consejo Nacional de Investigaciones Científicas y Técnicas. Centro Científico Tecnológico Conicet Noa Sur. Centro de Investigación en Biofísica Aplicada y Alimentos. - Universidad Nacional de Santiago del Estero. Centro de Investigación en Biofísica Aplicada y Alimentos; Argentina

Conselho Nacional de Desenvolvimento Científico e Tecnológico Fundação de Amparo a Pesquisa do Estado de Minas Gerais Coordenação de Aperfeiçoamento de Pessoal de Nível Superior Em todas as aplicações, o teste de viabilidade e necessario para medir a taxa de protoplastos viáveis, possibiltando decidir os procedimentos de isolamento e purificação mais adequados e verificar se ha celulas suficientes para as etapas subsequentes. A microscopia de fluorescência geralmente é empregada para o teste de viabilidade. No entanto, alguns problemas têm sido apontados: longo tempo necessário para contar um número relativamente pequeno de protoplastos, aglomerados de células que impedem a observação dos protoplastos e percepção visual da fluorescência subjetiva ao observador. Este estudo teve como objetivo estabelecer procedimentos para teste de viabilidade adaptado para citometria de fluxo (FCM), MuseTM cell analyzer (Muse) e Ensaio cometa (CA). Para isso, Capsicum annuum foi escolhido devido a natureza morfogênica recalcitrante dos protoplastos. Após o isolamento e a purificação, as aplicações permitiram avaliar um grande número de protoplastos (FCM e MUSE) e núcleos dos protoplastos (CA) em um curto período de tempo. A partir das adaptações nos procedimentos, foram evidenciados diferentes tipos e níveis de danos citológicos (FCM e Muse) e genômicos (Muse e CA), possibilitando discriminar e mensurar os protoplastos viãveis. Considerando os resultados, este estudo introduz procedimentos quantitativos melhorados para o teste de viabilidade. Alem disso, visando a regeneração de plântulas, diferentes métodos podem ser aplicados para avaliar a viabilidade de protoplastos, definindo os procedimentos de isolamento e purificação mais adequados. Corraborando para este propósito, foram mostrados guias para FCM, Muse e CA visando a padronizaçao dos testes de viabilidade em protoplastos de plantas. Plant protoplasts are valuable in biotechnology, enabling the plantlet regeneration until the gene function determination. In all applications, viability test is required to measure the rate of viable protoplasts, allowing to decide on the most adequate isolation and purification procedures and to verify whether there are sufficient cells for subsequent steps. Fluorescence microscopy is usually employed for viability test. However, some problems have been pointed out: long time required to count a relatively small number of protoplasts, cell clumps preventing their observation, and the subjective visual perception of the fluorescence by observer. This study aimed to establish procedures for viability test adapted for flow cytometry (FCM), MuseTM cell analyzer (Muse) and Comet Assay (CA). For this, Capsicum annuum was chosen due to recalcitrant morphogenic nature of its protoplasts. After isolation and purification, the applications allowed assessing large numbers of protoplasts (FCM and MUSE) and protoplasts nuclei (CA) in a short time period. From the adjusted procedures, different types and levels of cytological (FCM and Muse) and genomic damages (Muse and CA) were evidenced, allowing to discriminate and measure the viable protoplasts. Considering the results, this study introduces improved quantitative procedures for viability test. Besides of these and aiming the plantlet regeneration, different methods can be applied to assess the protoplast viability, defining the more adequate isolation and purification procedures. Contributing with this purpose, guides were showed for FCM, Muse and CA to standardization of viability tests in plant protoplasts

La fresa(Fragaria x ananassa Duch.) es una planta cuyo fruto es muy apreciado y que está presente en la mayoría de las áreas cultivables del mundo, incluida España, y en particular Andalucía. En este trabajo, se han establecido las bases para abordar su mejora mediante métodos biotecnológicos.Inicialmente, se desarrolló un protocolo de regeneración, a partir de explantos de hoja, que incluye el precultivo en condiciones de oscuridad y posterior transferencia a condiciones de luz (40 µmol.m-2.s-1) en presencia de 2 mg.l-1 BA y 0,5 mg.l-1 AIB. Este protocolo ha permitido regenerar y plantas de los cvs. Chandler y Carisma, así como obtener material transformado. La evaluación, en invernadero, de 16 somaclones de Carisma, mostró la existencia de una gran variabilidad fenotípica; así, la mayoría de ellos tenían una superficie aérea inferior a la del control micropropagado; por otra parte, la capacidad de fructificación también fue muy variable y sólo la mitad de las líneas evaluadas mostraron una producción similar a la del control. La evaluación en invernadero de 26 líneas transgénicas independientes dió unos resultados similares a los obtenidos con el material regenerado no transgénico, lo que parece indicar que la variabilidad observada en líneas transgénicas tiene su base en el proceso de regeneración adventicia más que en el efecto de inserción del transgen. El protocolo desarrollado también se ha utilizado para obtener plantas del cv. Chandler transformadas con el gen Fxacad1 que codifica una cinamil alcohol deshidrogenasa, implicada en la síntesis de lignina y cuya expresión se ha relacionado con la firmeza del fruto de fresa. En la mayoría de las líneas se produjo una cosupresión del gen, alcanzándose niveles de silenciamiento en frutos maduros superiores al 90%, lo que no afectó al crecimiento de la planta ni, en general, a la calidad de los frutos. La firmeza de fruto fue ligeramente inferior al control en la mayoría de las líneas, si bien no se encontró correlación entre el nivel de expresión del gen Fxacad1 y la firmeza. Los resultados obtenidos no parecen indicar que Fxacad1 tenga un papel relevante en la textura del fruto de fresa, pudiendo estar involucrado en otros aspectos del proceso de maduración, como son los relacionados con el aroma. Finalmente, se ha optimizado un protocolo para la obtención y cultivo de protoplastos, así como para la regeneración de plantas, en el cultivar Chandler. El estado fisiológico de la fuente de material y la calidad de los protoplastos obtenidos son críticos, más importantes incluso que las propias condiciones de cultivo. Se ha observado una gran variabilidad morfológica en el material obtenido, tras la evaluación agronómica en condiciones de vivero y campo, fundamentalmente en hábito de crecimiento, capacidad de estolonado, número de foliolos en hoja, capacidad de fructificación y forma de frutos; sin embargo, el nivel de ploidía, cuantificado en algunos de los protoclones, siempre fue idéntico al del control, contrariamente a lo observado por Nyman y Wallin(1992,PCTOC,30:127-133); sin embargo, sí aparecieron diferencias a nivel de marcadores microsatélites. 2019-07-26

O presente trabalho visou a aplicação da β-1,3 glucanase lítica, obtida do microrganismo Cellulosimicrobium cellulans 191, na produção de protoplastos e na lise da parede celular de leveduras. A preparação bruta da enzima foi capaz de lisar as leveduras Kluyveromyces lodderi, Saccharomyces cerevisiae (Fleischmann e Itaiquara), S. cerevisiae KL-88, S. diastaticus NCYC 713, S. cerevisiae NCYC 1001, Candida glabrata NCYC 388, Kluyveromyces marxianus NCYC 587 e Hansenula mrakii NCYC 500. A β-1,3 glucanase purificada foi capaz de lisar as leveduras Saccharomyces cerevisiae KL-88, Saccharomyces capensis, Debaromyces vanriji, Pachysolen tannophillus, Kluyveromyces drosophilarum, Candida glabrata, Hansenula mrakii e Pichia membranaefaciens e formar protoplastos de Saccharomyces cerevisiae KL-88.The aim of this work was the application of lytic β-1,3 glucanase obtained from Cellulosimicrobium cellulans strain 191 in the production of protoplasts and lysis of yeast cell walls. The crude extract demonstrated lysis activity against the yeasts Kluyveromyces lodderi, Saccharomyces cerevisiae (Fleischmann and Itaiquara), S. cerevisiae KL-88, S. diastaticus NCYC 713, S. cerevisiae NCYC 1001, Candida glabrata NCYC 388, Kluyveromyces marxianus NCYC 587, and Hansenula mrakii NCYC 500. The purified β-1,3 glucanase demonstrated lysis activity against the yeasts Saccharomyces cerevisiae KL-88, Saccharomyces capensis, Debaromyces vanriji, Pachysolen tannophillus, Kluyveromyces drosophilarum, Candida glabrata, Hansenula mrakii, and Pichia membranaefaciens, and it was able to produce Saccharomyces cerevisiae KL-88 protoplasts.

