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Objective: GBM (glioblastoma multiforme) is the most common and devastating primary tumor in central nervous system. The patient with GBM has an exceptionally poor prognosis. Heterogeneous and invasive nature of GBM makes it impossible to be cured by current treatment. GBM is also characterized by cellular metabolism reprogramming and TME (tumour microenvironment) acidification as well as intratumoral hypoxia. CAIX (carbonic anhydrase IX) is overexpressed in GBM but not in normal brain tissue. The characteristics of specific expression, hypoxia inducible, high catalytic activity and extracellular membrane location of CAIX are hypothesized to make it an important factor to mediate the extrusion of intracellular hydrogen ions into the extracellular space for TME acidification followed by the enhanced invasion of GBM cells. The expression of CAIX and invasion of GBM cells are also demonstrated to be enhanced under hypoxia. Therefore, CAIX is supposed to be a specific target for GBM cell invasion especially under hypoxia. The purpose of this study is to investigate the role of CAIX on GBM cell invasion under hypoxia. Methods: The role of CAIX was investigated in vitro by using two established GBM cell lines, two mesenchymal and two proneural BTICs (brain tumour initiating cells). They were cultured in DMEM and RHB-A stem cell medium, respectively. The DMEM of 4.5g/L glucose was used because it had the same glucose concentration as RHB-A. Various hypoxia induction methods and two cell harvesting methods were examined first to optimize the experimental procedure. Low confluence and Wortmannin inhibition experiments were performed to test the influence of CAIX expression by cell culture density and PI3K (phosphoinositide 3-kinases) pathway under normoxia. Later, the expression of CAIX was examined in all six cell lines under both normoxia and hypoxia, and two single-isoform VEGFs (vascular endothelial growth factors) were also tested to validate the experimental condition of hypoxia. Cell immunofluorescence staining was performed to specifically test the expression of membrane protein CAIX under normoxia and hypoxia. Cell viability experiment was conducted by treating cells with different concentration of a specific inhibitor of extracellular carbonic anhydrases (termed U104) to find the optimized concentration and action days for invasion assay before cell death occurs. At last, cell invasion was investigated by Matrigel coated Transwell chamber and with or without CAIX inhibitor under normoxia and hypoxia. Results: Gassing nitrogen up to the medium in T75 flask directly was the best way for hypoxia induction. Accutase/Trypsin method was superior to scraper method for cell harvest in this study. All cell lines expressed very low mRNA and baseline protein of CAIX under various confluence states and normoxia apart from the high expression of CAIX mRNA in U87 under high confluence culture. CAIX could be downregulated by PI3K inhibitor Wortmannin in most cell lines under normoxia. Results of normoxia and hypoxia experiment showed increased mRNA expression of CAIX/VEGF165/VEGF121 in all 6 cell lines after 24-hour sustained hypoxia. Experimental results also showed significantly increased protein expression of CAIX in two established cell lines, mildly increased expression in BTIC13/17/18 and no significant change in BTIC12 under 24-hour sustained hypoxia. Cell immunofluorescence staining illustrated that all GBM cell lines had a baseline expression of CAIX protein under normoxia, as well as increased protein expression in established cell lines and BTICs respectively to various degrees under hypoxia. Cell viability experiment revealed a dose and exposure time dependent toxic effect of U104 in all cell lines. Hypoxia increased cell viability only in specific cell lines (U87 and BTIC13) and experimental conditions. U87 and BTIC18 were less sensitive to U104 in comparing with other cell lines. Matrigel coated Transwell assay for cell invasion presented high heterogeneity between cell lines and in identical experimental condition of same cell line. All cell lines showed reduced invasion ability after serial passages. Hypoxia increased cell invasion only in specific cell lines (U87 and BTIC12) and experimental conditions. No obvious morphological changes of invaded cells could be observed between different treatment groups as well as normoxia and hypoxia in same cell line under optical microscope. Mesenchymal BTICs showed much higher invasion ability than other cell lines. CAIX inhibitor U104 reduced invasion only in mesenchymal BTICs. Conclusions: Most GBM cell lines are regulated by PI3K pathway rather than cell confluence for the baseline expression of CAIX under normoxia on transcription