Search

Talin (herein referring to the talin-1 form), is a cytoskeletal adapter protein that binds integrin receptors and F-actin, and is a key factor in the formation and regulation of integrin-dependent cell-matrix adhesions. Talin forms the mechanical link between the cytoplasmic domain of integrins and the actin cytoskeleton. Through this linkage, talin is at the origin of mechanosignaling occurring at the plasma membrane-cytoskeleton interface. Despite its central position, talin is not able to fulfill its tasks alone, but requires help from kindlin and paxillin to detect and transform the mechanical tension along the integrin-talin-F-actin axis into intracellular signaling. The talin head forms a classical FERM domain, which is required to bind and regulate the conformation of the integrin receptor, as well as to induce intracellular force sensing. The FERM domain allows the strategic positioning of protein-protein and protein-lipid interfaces, including the membrane-binding and integrin affinityregulating F1 loop, as well as the interaction with lipid-anchored Rap1 (Rap1a and Rap1b in mammals) GTPase. Here, we summarize the structural and regulatory features of talin and explain how it regulates cell adhesion and force transmission, as well as intracellular signaling at integrin-containing cell-matrix attachment sites. publishedVersion

Kaikkiin eläviin organismeihin ja niitä muodostaviin yksittäisiin soluihin kohdistuu jatkuvasti erilaisia mekaanisia voimia. Jotkut näistä voimista ovat ulkoisia, kuten maan painovoima tai ilmassa kulkevat ääniaallot, kun taas jotkut voimat ovat solujen itsensä tuottamia. Nykyään on selvää, että solut voivat aistia mekaanisia voimia, tai signaaleja, mekanotransduktioksi kutsutun prosessin avulla. Mekaanisten signaalien tiedetäänkin säätelevän useita keskeisiä solubiologian prosesseja, kuten solujen kasvua ja erilaistumista. Tästä huolimatta useimmat mekaanisia voimia aistivat solun rakenteet eli mekanosensorit ovat edelleen varsin huonosti tunnettuja. Taliini on solun ja soluväliaineen välisten adheesioiden keskeinen rakenneproteiini. Taliini yhdistää adheesioreseptori integriinit solun aktiinitukirankaan, minkä lisäksi taliinin on osoitettu toimivan yhtenä solun mekanosensoreista. Tässä väitöskirjassa esitellyissä tutkimuksissa selvitettiin niitä mekanismeja, joiden avulla taliini osallistuu mekaanisten voimien aistimiseen soluissa. Havaitsimme, että taliinin R3 alayksikön rakenteellinen kestävyys säätelee sen signalointiaktiivisuutta solussa, mikä heijastuu edelleen muun muassa solun voimantuoton ja solumigraation säätelyyn. Lisäksi näytimme, että taliinin R8 alayksikön aukilaskostuminen säätelee sen vuorovaikutusta Deleted in liver cancer-1-proteiinin kanssa, muodostaen näin aiemmin tuntemattoman voimasäädellyn solun signalointikytkimen. Lisäksi tutkimme taliinin tehtäviä adheesion rakenneproteiinina ja mekanosensorina hyödyntämällä rakenteeltaan ja toiminnaltaan muokattuja taliiniproteiinin muotoja. Näiden työkalujen avulla havaitsimme, että sekä mekaanisten voimien välittäminen että taliinin aukilaskostuminen säätelevät adheesiodynamiikkaa ja solun signalointia. Nämä tulokset osoittavat, että taliinivälitteinen mekaanisten voimien aistiminen tapahtuu soluissa useilla rinnakkaisilla ja toisiaan täydentävillä mekanismeilla. Työn viimeisessä osassa tutkimme taliini- ja vinkuliinigeenien ilmentymistä ateroskleroottisissa plakeissa. Havaitsimme, että taliinin alentunut ilmentyminen on yleinen piirre ateroskleroottisissa plakeissa ja voi osaltaan vaikuttaa taudin etenemiseen. Lisäksi konfokaalimikroskopian avulla havaitsimme taliinin ilmentymisen olevan erityisen alhaista plakin tunica intimassa, mikä saattaa vähentää plakin mekaanista kestävyyttä ja altistaa sen repeämiselle. All living organisms, and the cells they are composed of, are constantly subjected to a variety of mechanical forces. Some of these forces are external, such as the gravity of the Earth or sound waves transmitted through the air, while some forces are generated by the cells themselves. It is now acknowledged that all cells can sense mechanical forces, or signals, through a process called mechanotransduction. Accordingly, mechanical signals are known to regulate many cellular processes, including growth, proliferation and differentiation. However, many of the molecular mechanisms sensing these ubiquitous cellular signals are still poorly understood. Talin is a central scaffold protein in integrin-mediated cell adhesions. Talin connects integrin adhesion receptors to the actin cytoskeleton and functions as a cellular mechanosensor. In the work presented here, we investigated the mechanisms mediating talin mechanosensing in cell-matrix adhesions. By modulating the structural and functional properties of talin R3 and R8 subdomains we were able to investigate the mechanisms by which talin rod domain unfolding regulates different cellular functions. We found that the mechanical stability of the R3 subdomain determines its activity in the regulation of many downstream processes, such as traction force generation and cell migration. In addition, we demonstrated that the force-regulated unfolding of the R8 subdomain regulates its interactions with Deleted in liver cancer-1 (DLC1) protein, and they thus constitute a novel force-regulated signaling switch in adhesion complexes. Furthermore, by designing modified talin forms with altered structural properties we dissected the roles of the talin rod domain as a structural scaffold and as a regulator of adhesion signaling. We found that both talin mechanotransmission and mechanotransduction contribute to the regulation of adhesion dynamics and phosphotyrosine signaling. The results presented in here demonstrate that talin mechanosensing is a robust process mediated by multiple parallel mechanisms. In the last part of this work we investigated the expression levels of talin and vinculin transcripts in atherosclerotic plaques. We found that decreased talin and vinculin expression is a general feature of atherosclerotic plaques and may contribute to the progression of the disease. Furthermore, confocal microscope imaging revealed a loss of talin expression in the plaque tunica intima, which may compromise the mechanical stability of the plaque and make it susceptible to rupture.