This study concerned the production, purification and application of extracellular chitinase from Cellulosimicrobium cellulans strain 191. In shaken flasks the maximum yield of chitinase was 6.9 U/mL after 72 h of cultivation at 25ºC and 200 rpm. In a 5 L fermenter with 1.5 vvm aeration, the highest yield obtained was 4.19 U/mL after 168 h of fermentation at 25ºC and 200 rpm, and using 3 vvm, it was 4.38 U/mL after 144 h of fermentation. The chitinase (61 KDa) was purified about 6.65 times by Sepharose CL 4B 200 gel filtration with a yield of 46.61%. The purified enzyme was able to lyse the cell walls of some fungi and to form protoplasts.O presente estudo visou a produção, purificação e aplicação da quitinase extracelular da linhagem Cellulosimicrobium cellulans 191. A maior produção de quitinase em frascos agitados foi 6,9 U/mL após 72 h de fermentação a 25ºC e 200 rpm. Em fermentador de 5 L utilizando aeração de 1,5 vvm, a maior atividade da enzima foi 4,19 U/mL após 168 h de fermentação a 25ºC e 200 rpm; e com 3 vvm, foi obtido 4,38 U/mL após 144 h de fermentação. A quitinase (61 KDa) foi purificada cerca de 6,65 vezes em coluna de filtração em gel Sepharose CL 4B 200 com um rendimento de 46,61%. A enzima purificada foi capaz de lisar a parede celular de alguns fungos e formar protoplastos.

"En el 2011, una variante del begomovirus invasor Tomato yellow leaf curl virus-Israel (TYLCV-IL) se aisló de dos plantas colectadas en la Huasteca Potosina: una de Solanum pimpinellifolium coinfectada con el begomovirus nativo ToChLPV; y otra de Solanum lycopersicum coinfectada con el begomovirus, ToSLCV. Ésta variante, denominada TYLCV-IL [SLP], difiere de otras descritas a la fecha por dos alteraciones en la región intergénica del genoma: una deleción de 29 pb corriente arriba del elemento “tallo-asa” conservado, y la duplicación de un segmento de 42 pb corriente abajo del mismo elemento. Estas mutaciones podrían haber alterado las propiedades funcionales de los promotores divergentes y, eventualmente, las características patogénicas de TYLCV-IL. En el presente trabajo analizamos funcionalmente los promotores de los genes que codifican las proteínas Rep y CP de TYLCV-IL [SLP] y la variante no mutada TYLCV-IL [Sin]. Para esto se fusionaron los promotores virales al gen reportero GUS y se analizaron por medio de ensayos de expresión transitoria en protoplastos de tabaco. Los resultados experimentales revelaron que la actividad del promotor Rep de TYLCV-IL [SLP] es muy débil, más de 15 veces menor que la del promotor homólogo de TYLCV-IL [Sin]. La actividad de este último fue 6 veces mayor a la del promotor 35S de CaMV utilizado como control. En contraste, los promotores CP de las dos variantes de TYLCV-IL no mostraron diferencias significativas en su actividad. Un hallazgo adicional fue que el promotor Rep del virus co-infectante ToChLPV exhibe una actividad muy superior a la de TYLCV-IL [Sin] y otros begomovirus, por lo que tiene un potencial biotecnológico importante. La capacidad infectiva de TYLCV-IL [SLP] en ausencia de los begomovirus coinfectantes, se evaluó inoculando por agroinfiltración plantas de N. benthamiana. Todas las plantas desarrollaron síntomas y el genoma viral fue detectado por PCR en los tejidos jóvenes." "In 2011, a variant of the invader begomovirus Tomato yellow leaf curl virus Israel (TYLCV-IL) was isolated from two plants collected in the Huasteca: one of Solanum pimpinellifolium coinfected with native begomovirus ToChLPV; and other Solanum lycopersicum coinfected with begomovirus, ToSLCV. This variant, designated TYLCV-IL [SLP], differs from others described to date for two changes in the intergenic region of the genome: a deletion of 29 bp upstream of the conserved “stem-loop" element and duplication of a segment 42 bp downstream of the same element. These mutations may have altered the functional properties of the divergent promoters and eventually the pathogenic characteristics of TYLCVIL. In the present work we functionally analyze the promoters of the genes encoding Rep and CP proteins of TYLCV-IL [SLP] and the unmutated variant TYLCV-IL [SIN]. To this the viral promoters were fused to the GUS reporter gene and analyzed by transient expression assays in tobacco protoplasts. To this the viral promoters were fused to the GUS reporter gene and analyzed by transient expression assays in protoplasts snuff. The experimental results revealed that the promoter activity of Rep TYLCV-IL [SLP] is too weak, more than 15 times lower than the homologous TYLCV-IL promoter [SIN]. The Activity of the latter was 6 times higher than the CaMV 35S promoter used as a control. In contrast, the CP promoters of the two variants of TYLCV-IL showed no significant difference in their activity. An additional finding was that the Rep promoter of the co-infecting virus, ToChLPV exhibits a much higher activity than TYLCV-IL [Sin] and other begomoviruses, Therefore it has an important biotechnological potential. The infectivity of TYLCV-IL [SLP] in the absence of the co-infecting begomoviruses, was evaluated inoculating N. benthamiana plants by agroinfiltration. All the plants developed symptoms and viral genome was detected by PCR in young tissues."