and translation levels. The expression of CAIX mRNA is strongly induced by hypoxia in all cell lines. While the protein expression of CAIX is significantly induced by hypoxia only in established cell lines, this may attribute to the protein stability post-transcriptionally. U104 may be used as a targeted drug for treatment of GBM cells. The inhibition of CAIX is also a potential metabolic target for the invasion repression of GBM cells but only in mesenchymal BTICs., Einführung: Das Glioblastoma (GBM) ist der häufigste und bösartigste Primärtumor im zentralen Nervensystem. Patienten mit einem GBM haben eine außergewöhnlich schlechte Prognose. Die heterogene und invasive Natur des GBM macht eine Heilung durch die derzeitige Behandlung unmöglich. GBM ist außerdem durch eine Reprogrammierung des zellulären Stoffwechsels, einer Ansäuerung des Tumor Microenvironments (TME) sowie einer intratumoralen Hypoxie gekennzeichnet. Die Carboanhydrase IX (CAIX) ist in GBM überexprimiert, nicht aber in normalem Hirngewebe. Es wird angenommen, dass die spezifischen Eigenschaften der CAIX, nämlich der tumor-spezifischen Expression, der hohen katalytischen Aktivität sowie der extrazellulären Membranlokalisation dieses Enzym zu einem wichtigen Faktor machen, der die Extrusion von intrazellulären Wasserstoffionen in den extrazellulären Raum für die TME-Azidifizierung vermittelt, was zu einer verstärkten Invasion von GBM-Zellen führen könnte. Die Expression von CAIX und die Invasion von GBM-Zellen sind unter Hypoxie nachweislich erhöht. Daher wird hypothetisiert, dass CAIX ein spezifisches Ziel für die Invasion von GBM-Zellen insbesondere unter Hypoxie darstellen kann. Das Ziel dieser Studie ist es, die Rolle von CAIX auf die GBM-Zellinvasion unter Hypoxie zu untersuchen. Methoden: Die Rolle von CAIX wurde in vitro untersucht, indem zwei etablierte GBM-Zelllinien, zwei mesenchymale und zwei proneurale BTICs (brain tumour initiating cells), verwendet wurden. Sie wurden in DMEM bzw. RHB-A Stammzellmedium kultiviert. Das DMEM mit 4,5g/L Glukose wurde verwendet, weil dies die identische Glukosekonzentration im Vergleich zu RHB-A darstellt. Zur Optimierung des Versuchsablaufs wurden zunächst verschiedene Hypoxie-Induktionsmethoden und zwei Methoden zur Zellernte untersucht. Experimente mit niedriger Konfluenz und Wortmannin-Inhibition wurden durchgeführt, um den Einfluss der CAIX-Expression durch die Zellkulturdichte und den PI3K (Phosphoinositid-3-Kinasen)-Signalweg unter Normoxie zu testen. Anschliessend wurde die Expression von CAIX in allen sechs Zelllinien sowohl unter Normoxie als auch unter Hypoxie untersucht, als Vergleich wurden zwei Isoformen von VEGF (Vascular Endothelial Growth Factor) ebenfalls getestet, um die experimentelle Bedingung der Hypoxie zu validieren. Zell-Immunfluoreszenzfärbung wurde durchgeführt, um die Expression des membranständigen Proteins CAIX unter Normoxie und Hypoxie spezifisch zu testen. Das Zellviabilitätsexperiment wurde durchgeführt, indem die Zellen mit verschiedenen Konzentrationen eines spezifischen Inhibitors der extrazellulären Carboanhydrasen (U104) behandelt wurden, um die optimale Konzentration und die Einwirkungstage für den Invasionstest zu finden, bevor der Zelltod eintritt. Schließlich wurde die Zellinvasion in einer mit Matrigel beschichteten Transwell-Kammer und mit oder ohne CAIX-Inhibitor unter Normoxie und Hypoxie untersucht. Ergebnisse: Die direkte Zugabe von reinem Stickstoff in das Medium in T75-Flaschen war die beste Methode zur Hypoxie-Induktion. Die Accutase/Trypsin-Methode war der Scraper-Methode zur Zellernte in dieser Studie überlegen. Alle Zelllinien exprimierten sehr geringe mRNA und Basisprotein von CAIX unter verschiedenen Konfluenzzuständen und Normoxie, mit Ausnahme der hohen Expression von CAIX mRNA in U87 unter Hochkonfluenzkultur. CAIX konnte durch den PI3K-Inhibitor Wortmannin in den meisten Zelllinien unter Normoxie herunterreguliert werden. Die Ergebnisse der Normoxie- und Hypoxie-Experimente zeigten eine erhöhte mRNA-Expression von CAIX/VEGF165/VEGF121 in allen 6 Zelllinien nach 24 Stunden anhaltender Hypoxie. Die experimentellen Ergebnisse zeigten auch eine signifikant erhöhte Proteinexpression von CAIX in zwei etablierten Zelllinien, eine leicht erhöhte Expression in BTIC13/17/18 und keine signifikante Veränderung in BTIC12 unter 24-stündiger anhaltender Hypoxie. Die Zell-Immunfluoreszenz-Färbung zeigte, dass alle GBM-Zelllinien eine Grundexpression des CAIX-Proteins unter Normoxie hatten, sowie eine erhöhte Proteinexpression in etablierten Zelllinien bzw. BTICs in unterschiedlichem Ausmaß unter Hypoxie. Das Zellviabilitätsexperiment zeigte eine dosis- und expositionszeitabhängige toxische Wirkung von U104 in allen Zelllinien. Hypoxie erhöhte die Zellviabilität nur bei bestimmten