Tutkielman tausta ja tavoitteet: Faagiseulonta on proteiinikirjastojen seulonnassa käytetty menetelmä, jonka avulla proteiineja ja peptidejä voidaan valikoida niiden ligandinsitomiskyvyn tai muiden biokemiallisten ominaisuuksien perusteella. Faagien epäspesifinen sitoutuminen ja faagien epätasaisen eluoitumisen aiheuttama vääristymä saattavat kuitenkin estää erittäin korkealla affiniteetilla ligandiinsa sitoutuvien proteiinien seulonnan. Tämän tutkimuksen tarkoituksena oli arvioida seitsemän erilaisen faagiseulontamenetelmän soveltuvuutta DNA:n sekoituksella valmistettujen avidiinimutanttien seulontaan. Materiaalit ja menetelmät: DNA:n sekoituksella valmistettuja AVD/AVR2, AVD/BBP-A ja AVR2/BBP-A kirjastoja seulottiin 3 - 5 kertaa erilaisilla faagiseulontamenetelmillä. Kaikissa testatuissa menetelmissä käytettiin disulfidisidoksen sisältävää biotiinikonjugaattia, joka mahdollistaa biotiiniin sitoutuneiden faagien ei-selektiivisen eluoimisen DTT-käsittelyn avulla. Lisäksi erilaisia apuaineita ja esikäsittelyjä testattiin faagien epäspesifisen sitoutumisen vähentämiseksi. Faagiseulonnassa rikastuneiden avidiiniproteiinien ominaisuuksia tutkittiin faagi-ELISA-menetelmällä ja avidiinimutanttien dissosiaationopeusvakioiden vertailun mahdollistavalla testillä. Tulokset: Tässä työssä kuvattujen uusien faagiseulontamenetelmien käyttäminen johti joidenkin aikaisemmin tuntemattomien avidiinimutanttien rikastumiseen. Alustavissa toiminnallisuutta arvioivissa tutkimuksissa monet näistä mutanteista dissosioituivat suhteellisen hitaasti alustaan sidotusta biotiinista. Toisaalta esimerkiksi villityypin avidiinia, AVR2:ta tai BBP-A:ta esittelevien faagien rikastumista ei havaittu. Lisäksi tässä työssä kehitetty kuoppalevymenetelmä osoittautui tehokkaaksi ja toistettavaksi menetelmäksi avidiinimutanttien valikointiin niiden dissosiaationopeuksien perusteella. Johtopäätökset: Muokattuja faagiseulontamenetelmiä käytettiin tässä työssä onnistuneesti uusien, ominaisuuksiltaan lupaavien avidiinimutanttien seulonnassa. Erittäin tiukasti biotiiniin sitoutuvien avidiinimutanttien rikastumista ei kuitenkaan havaittu, mikä saattaa johtua faagien epäspesifisestä sitoutumisesta ja erilaisia avidiinimutantteja esittelevien faagien erilaisista tuottotasoista bakteerisoluissa. Tästä huolimatta tässä työssä esitetyt menetelmät ja tulokset antavat vankan pohjan avidiinimutanttien faagiseulonnassa käytettyjen menetelmien kehittämiselle. Asiasanat:Faagiseulonta, avidiini, AVR2, BBP-A, D-biotiini, DNA:n sekoitus

Light is well established for control of bond breakage, but not for control of specific bond formation in complex environments. We previously engineered diffusion-limited reactivity of SpyTag003 peptide with its protein partner SpyCatcher003 through spontaneous transamidation. This system enables precise and irreversible assembly of biological building blocks, with applications from biomaterials to vaccines. Here, we establish a system for rapid control of this amide bond formation with visible light. We have generated a caged SpyCatcher003, which allows light triggering of covalent bond formation to SpyTag003 in mammalian cells. Photocaging is achieved through site-specific incorporation of an unnatural coumarin-lysine at the reactive site of SpyCatcher003. We showed uniform specific reaction in cell lysate upon light activation. We then used the spatiotemporal precision of a 405 nm confocal laser for uncaging in seconds, probing the earliest events in mechanotransduction by talin, the key force sensor between the cytoskeleton and extracellular matrix. Reconstituting talin induced rapid biphasic extension of lamellipodia, revealing the kinetics of talin-regulated cell spreading and polarization. Thereafter we determined the hierarchy of recruitment of key components for cell adhesion. Precise control over site-specific protein reaction with visible light creates diverse opportunities for cell biology and nanoassembly.