Dissertação de Mestrado em Biodiversidade e Biotecnologia Vegetal, apresentada ao Departamento de Ciências da Vida da Faculdade de Ciências e Tecnologia da Universidade de Coimbra. O tamarilho (Solanum betaceum Cav.) é uma espécie arbórea de pequeno porte, pertencente à família Solanaceae, e que apresenta características económicas, nutricionais e biotecnológicas bastante interessantes. No entanto, as populações naturais desta espécie possuem uma baixa variabilidade genética, a qual não é possível ultrapassar sem a aliança entre as técnicas de manipulação genética e os métodos de melhoramento mais convencionais. Os protoplastos podem assim ser considerados como uma ferramenta importante para o melhoramento desta espécie, na medida em que constituem um passo prévio a várias técnicas de manipulação genética, nomeadamente hibridação somática (por fusão de protoplastos) e transformação genética. Recorrendo ao método “one factor at a time”, analisaram-se os principais factores que afectam tanto o rendimento como a viabilidade dos protoplastos obtidos a partir de diferentes explantes em cultura in vitro de tamarilho. Estes dois parâmetros são influenciados pelo estabilizador osmótico (neste caso em concreto, a sacarose), tipos de enzimas hidrolíticas e sua concentração, temperatura e duração da digestão enzimática e métodos de purificação dos protoplastos. O maior rendimento de protoplastos isolados a partir de explantes foliares foi conseguido através da solução K3 com sacarose a 0,4 M contendo celulase “Onozuka” R-10 a 2% (w/v) e macerozima R-10 a 0,5% (w/v). As condições de incubação enzimática com melhores respostas foram a 27 ºC overnight e 30 ºC durante 6 horas para as linhas diplóide e tetraplóide, respectivamente. A centrifugação por gradiente de densidade a 100 g durante 10 min. com obtenção de uma banda interfásica revelou-se o método de purificação dos protoplastos mais eficiente. Para estimar a viabilidade dos protoplastos recorreu-se ao corante de exclusão Evans blue, registando-se valores de protoplastos viáveis acima dos 50%. No entanto, apesar de a quantidade de protoplastos viáveis por grama de peso fresco ser considerável, ainda não foi possível regenerar plantas a partir de protoplastos colocados em meio de cultura. As condições óptimas para o isolamento e purificação de protoplastos de calli e tecidos embriogenicamente induzidos envolveram a digestão enzimática com a combinação de celulase a 1%, driselase a 0,2% e pectinase a 0,02% (w/v), em solução K3 com sacarose a 0,4 M, durante 20 – 22 horas a 25 ºC (para calo embriogénico) ou overnight a 27 ºC (calo não embriogénico e explantes embriogenicamente induzidos), seguida de purificação por sedimentação dos protoplastos num pellet, quando sujeito a uma centrifugação inicial de 100 g durante 10 min. O desenvolvimento de um protocolo eficiente de isolamento e purificação de protoplastos a partir de diferentes explantes permitiu a avaliação do rendimento possível de obter com a extracção de RNA total e a sua aplicabilidade em futuras análises transcriptómicas de populações específicas de células. Tamarillo (Solanum betaceum Cav.) is a small solanaceous tree with interesting economical, nutritional and biotechnological features. The low genetic variability observed in natural populations of tamarillo demands for the need for genetic manipulation techniques to circumvent this problem by complementing the more conventional methods of breeding. Plant protoplast technology can be considered an important tool for S. betaceum improvement because it can be a predecessor step for these genetic manipulation techniques, such as somatic hybridization (by protoplast fusion) and genetic transformation. Thus, the basis of this study was to determine the main factors affecting the isolation of protoplasts from different in vitro cultured tissues of tamarillo. Sucrose as the osmotic stabilizer, types of plant cell wall - degrading enzymes and their concentration, temperature and time of enzymatic incubation, and purification methods were evaluated in terms of their effects on protoplast yield and viability by using the “one factor at a time” method. Results showed that the highest leaf mesophyll protoplast yield was provided by 2% (w/v) cellulase “Onozuka” R-10 and 0.5% (w/v) macerozyme R-10 dissolved in 0.4 M sucrose – K3 solution. This enzymatic mixture was subjected to an overnight incubation at 27 ºC for diploid lines and to 6 h incubation at 30 ºC for tetraploid genotype. The density gradient centrifugation at 100 g for 10 min with the separation of an interphase band was the most effective protoplast purification method tested. The optimal conditions achieved for calli and embryogenic induced - derived protoplast isolation and purification involved an enzymatic digestion with a combination of 1% (w/v) cellulase “Onozuka” R-10, 0.2% (w/v) driselase and 0.02% (w/v) pectinase, also dissolved in 0.4 M sucrose – K3 solution, for a 20 - 22h incubation period at 25 ºC (embryogenic callus) or an overnight incubation at 27ºC (non-embryogenic callus and embryogenic induced explants), followed by centrifugation at 100 g for 10 min to pellet the protoplasts. Viability of protoplasts from leaf mesophyll and embryogenic callus was evaluating using Evans blue staining, with viable protoplasts over 50%. However, despite the high number of viable protoplasts, an efficient regeneration of plants from leaf mesophyll protoplasts was not yet achieved. The development of efficient protoplast isolation and purification protocols, from different explants allowed for the evaluation of the yield possible to achieve with a method for total RNA extraction in order to estimate the application of this technique in subsequent transcriptomic analysis of specific populations of cells.

O isolamento e regeneração de protoplastos de fungos é um passo fundamental para o estabelecimento de sistemas de transformação, análise do cariótipo molecular e fusão entre linhagens, que são técnicas de ampla aplicação em programas de melhoramento para fungos filamentosos. Neste trabalho foram testados diferentes preparações enzimáticas e estabilizadores osmóticos para estabelecer condições otimizadas de isolamento e regeneração de protoplastos de Penicillium brevicompactum, que é um excelente produtor de pectinases. Protoplastos de P. brevicompactum foram obtidos em maior quantidade quando o micélio foi digerido com 15mg.mL-1 de Glucanex (Novo Nordisk) em NaCl 0,8 mol.L-1 como estabilizador osmótico. O melhor estabilizador osmótico para a regeneração dos protoplastos foi KCl 0.8 mol.L–1 apresentando uma freqüência de regeneração de 36,58%. Esse protocolo pode ser utilizado em análises genéticas para essa espécie de Penicillium cujos estudos têm sido pouco reportadosThe isolation and regeneration of fungal protoplasts is a key step for the establishment of transformation systems, electrophoretic karyotype analysis and fusion between strains, all techniques of broad application on improvement programs of filamentous fungi. To establish conditions for the isolation and regeneration of ,em>Penicillium brevicompactum protoplasts, that is an excellent pectinase producer, different lytic enzymes and osmotic stabilizers were tested. P. brevicompactum protoplasts were obtained at a larger scale when their mycelium was digested with 15mg.mL-1 of Glucanex (Novo Nordisk) and 0.8 mol.L–1 NaCl as osmotic stabilizer. The best osmotic stabilizer for the regeneration of P. brevicompactum protoplasts was 0.8 mol.L–1 KCl, with a regeneration frequency of 36.58%. This protocol can be applied in genetic analysis of this Penicillium species which, to date has been poorly characterized