Zelllinien (U87 und BTIC13) und experimentellen Bedingungen. U87 und BTIC18 waren im Vergleich zu den anderen Zelllinien weniger empfindlich gegenüber U104. Der Matrigel-beschichtete Transwell-Assay für die Zellinvasion zeigte eine hohe Heterogenität zwischen den Zelllinien und bei identischen experimentellen Bedingungen derselben Zelllinie. Alle Zelllinien zeigten eine reduzierte Invasionsfähigkeit nach seriellen Passagen. Hypoxie erhöhte die Zellinvasion nur bei bestimmten Zelllinien (U87 und BTIC12) und experimentellen Bedingungen. Unter dem Lichtmikroskop konnten keine offensichtlichen morphologischen Veränderungen der invadierten Zellen zwischen verschiedenen Behandlungsgruppen sowie Normoxie und Hypoxie in derselben Zelllinie beobachtet werden. Mesenchymale BTICs zeigten eine viel höhere Invasionsfähigkeit als andere Zelllinien. Der CAIX-Inhibitor U104 reduzierte die Invasion nur bei mesenchymalen BTICs. Schlussfolgerungen: Die meisten GBM-Zelllinien werden durch den PI3K-Signalweg reguliert und nicht durch die Zellkonfluenz für die Grundexpression von CAIX unter Normoxie auf Transkriptions- und Translationsebene. Die Expression von CAIX mRNA wird durch Hypoxie in allen Zelllinien stark induziert. Während die Proteinexpression von CAIX nur in etablierten Zelllinien durch Hypoxie signifikant induziert wird, könnte dies auf die posttranslationale Stabilisierung des Proteins hinweisen. U104 könnte als gezielte Substanz zur Behandlung des GBM eingesetzt werden, da die Inhibition von CAIX ein metabolisches Ziel bei der Inhibition von GBM Invasion darstellen könnte, jedoch primär bei mesenchymal differenzierten Tumoren.

OBJECTIVE Malignant gliomas metabolize glucose preferably by glycolysis which is in accordance with the Warburg effect. This induces a high demand of glucose combined with a significant lactic acid load. The hypoxia-inducible carbonic anhydrase (CA) IX has been shown to moderate the extrusion of hydrogen ions into the extracellular space. Since the acidification of the extracellular environment contributes to host tissue invasion due to activation of proteolytic enzymes, we hypothesized that CA IX plays an important role in malignant glioma Recently, specific small molecule inhibitors of this enzyme have been developed and may provide an innovative strategy for anti – invasive treatment. METHODS Two established and 4 primary GBM cell lines (2 with mesenchymal and 2 with proneural transcriptional profile) were exposed to the CAIX inhibitor U104 under normoxic and hypoxic conditions. Cell toxicity was measured by ATP and crystal violet assay. For invasion assessment, a matrigel invasion chamber system with 8 µm pore size polycarbonate filter was used. CAIX expression was analyzed by quantitative RTPCR and Western Blot. RESULTS Hypoxia significantly induced CAIX expression in all cell lines. Invasiveness increased significantly under hypoxic conditions in the mesenchymal cells (p < 0.01). Regardless of oxygenation status, the mesenchymal group displayed significantly higher invasiveness compared to the proneural group (p = 0.006). Looking at all cell lines, invasion is significantly inhibited by U104, both under normoxic and hypoxic conditions (p < 0.01). However, while the mesenchymal group showed the highest susceptibility to CAIX inhibition followed by the proneurally differentiated group, the established cell lines were entirely refractory to CAIX inhibition. CONCLUSION Our data demonstrate that CAIX inhibition can effectively inhibit invasion in malignant glioma cells independent from oxygenation status, however the effects are significantly influenced by cell type specific biological features.

The photoelectric performance of CCD is an important project, the test of it is the key technology to realize precision remote sensing. The CCD gain is a required parameter, which can be used to calculate the quantum efficiency, account the dynamic range and so on. The traditional gain test methods at present are the photon transfer curve method and the Fe55 method, the former is more popular because of its simple test equipment. This paper derives the gain test principle based on the photon transfer curve method, analyses the mathematical relationship between the shot noise and the gain, suggests the limitation of the traditional single pixel statistical method, and proposes a new method to calculate the temporal noise based on uniformity correction. In addition, this paper also builds the gain testing system for CCD, and obtains two sets of experimental data using the two methods, the test data indicates that there is a good agreement with the manufacturer’s value, the traditional method has 0.94% difference, while the new method has 1.96% difference, which guarantees the accuracy and availability of the new method.