Este trabalho teve como objetivo a obtenção de híbridos somáticos entre o limão 'Cravo' (Citrus limonia Osbeck) e a tangerina 'Cleópatra' (Citrus reshni Hort.), para serem usados como porta-enxertos de citros. O limão 'Cravo' é atualmente o principal porta-enxerto comercial utilizado no Brasil, em virtude de suas boas qualidades agronômicas. Entretanto, é suscetível ao "declínio" dos citros, doença responsável pela eliminação anual de milhões de plantas cítricas no Brasil. A tangerina 'Cleópatra' é uma espécie bastante utilizada como porta-enxerto em outros países e tem sido descrita na literatura como tolerante ao "declínio". Protoplastos de suspensões celulares embriogênicas e protoplastos derivados de tecidos foliares foram utilizados para fusão com solução de PEG (50%) e posterior cultivo em agarose. A porcentagem de obtenção de células híbridas interespecíficas logo após a fusão, variou entre 5,1% e 6,8%. Foram obtidas mais de 500 plantas a partir de produtos de fusão cultivados em gotas de agarose. No total de 180 plantas avaliadas, 11 híbridos somáticos foram discriminados e confirmados, utilizando-se marcadores moleculares RAPD e isoenzimáticos (sistemas PO, IDH e PGI). Seis plantas foram aclimatizadas, plantadas no solo e estão sendo multiplicadas por estaquia para avaliação futura como porta-enxertos de citros. The aim of this work was to obtain somatic hybrids between 'Rangpur' lime (Citrus limonia Osbeck) and 'Cleópatra' mandarin (Citrus reshni Hort.), to be used as a citrus rootstock. 'Rangpur' lime is the most important Brazilian citrus rootstock due to its higher horticultural performance. Nevertheless, this species is susceptible to blight disease, which is responsible for the death of millions of productive trees per year in Brazil. 'Cleópatra' mandarin has become an increasingly important rootstock in other countries and has been reported as being tolerant to citrus blight disease. Leaf protoplasts and protoplasts from embryogenic cell suspension cultures were fused using PEG solution (50%) and further cultivation in agarose. The frequency of heterokaryon formation was 5.1% to 6.8%. More than 500 plants were regenerated from these fusion experiments and 180 were tested. Among them, 11 plants were confirmed to be a somatic hybrid by means of molecular markers (RAPD) and isoenzymes markers (PO, IDH and PGI systems). Six plants were acclimatized, planted in the soil and have been multiplied by cuttings in order to evaluate their potential as citrus rootstocks.

A tecnologia da cultura de protoplastos, células e tecidos de plantas in vitro constitui-se em uma das áreas de maior êxito na biotecnologia. No gênero Passiflora, poucas espécies têm sido utilizadas com fins biotecnológicos nos estudos de cultura de tecido. Do pouco já realizado, obteve-se sucesso na regeneração de brotos, por via indireta, a partir de calos, ou por via direta, a partir dos explantes cotiledonares, hipocotiledonares ou foliares. A regeneração in vitro é facilmente induzida em entrenós e segmentos de gavinha, com a adição de citocinina ao meio de cultivo. Recentes avanços na regeneração de protoplastos de outras frutíferas permitiram a aplicação da hibridização somática no maracujá. O uso da engenharia genética, aproveitando-se a habilidade de regeneração das plantas de P. edulis f. flavicarpa, torna-se relevante na tentativa de reduzir a devastação imposta por certas doenças e pragas, e também na adição de outras características de importância agronômica.

RESUMEN: Introducción: la capacidad antioxidante presente en las plantas ha despertado gran interés debido al potencial aprovechamiento en la alimentación para la prevención de enfermedades asociadas a estrés oxidativo. Objetivo: evaluar el efecto de la inducción con CuCl2 y Paraquat® (dicloruro de 1,1'-dimetil-4,4'-bipiridilo) sobre protoplastos y plántulas de las especies relacionadas de tomate, Lycopersicon hirsutum Dunal y Lycopersicon esculentum Mill. Métodos: la producción de especies reactivas de oxígeno se evaluó mediante citometría de flujo en protoplastos de las 2 especies de tomate, inducidos con CuCl2 y Paraquat® (dicloruro de 1,1'-dimetil-4,4'-bipiridilo). Adicionalmente, sobre las plántulas se evaluó el contenido de polifenoles totales y la capacidad atrapadora de radicales libres. Resultados: la inducción con Paraquat® durante eventos tempranos mostró un aumento en la producción de especies reactivas de oxígeno en 17,4 veces en protoplastos de Lycopersicon hirsutum y de 12,4 veces en Lycopersicon esculentum con respecto a sus respectivos controles no tratados. La especie Lycopersicon esculentum presentó velocidades de producción significativas de contenido de polifenoles totales y capacidad atrapadora de radicales libres con valores de 1,81 Eq ácido gálico hora-1 y 5,3 % de decoloración del DPPH hora-1, respectivamente. Durante la inducción con Paraquat® se observó una correlación entre contenido de polifenoles totales y capacidad atrapadora de radicales libres cercana a 1 y altamente significativa, en respuesta a los 2 tipos de inducción durante los eventos tempranos.Conclusiones: los resultados sugieren que la biosíntesis de compuestos fenólicos y la correlación con la capacidad atrapadora de radicales libres, no necesariamente se encuentra relacionada con una actividad antioxidante como un mecanismo de defensa a nivel celular. ABSTRACT: Introduction: the antioxidant capacity in plants has aroused great interest due to their potential use in food for the prevention of oxidative stress-associated diseases. Objectives: to evaluate the effect of CuCl2 and Paraquat® induction on protoplasts and tomato seedlings belonging to Lycopersicon hirsutum Dunal and Lycopersicon esculentum Mill. species. Methods: the production of reactive oxygen species in protoplasts of tomato both species after exposure to CuCl2 and Paraquat® (1.1'-dimethyl-4.4'-bipiridyl dichloride) was evaluated by flow cytometry. Tomato seedlings were evaluated for total polyphenol content and free radical scavenging. Results: Paraquat® induction showed a 17.4 fold increase in reactive oxygen species production for L. hirsutum protoplasts and a 12.4 fold for L. esculentum during early events with respect to their respective untreated controls. L. esculentum showed significant slopes for free radical scavenging and total polyphenol content: 1.81 galic acid eq per hour and 5.3 % DPPH discoloration per hour, respectively. In addition, in response to the two kinds of induction, positive slopes and a correlation between total polyphenol content and free radical scavenging were observed with copper induction (correlation close to 1 and highly significant), but not significant models during Paraquat® induction. Conclusions: these results suggest that the biosynthesis of phenolic compounds and the correlation with the free radical scavenging are not necessarily related to antioxidant activity as a cellular defense mechanism. COL0007462

A obtenção de protoplastos de fungos, utilizando-se enzimas degradadoras de parede celular, tem sido o método mais utilizado em processos de transformação genética. Foram testados dois tipos de estruturas fúngicas (micélio e conídios), diferentes concentrações enzimáticas (5, 10, 20 mg), estabilizadores osmóticos (NaCl 0,7 mol.L-1 pH 5,7; (NH4)2SO4 1,2 mol.L-1 pH 5,8; KCl 0,7 mol.L-1 pH 5,8; MgSO4 0,7 mol.L-1 pH 5,5; Sacarose 0,5 mol.L-1 pH 5,7; SorbitoL 0,6 mol.L-1 pH 5,7) e seis tempos de exposição dos protoplastos ao sistema lítico, para estabelecer condições otimizadas de obtenção e regeneração de protoplastos de Colletotrichum gloeosporioides, agente relacionado a mancha manteigosa em cafeeiros. Protoplastos de C. gloeosporiodes foram obtidos em maior quantidade quando o micélio foi exposto durante 4 horas, com 10 mg.mL-1 de Lysing Enzime em KCl 0,7 mol.L-1 que se apresentou como melhor estabilizador osmótico, com frequência de regeneração de 11,64%.

Estudou-se a viabilidade de protoplastos de laranja 'Pêra' (Citrus sinensis Osbeck), submetidos a diferentes doses de radiação gama, com a finalidade de determinar a dose letal (DL) 50 - dose que causa 50% de letalidade. Empregou-se a análise por fluorescência, utilizando-se o corante diacetato de fluoresceína (DAF): suas diluições testadas - 1:50; 1:100 e 1:150 - não mostraram diferenças significativas entre si, tendo sido possível o uso da maior diluição para a determinação da viabilidade dos protoplastos. A viabilidade mostrou-se inversamente proporcional às doses de radiação gama e a DL 50 foi cerca de 41 Gy. Os protoplastos não irradiados apresentaram até 84% de viabilidade, quando esta foi estudada logo após o isolamento daqueles.The viability of 'Pera' orange (Citrus sinensis Osbeck) protoplasts, submitted to different dosages of Gamma radiation, was studied to determine the lethal dose (DL) 50. The analysis by fluorescence was employed using Fluorescein diacetate (FDA). The dilutions of FDA (1:50; 1:100 and 1:150) did not show any statistical difference: Then it was possible to use the 1:150 dilution in order to determine the protoplasts viability. The viability was inversaly proportional to Gamma radiation and the DL 50 was about 41 Gy. The non-irradiated protoplasts had their viability up to 84% when tested as soon after their isolation.

O presente trabalho visou a aplicação da β-1,3 glucanase lítica, obtida do microrganismo Cellulosimicrobium cellulans 191, na produção de protoplastos e na lise da parede celular de leveduras. A preparação bruta da enzima foi capaz de lisar as leveduras Kluyveromyces lodderi, Saccharomyces cerevisiae (Fleischmann e Itaiquara), S. cerevisiae KL-88, S. diastaticus NCYC 713, S. cerevisiae NCYC 1001, Candida glabrata NCYC 388, Kluyveromyces marxianus NCYC 587 e Hansenula mrakii NCYC 500. A β-1,3 glucanase purificada foi capaz de lisar as leveduras Saccharomyces cerevisiae KL-88, Saccharomyces capensis, Debaromyces vanriji, Pachysolen tannophillus, Kluyveromyces drosophilarum, Candida glabrata, Hansenula mrakii e Pichia membranaefaciens e formar protoplastos de Saccharomyces cerevisiae KL-88. The aim of this work was the application of lytic β-1,3 glucanase obtained from Cellulosimicrobium cellulans strain 191 in the production of protoplasts and lysis of yeast cell walls. The crude extract demonstrated lysis activity against the yeasts Kluyveromyces lodderi, Saccharomyces cerevisiae (Fleischmann and Itaiquara), S. cerevisiae KL-88, S. diastaticus NCYC 713, S. cerevisiae NCYC 1001, Candida glabrata NCYC 388, Kluyveromyces marxianus NCYC 587, and Hansenula mrakii NCYC 500. The purified β-1,3 glucanase demonstrated lysis activity against the yeasts Saccharomyces cerevisiae KL-88, Saccharomyces capensis, Debaromyces vanriji, Pachysolen tannophillus, Kluyveromyces drosophilarum, Candida glabrata, Hansenula mrakii, and Pichia membranaefaciens, and it was able to produce Saccharomyces cerevisiae KL-88 protoplasts.

This study concerned the production, purification and application of extracellular chitinase from Cellulosimicrobium cellulans strain 191. In shaken flasks the maximum yield of chitinase was 6.9 U/mL after 72 h of cultivation at 25ºC and 200 rpm. In a 5 L fermenter with 1.5 vvm aeration, the highest yield obtained was 4.19 U/mL after 168 h of fermentation at 25ºC and 200 rpm, and using 3 vvm, it was 4.38 U/mL after 144 h of fermentation. The chitinase (61 KDa) was purified about 6.65 times by Sepharose CL 4B 200 gel filtration with a yield of 46.61%. The purified enzyme was able to lyse the cell walls of some fungi and to form protoplasts. O presente estudo visou a produção, purificação e aplicação da quitinase extracelular da linhagem Cellulosimicrobium cellulans 191. A maior produção de quitinase em frascos agitados foi 6,9 U/mL após 72 h de fermentação a 25ºC e 200 rpm. Em fermentador de 5 L utilizando aeração de 1,5 vvm, a maior atividade da enzima foi 4,19 U/mL após 168 h de fermentação a 25ºC e 200 rpm; e com 3 vvm, foi obtido 4,38 U/mL após 144 h de fermentação. A quitinase (61 KDa) foi purificada cerca de 6,65 vezes em coluna de filtração em gel Sepharose CL 4B 200 com um rendimento de 46,61%. A enzima purificada foi capaz de lisar a parede celular de alguns fungos e formar protoplastos.

Fundação de Amparo a Pesquisa do Estado de Minas Gerais Gene expression in the ectomycorrhizal fungus Hydnangium sp. during the pre-symbiotic interaction was evaluated using an in vitro mycorrhization technique aiming at constructing a suppressive subtractive cDNA library. The fungus was cultivated in the presence of Eucalyptus grandis roots, with no direct physical contact between both organisms. Genes that code for putative proteins involved in carbohydrate, amino acid, and energy metabolism, transcription and protein synthesis, cellular communication, signal transduction, stress defense, transposons, and proteins related to the biogenesis of cell components were identified. The expression of genes that code for pyruvate dehydrogenase, ATP synthase, a voltage-dependent ion-selective channel, acetyl-CoA acetyl transferase, and hydrophobin was evaluated by quantitative RT-PCR. The differential expression of these genes during the pre-symbiotic interaction confirmed the activation of genes related to beta-oxidation and mitochondrial metabolism, besides validating the suppressive subtractive library obtained. The construction of the subtractive library of Hydnangium sp. will make possible the study of different genes related to mycorrhization, facilitating our understanding of the molecular mechanisms involved in the ectomycorrhizal association. For Hydnangium sp., transformation in the presence of PEG/CaCl2 was necessary to optimize the conditions for the formation and regeneration of protoplasts. The highest production of protoplasts of Hydnangium sp., 1.06 x 107 protoplasts/mL, was obtained after two hours in KCl 0.6 M, in the presence of 20 mg/mL of "Lysing Enzymes" and 0.3 g of two- day old mycelium. For protoplast regeneration, the effects of different osmotic stabilizers, agar concentrations in MNM medium and length of incubation in the hydrolytic preparation were tested. So far, none of the conditions tested allowed the regeneration of Hydnangium sp. protoplasts. For the transformation of Hydnangium sp. mediated by Agrobacterium tumefaciens, several parameters were tested. No transformants were obtained and this was partly explained by the inhibitory effect of Hydnangium sp. on the agrobacteria tested. The transformation of the ectomycorrhizal fungus Laccaria laccata mediated by A. tumefaciens was established with an efficiency 32.6%. The integration of the gene hph in the genome of the transformants was confirmed by the detection of a 690-pb DNA fragment with the expected size. For mutant selection, transformants with only one copy of T-DNA inserted in the genome will be tested for the capacity to form ectomycorrhizas. A expressão de genes do fungo ectomicorrízico Hydnangium sp. na fase pré-simbiótica foi avaliada utilizando-se a técnica de micorrização in vitro visando a construção de uma biblioteca subtrativa supressiva de cDNA. O fungo foi cultivado na presença de raízes de Eucalyptus grandis, sem, no entanto, haver contato direto das hifas com o sistema radicular da planta hospedeira. Foram identificados genes que codificam possíveis proteínas relacionadas com o metabolismo de carboidratos, de aminoácidos e energético, transcrição e síntese de proteínas, comunicação celular, transdução de sinal, resposta a estresse, transposons e proteínas relacionadas à biogênese de componentes celulares. A expressão dos genes que codificam piruvato desidrogenase, ATP sintase, proteína do canal seletivo de íon dependente de voltagem, acetil-CoA acetiltransferase e hidrofobina foi avaliada por RT-PCR quantitativo. A expressão diferencial destes genes durante a fase pré-simbiótica confirmou a ativação dos genes relacionados à beta-oxidação e ao metabolismo mitocondrial, além de validar a biblioteca subtrativa supressiva construída. A construção da biblioteca subtrativa de Hydnangium sp. possibilitará o estudo de diferentes genes relacionados à micorrização, auxiliando o entendimento dos mecanismos moleculares envolvidos na associação ectomicorrízica. Para a transformação de Hydnangium com PEG/CaCl2 foi necessário otimizar as condições de obtenção e regeneração de protoplastos. A maior produção de protoplastos, 1,06 x 107 protoplastos/mL, foi obtida após duas horas em KCl 0,6 M, na presença de 20 mg/mL da preparação hidrolítica Lysing Enzymes e 0,3 g de micélio fúngico com dois dias de idade. Para regeneração de protoplastos foram testados diferentes estabilizadores osmóticos, concentrações de ágar no meio MNM e tempos de incubação da preparação hidrolítica. Entretanto, até o presente momento, não foram estabelecidas as condições que permitissem a regeneração dos protoplastos de Hydnangium sp. Para o estabelecimento da transformação de Hydnangium sp. mediada por Agrobacterium tumefaciens vários parâmetros foram testados, mas não foi possível a transformação desse fungo. Uma das razões desse insucesso pode ser devido a inibição da agrobactérias testadas pelo Hydnangium sp. A transformação do fungo ectomicorrízico Laccaria laccata mediada por A. tumefaciens foi estabelecida com uma eficiência de transformação de 32,6 %. A integração do gene hph no genoma das linhagens transformantes foi confirmada pela detecção de um fragmento de DNA de 690 pb que corresponde ao tamanho esperado. Os transformantes, com cópia única do T-DNA inserida no genoma, serão testados quanto à capacidade de formar micorrizas, visando a seleção de mutantes.

The isolation and regeneration of fungal protoplasts is a key step for the establishment of transformation systems, electrophoretic karyotype analysis and fusion between strains, all techniques of broad application on improvement programs of filamentous fungi. To establish conditions for the isolation and regeneration of ,em>Penicillium brevicompactum protoplasts, that is an excellent pectinase producer, different lytic enzymes and osmotic stabilizers were tested. P. brevicompactum protoplasts were obtained at a larger scale when their mycelium was digested with 15mg.mL-1 of Glucanex (Novo Nordisk) and 0.8 mol.L–1 NaCl as osmotic stabilizer. The best osmotic stabilizer for the regeneration of P. brevicompactum protoplasts was 0.8 mol.L–1 KCl, with a regeneration frequency of 36.58%. This protocol can be applied in genetic analysis of this Penicillium species which, to date has been poorly characterized O isolamento e regeneração de protoplastos de fungos é um passo fundamental para o estabelecimento de sistemas de transformação, análise do cariótipo molecular e fusão entre linhagens, que são técnicas de ampla aplicação em programas de melhoramento para fungos filamentosos. Neste trabalho foram testados diferentes preparações enzimáticas e estabilizadores osmóticos para estabelecer condições otimizadas de isolamento e regeneração de protoplastos de Penicillium brevicompactum, que é um excelente produtor de pectinases. Protoplastos de P. brevicompactum foram obtidos em maior quantidade quando o micélio foi digerido com 15mg.mL-1 de Glucanex (Novo Nordisk) em NaCl 0,8 mol.L-1 como estabilizador osmótico. O melhor estabilizador osmótico para a regeneração dos protoplastos foi KCl 0.8 mol.L–1 apresentando uma freqüência de regeneração de 36,58%. Esse protocolo pode ser utilizado em análises genéticas para essa espécie de Penicillium cujos estudos têm sido pouco reportados

Dissertação (mestrado) - Universidade Federal de Santa Catarina, Centro de Ciências Agrárias. Programa de Pós-Graduação em Recursos Genéticos Vegetais. No Brasil, a produção de maçãs está concentrada na região sul do país, e o Estado de Santa Catarina é responsável por cerca de 50% da oferta nacional. A cultura da macieira apresenta um panorama de crescimento com resultados altamente positivos nos últimos 30 anos. Porém, para a manutenção destes índices, os porta-enxertos devem ser adaptados às regiões de cultivo e ser resistentes aos principais problemas fitossanitários da cultura. Entretanto, os programas de melhoramento genético via hibridação sexual encontram limitações devido às características reprodutivas da macieira. A tecnologia de protoplastos para a hibridação somática constitui-se numa alternativa para contornar estas barreiras. Este trabalho teve como objetivo estabelecer um protocolo eficiente de isolamento e cultivo de protoplastos de porta-enxertos de macieira M9 e Marubakaido, visando à hibridação somática. Uma série de experimentos foi realizada avaliando-se diferentes meios de cultura para a calogênese, metodologias de isolamento e formas de cultivo de protoplastos. Para a calogênese de folhas do cultivo in vitro dos dois porta-enxertos o meio MS com 30g.L-1 de sacarose, 17,76µM de BAP e 1,00µM de 2,4-D promoveu o maior índice de formação de calos compactos. Quando este meio suplementado com 30g.L-1 de maltose, ao invés de sacarose ocorreu a regeneração por organogênese direta dos explantes do porta-enxerto M9. Para a calogênese de nucelos dos dois porta-enxertos obteve-se uma alta percentagem de oxidação e não houve a formação de calos friáveis. Para a calogênese de anteras do porta-enxerto M9 o meio NN suplementado com 30g.L-1 de sacarose, 4,52 M de 2,4-D, 2,85 M de AIA e 4,56 M de KIN promoveu o maior índice de formação de calos friáveis, possibilitando o estabelecimento de suspensões celulares. Para o isolamento de protoplastos de mesofilo foliar de ambos os porta-enxertos e de calos e suspensões de anteras do porta-enxerto M9, o uso do meio KM para diluição da solução enzimática aliado ao tempo máximo de digestão de 8 horas, proporcionaram os maiores rendimentos e viabilidade dos protoplastos para todas as fontes de protoplastos avaliadas neste trabalho. O cultivo dos protoplastos em meio líquido resultou nos maiores valores de viabilidade promoveu os resultados mais consistentes, sendo esta considerada a fonte de explante mais promissora para futuros trabalhos. Os progressos alcançados neste estudo são pioneiros no Brasil para estes genótipos e os resultados obtidos contribuíram com informações técnicas relevantes que servem como base para os futuros estudos nesta área

Conselho Nacional de Desenvolvimento Científico e Tecnológico O objetivo deste trabalho foi padronizar as condições de obtenção e regeneração de protoplastos de Epulorhiza repens e Ceratorhiza sp. e determinar o cariótipo eletroforético de Ceratorhiza sp. Para o fungo Epulorhiza repens, a maior produção de protoplastos, 8,0 x 10 6 protoplastos/mL, foi obtida em KCl 0,6 M, na presença de 15 mg/mL de “Lysing Enzymes” e 0,5 g de micélio fúngico com 2 dias idade, após fragmentação em liquidificador. A maior freqüência de regeneração obtida foi de 8,5 % quando sacarose 0,5 M foi utilizada como estabilizador osmótico. Do total de protoplastos obtidos, 58,6 % eram uninucleados, 21,4 % binucleados e 20 % anucleados. Para o fungo Ceratorhiza sp., a maior produção de protoplastos, 4,0 x 10 7 protoplastos/mL, foi obtida em NaCl 0,6 M, na presença de 15 mg/mL de “Lysing Enzymes” e 15mg/mL de Glucanex, 0,5 g de micélio fúngico com 2 dias de idade, após fragmentação em liquidificador. A maior freqüência de regeneração obtida foi de 6,7 % utilizando sacarose 0,5 M como estabilizador osmótico. Do total de protoplastos obtidos, 61 % eram uninucleados, 24,6 % binucleados, 3,2 % trinucleados e 11,2 % anucleados. O cariótipo eletroforético do fungo Ceratorhiza sp. apresentou no mínimo, 3 cromossomos cujos tamanhos foram estimados em 4,6; 3,5 e 2,2 Mb. A maior intensidade da banda de 4,6 Mb sugere que esta possa estar representando dois cromossomos, sendo o tamanho do genoma estimado em pelo menos 14,9 Mb. O estabelecimento de protocolos otimizados para obtenção e regeneração de protoplastos dos fungos Epulorhiza repens e Ceratorhiza sp. é importante, permitindo o estabelecimento de técnicas de transformação genética, o isolamento de mutantes, a determinação de cariótipo eletroforético e o cruzamento de linhagens. O cariótipo de Ceratorhiza sp. é importante para a determinação do número e do tamanho dos cromossomos, para se estimar o tamanho do genoma e a localização de genes relacionados à formação de micorrizas. This study was conducted in order to standardize the formation conditions and regeneration of Epulorhiza repens and Ceratorhiza sp. protoplasts and also to determine the electrophoretic karyotype of Ceratorhiza sp. For Epulorhiza repens, the highest production of protoplasts, 8,0 x 10 6 protoplasts/mL, was obtained in KCl 0,6 M, with 15 mg/mL of “Lysing Enzymes” and 0,5 g of mycelium at 2 days, after fragmentation in the liquefier. The best regeneration frequency, 8,5 %, was achieved when sucrose 0,5 M was used as an osmotic stabilizer. From total protoplasts obtained, 58,6 % were uninucleate, 21,4 % binucleate and 20 % anucleate. For Ceratorhiza sp. the highest production of protoplasts, 4,0 x 10 7 protoplasts/mL, was obtained in NaCl 0,6 M, with 15 mg/mL of “Lysing Enzymes” and 15 mg/mL of Glucanex, and 0,5 g of mycelium at 2 days, after fragmentation in the liquefier. The best regeneration frequency, 6,7 %, was achieved when sucrose 0,5 M was used as an osmotic stabilizer, and from total protoplasts obtained, 61 % were uninucleate, 24,6 % binucleate, 3,2 % trinucleate and 11,2 % anucleated. The electrophoretic karyotype of Ceratorhiza sp. showed at least 3 chromosomes around 4,6; 3,5 and 2,2 ixMb. The highest intensity of the band 4,6 Mb suggests that it represents two chromosomes, and the genome height was estimated in, at least, 14,9 Mb. It is important to establish optimized protocols for obtaining and regenerating protoplasts of Epulorhiza repens and Ceratorhiza sp. to allow the establishment of techniques of genetic transformation, mutant isolation, electrophoretic karyotype determination and crossings between strains. Ceratorhiza sp. karyotype is important to determine chromosomes number and height, to estimate genome height and gene localization related to mycorrhizas formation.

En este trabajo se ajustaron las condiciones para la regeneración de plántulas a partir del cultivo de protoplastos, proceso indispensable para avanzar hacia la obtención de híbridos somáticos. Se realizó el aislamiento de protoplastos a partir de cotiledones y hojas de plántulas in vitro de Passiflora edulis var. flavicarpa; estos explantes fueron sumergidos en solución CPW13M para inducir plasmólisis. Posteriormente se ensayaron tres combinaciones enzimáticas, los mayores rendimientos fueron 6,48 x 106 y 4,60 x 106 protoplastos viables /500 mg de tejido, obtenidos respectivamente con lacombinación de Celulasa R-10 al 1% y Pectolyasa Y-23 al 0,05% a partir de hojas y la solución enzimática Celulasa al 2% y Macerozima al 0,4% para cotiledones. Las mejores densidades de cultivo para los protoplastos fueron 5 x 104 protoplastos/ml para los obtenidos de cotiledones y 1,5 x 105 protoplastos/ml para los aislados de hojas, empleando el sistema de cultivo en gotas de medio KM8p solidificadas con agarosa al 0,6% y recubiertas con medio líquido KM8p con 100 g/l de glucosa y cefotaxim 300 μg/ml. Con las primeras divisiones celulares, se empezó a disminuir el nivel osmótico al renovar el medio líquido con la mezcla de medio KM8p:KM8 en proporción 3:1 y se continuó cada siete días en proporciones 2:1, 1:1 y 1:3 hasta la obtención de colonias y callos. Los callos fueron transferidos a medio MS con 2 mg/l de BAP y 1 mg/l de AIB para inducir la regeneración en condiciones de iluminación; después de seis semanas de cultivo se diferenciaron yemas, posteriormente fueron subcultivadas a medio MS sin reguladores de crecimiento para su enraizamiento. In this research we adjust the protoplasts culture and regeneration conditions, necessary to advance into somatic hybrids obtention. Isolation of Passiflora edulis var. flavicarpa protoplasts from in vitro seedlings cotyledons and leaves was carried out. These tissues were plasmolysed in a CPW13M solution, then exposed to enzymatic solutions. The better yields were 6,48 x 106 and 4,60 x 106 protoplasts/500 mg of tissue, reached with the mixture Cellulase R-10 1% and Pectolyase Y-23 0,05% from leaves, and the enzymatic solution Cellulase 2% and Macerozyme 0,4% from cotyledons tissue, respectively. The best densities for protoplasts culture were 5 x 104 protoplasts/ml obtained from cotyledons and 1,5 x 105 protoplast/ml from leaves, employing agarose droplets system, bathing by KM8p liquid media with glucose 100g/l and cefotaxime 300μg/ml. When first cell divisions occurred, the osmotic concentration was reduced by removing the liquid media and adding equal volume of fresh mix media KM8p:KM8 in a ratio of 3:1. Every seven days, this action was repited using mix media in ratios of 2:1, 1:1, and 1:3, until colonies and callus formation was achieved. Then, the call were transferred into MS media with BAP 2 mg/l and IBA 1 mg/l for plant regeneration on light conditions. After six weeks shoot differentiation was promoved, finally those shoots were subcultured to free regulators media for rooting.

A tecnologia da cultura de protoplastos, células e tecidos de plantas in vitro constitui-se em uma das áreas de maior êxito na biotecnologia. No gênero Passiflora, poucas espécies têm sido utilizadas com fins biotecnológicos nos estudos de cultura de tecido. Do pouco já realizado, obteve-se sucesso na regeneração de brotos, por via indireta, a partir de calos, ou por via direta, a partir dos explantes cotiledonares, hipocotiledonares ou foliares. A regeneração in vitro é facilmente induzida em entrenós e segmentos de gavinha, com a adição de citocinina ao meio de cultivo. Recentes avanços na regeneração de protoplastos de outras frutíferas permitiram a aplicação da hibridização somática no maracujá. O uso da engenharia genética, aproveitando-se a habilidade de regeneração das plantas de P. edulis f. flavicarpa, torna-se relevante na tentativa de reduzir a devastação imposta por certas doenças e pragas, e também na adição de outras características de importância agronômica. The technology of cells, protoplast and tissue culture of plants is one of the most successful biotechnological areas. In the genus Passiflora, a few species have been used with biotechnological ends on the studies concerning tissue cultures. Regeneration of shoots can be indirect, from callus, or direct, by cotiledonary, hipocotiledonary and leaf explants. It is easy to induce in vitro regeneration of internodes and axillary tendrils if cytokinin is added to the culture medium. Early advances in the regeneration of other fruit tree protoplasts have allowed the use of the somatic hybridization process in the passion fruit. Since P. edulis f. flavicarpa has a natural regeneration ability, the application of genetic engineering techniques becomes necessary in order to reduce the infestation by some diseases or insects, and to add relevant agricultural properties to this species.

Com o objetivo de estudar a cinética da despolimerização dos microtúbulos e a dinâmica da indução de micronúcleos, usaram-se dois herbicidas com ação antimitótica, amiprofós-metil (APM) e oryzalin (ORY), em células de Helianthus maximiliani. A aplicação de ambos os herbicidas em células com ativo crescimento resultou num elevado número de células com micronúcleos, em virtude das modificações mitóticas causadas pela ausência de microtúbulos. Primeiramente, cromossomos isolados ou grupos de 2 ou mais cromossomos espalharam-se pelo citoplasma. Duas a três horas após a aplicação dos herbicidas, os microtúbulos, estavam despolimerizados e os cromossomos metafásicos condensaram-se, formando diretamente os micronúcleos sem ter havido a divisão do centrômero e a separação das cromátides. A concentração mais eficiente de ORY foi 20 µM, ao passo que para APM foi 60 µM, para um período de incubação de 36 e 48 h respectivamente. O prolongamento do período de tratamento elevou a freqüência de micronúcleos deformados, bem como aumentou a morte celular. A adição de citocalasina-B (CB) (20 µM), após 24 h da aplicação dos herbicidas, aumentou significativamente a micronucleação e estabilização dos micronúcleos nas células. O controle dos microtúbulos de células em suspensão torna-se uma ferramenta eficiente para a indução de micronúcleos, bem como representa um método elegante para a transferência genômica parcial. In order to verify the kinetics of microtubule depolymerization and dynamics of micronuclei induction, two anti-mitotic herbicides, Amiprophos-methyl (APM) and Oryzalin (ORY), were added to dividing cells of Helianthus maximiliani. The addition of both herbicides to actively dividing cells resulted in a high number of cells with micronuclei through modification of mitosis. Single chromosomes and groups of 2 or more chromosomes were scattered over the cytoplasm. After 2-3 h of herbicide application, microtubules were depolymerized and the metaphase chromosomes changed directly into micronuclei, without centromere division and chromatid separation. The most efficient concentrations were 20 µM ORY and 60 µM APM when incubated for 36 and 48 h, respectively. When the treatment duration was increased, the frequency of cells with deformed micronuclei as well as cell death increased. The presence of citochalasina-B (CB) (20 µM) after 24 h of herbicide application increased the frequency of micronucleation and stabilization of the micronuclei in the cells significantly. The control of microtubules using anti-mitotic toxins provides an efficient tool for micronuclei induction as well as representing an elegant method for partial genome transfer.

Este trabalho descreve uma metodologia para a regeneração de plantas de tangerina 'Cleópatra' e limão 'Cravo', a partir do cultivo de protoplastos de suspensão celular. Para tal, calos nucelares foram induzidos em meio contendo BAP e cultivados em meio sem reguladores de crescimento. Protoplastos foram isolados de suspensões celulares e cultivados em gotas de agarose, com densidade de 2 X 105 protoplastos.ml-1. O meio MT, contendo ácido giberélico e água de coco, foi eficiente na germinação de embriões somáticos. Os métodos de aclimatação de plantas testados apresentaram baixa eficiência. Como resultado final, 17 plantas adaptadas de tangerina e 8 de limão foram obtidas. The present research describes the regeneration of 'Cleópatra' mandarin and 'Rangpur' lime plants from cell suspension protoplasts. Nucelar calli were induced on a medium containing BAP and maintained on growth regulator free medium. Protoplasts were isolated from embryogenic suspension and plated at a concentration of 2 X 105 protoplasts.ml-1, on agarose droplets. The MT medium with gibberellic acid and coconut water was efficient to stimulate somatic embryo conversion. Rooted plants acclimation had low efficiency. Seventeen mandarin plants and eight lime plants were obtained.

Orientador: Ione Salgado Martins Dissertação (mestrado) - Universidade Estadual de Campinas, Instituto de Biologia Resumo: Protoplastos isolados a partir de cultura de células de Citrus sinensis em suspensão foram utilizados como modelo experimental para o estudo do transporte e da homeostase de em células vegetais. Fluxos de 'Ca POT. 2¿ Foram acompanhados por observação das alterações de 'Ca POT. 2¿ livre do meio, utilizando se o indicador de 'Ca POT. 2¿ arsenazo III que é sensível a baixas concentrações desse íon. Alterações na concentração de Ca2+citoss61ico foram acompanhadas por microscopia confocal de fluorescência, utilizando-se o indicador de 'Ca POT. 2¿ fluorescente, indo-1. Protoplastos incubados na presença de 20 'mu¿M de 'Ca POT. 2¿ livre apresentaram-se praticamente inativos para a captação do íon, uma vez que a baixa concentração externa de 'Ca POT. 2¿ não foi suficiente para gerar um gradiente capaz de impulsionar a entrada do íon na celula. Entretanto, quando o 'Ca POT. 2¿ foi removido do meio por adição de EGTA , o efluxo de 'Ca POT. 2¿ foi estimulado por antagonistas de calmodulina como trifluoperazina (TFP), clorpromazina (CP) e calmidazolium, de uma maneira dose-dependente. A eficiência com que os diferentes antagonistas de calmodulina induziram o efluxo de Ca2+ em protoplastos de C. sinensis indicaram que este processo foi resultante de um efeito inespecífico na membrana dos protoplastos e não devido a uma ação anticalmodulina ...Observação: O resumo, na íntegra, poderá ser visualizado no texto completo da tese digital Abstract: Isolated protoplasts from suspension-cultured Citrus sinensis cells were used as an experimental model for the study of the 'Ca POT. 2¿ transport and homeostasis in plant cells. 'Ca POT. 2¿ fluxes were accompanied through the medium free 'Ca POT. 2¿ alterations using the 'Ca POT. 2¿ indicator arsenazo III that is sensitive to low concentrations of that ion. Citosolic free 'Ca POT. 2¿ concentration changes were accompanied through fluorescence confocal microscopy, using the fluorescent 'Ca POT. 2¿ indicator, indo-1. In the presence of 20¿mu¿M free 'Ca POT. 2¿ protoplasts were practically inactive for the uptake of that ion, since the low external 'Ca POT. 2¿ concentration did not generate a enough gradient able to impel the entrance of the ion inside of the cell. However, when 'Ca POT. 2¿ was removed from the medium through the EGTA addition, the 'Ca POT. 2¿ efflux was stimulated by calmodulin antagonists such as trifluoperazin (TFP), chlorpromazin (CP) and calmidazolium, in a dose-dependent manner. The efficiency in which the different calmodulin antagonists induced the 'Ca POT. 2¿ efflux from the C. sinensis protoplasts indicated that this process resulted from an unspecific effect in the protoplast membrane and not due to an anti-calmodulin action ...Note: The complete abstract is available with the full electronic digital thesis or dissertations Mestrado Biologia Vegetal Mestre em Ciências Biológicas